专利名称：运动机能相关基因epo荧光检测试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明涉及一种运动机能相关基因EPO荧光检测试剂盒及检测方法，属于生物检测技术领域。
背景技术：
随着人类基因组计划的完成，后基因组计划的全面展开，以基因工程为主导的生物技术在体育运动问题领域的应用得到广泛的关注。基因遗传工程应用于运动员选材是历史必然、大势所趋，它必将从根本上引起运动选材理论和方法的革命。运用遗传学的理论和方法进行运动选材已经有了初步进展。促红细胞生成素(EPO)基因作用于红骨髄造血干细胞，促使干细胞分裂、分化，生成红细胞的过程称为“促红细胞生成”，这是机体产生新生红细胞的唯一途径。EPO对人体生理作用是这样的重要，以至于20年前就把它作为第一个造血因子来克隆用于临床治疗。重组人促红细胞生成素(EPO)已为人们所熟知。也就是把人体红细胞生成素基因转移到动物细胞中，増加了其体内的血红细胞数量和促红细胞生成素浓度。EPO能通过增加人的最大摄氧量而增加人的有氧耐力，可见是医学技术促进了把EPO作为兴奋剂用于有氧耐カ型项目。可以大大増加人体血红细胞的变异基因现在已经找到。人类在低氧环境下产生的适应性生理性变化存在明显个体差异性。有报道指出，在模拟海抜2800m低氧暴露24h血清促红细胞生成素浓度变化存在明显的不同(-41% — 400%)。部分长跑选手进行低氧训练研究发现，训练后最大摄氧量(V02max)的变化从-3. 2到18. 7ml/(min · kg)不等。EPO能促进红细胞释放进入血液，最終减轻低氧对机体的损伤，因此EPO基因序列多态性可能与不同个体间对低氧适应性具有差异性。针对位于人类EPO基因全序列第3541bp处，在EPO基因3 ‘端增强子上，ー个T/G单核苷酸多态性，即SNP/T3541G的研究表明，在EPO基因T3541G位点的三种基因型TT型、TG型、GG型中，携帯T等位基因的人群低氧适应能力较GG型更强。目前常用的基因检测方法有直接测序(direct sequencing, DS)、连接酶检测反应(ligase detection reaction, LDR)、限制性片段长度多态性分析(restrictionfragment length polymorphism, RFLP)> 变性高效液相色谱分析(denaturing highperformance liquid chromotography,DHPLC)、定量PCR。这些方法都存在不同的缺陷，例如操作繁琐、结果不易判读、重复性差、假阴性假阳性多等问题。采用荧光标记技术、毛细管电泳技术，通过带不同荧光标记物的引物对运动机能相关基因EPO特异性的扩增，而后经毛细管电泳后分析PCR产物出峰情况，即可实现对该运动机能相关基因位点的检测，灵敏度高、判读清晰准确、采样方便。
发明内容
本发明目的是提供一种运动机能相关基因EPO荧光检测试剂盒及检测方法。本发明所述的检测运动机能相关基因EPO荧光检测试剂盒，包括扩增试剂和扩增后的基因分型用试剂；所述扩增前试剂包括PCR缓冲液、MgCl2, dNTPs的混合物，Taq酶，引物混合物以及超纯水；所述扩增后试剂包括内标和用于基因分型的基因分型标准物；使用所述的试剂盒进行PCR扩增反应的条件PCR扩增体系的pH值为8. 0-9. 0，镁离子浓度为I. 5-3. 5mM，4种dNTP的终浓度各为200-300 μ Μ, Taq酶的用量为O. 1-0. 4U/μ L，引物终浓度为O. 2-0. 4 μ M0用于EPO基因检测的引物为 SEQ NO. I :5’ -CAT CAG CCG AAG AGA CCA AAG Α-3，；SEQ NO. 2 :5’ -GTAAGCC TAC GCT GGT CAA TAA GGT GG-3’SEQ NO. 3 :5’ -GCC TAC GCT GGT CAA TAA GGT GT-3，；所述的引物中SEQ NO. I的5’端进行荧光染料标记，内标所用的荧光染料为不同
的荧光素。所述扩增采用聚合酶链式反应来实现，采用多道或单道毛细管电泳进行检測。采用所述试剂盒应用于运动机能相关基因检测的方法，是通过荧光引物PCR及毛细管电泳特异性检测运动机能相关基因EPO ;用于EPO检测的引物为SEQ NO. USEQ NO. 2、SEQ NO. 3，所述基因的扩增采用聚合酶链式反应来实现，采用多道或单道毛细管电泳进行检测。其中所检测的人基因组DNA为使用Chelex法、磁珠提取法或酚/氯仿抽提法对来源样本进行处理得到的DNA ;所述的来源样本为来源于人类的滤纸片血斑/ 口腔拭子样本、FTA卡血斑/ 口腔拭子样本、口腔拭子样本、血液。使用所述的试剂盒进行PCR扩增时，扩增阶段反应在任何型号的PCR仪上进行，扩增程序:94-980C l-5min ;26_32 个循环的 94-98°C 15_60s，55-65 °C 15_60s，72°C 15_60s ；60 °C 30-60min。本发明的有益效果如下本发明以EPO基因为检测对象，通过PCR扩增，毛细管电泳检测，与基因分型标准物的对比，即可进行基因分型，筛选出具有特定基因型的个体，为体育选材提供參考。在体育选材方面首次采用了荧光标记技术、毛细管电泳技术实现对运动机能相关基因的高灵敏度特异性检测，节约了人力物力和时间。
图I是本发明的试剂盒对71-2号样本EPO基因DNA扩增后的分型结果图；图2是本发明的试剂盒对73-4号样本EPO基因DNA扩增后的分型结果图；图3是本发明的试剂盒对83号样本EPO基因DNA扩增后的分型结果图。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明做进ー步描述。实施例I本发明的试剂盒检测40个不同个体的DNA样本。用于运动机能相关基因检测的引物采用蓝色荧光染料标记，内标采用红色荧光染料标记。I、待测样本40份，下文列举的是不同基因型个体3份的結果。相关样本都已经使用“DNA提取-PCR扩增-测序”的技术方法对EPO进行过测序检測。其中，71_2号、73_4号、83号样本的分型结果依次为T/G、T/T、G/G。2、检材的基因组DNA提取Chelex提取法剪下I 3mm血斑置于I. 5mL离心管中，加入SdH2OlmL,振荡离心，弃上清液，重复步骤两次，弃上清液，将5%Chelex-100震荡悬浮后快速用剪掉的枪头吸取200 μ L加入离心管中，振荡数秒，。于56°C水浴保温30min后，振荡数秒。95°C沸水浴IOmin,轻微振荡数秒。2000rpm离心5min,上清中为提取的DNA。3、扩增和扩增产物的检测分析3. IPCR 扩增体系
权利要求
1.一种运动机能相关基因EPO荧光检测试剂盒，其特征在于包括DNA聚合酶及其缓冲溶液、扩增各基因的引物、内标及基因分型标准物。
2.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于 用于EPO基因检测的引物为SEQ NO. I :5’ -CAT CAG CCG AAG AGA CCA AAG A-3’SEQ NO. 2 :5’ -GTAAGCC TAC GCT GGT CAA TAA GGT GG-3’SEQ NO. 3 :5’ -GCC TAC GCT GGT CAA TAA GGT GT-3’。
3.根据权利要求I或2所述的试剂盒，其特征在于所述的用于EPO基因扩增的引物，其中，引物SEQ NO. I的5’端进行荧光染料标记，内标选用不同于上述的荧光染料标记。
4.根据权利要求I或2所述的试剂盒，其特征在于所述EPO基因的扩增采用聚合酶链式反应来实现，采用多道或单道毛细管电泳进行检测。
5.一种采用权利要求I所述试剂盒应用于运动机能相关基因检测的方法，其特征在于通过荧光引物PCR及毛细管电泳特异性检测运动机能相关基因EPO ;用于EPO检测的引物为SEQ NO. USEQ NO. 2,SEQ NO. 3，所述基因的扩增采用聚合酶链式反应来实现，采用多道或单道毛细管电泳进行检测。
全文摘要
本发明公开了一种运动机能相关基因EPO荧光检测试剂盒及检测方法，属于生物检测技术领域。该试剂盒包括扩增前试剂和扩增后试剂；所述扩增前试剂包括PCR缓冲液、MgCl2和dNTPs的反应混合物，Taq酶，超纯水，高特异性扩增EPO基因热点突变的引物混合物；所述扩增后试剂包括基因分型标准物和内标。本发明以上述基因为检测对象，通过PCR扩增，毛细管电泳检测，与基因分型标准物的对比，即可进行基因分型，筛选出具有特定基因型的个体，为体育选材提供参考。在体育选材方面首次采用了荧光标记技术、毛细管电泳技术实现对运动机能相关基因的高灵敏度特异性检测，节约了人力物力和时间。
文档编号C12Q1/68GK102816853SQ20121031561
公开日2012年12月12日 申请日期2012年8月30日 优先权日2012年8月30日
发明者步迅, 夏子芳 申请人:山东百福基因科技有限公司, 步迅, 夏子芳, 田雪文, 张全芳