专利名称：短链脱氢酶cpe基因、编码酶、载体、重组工程菌及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种短链脱氢酶及应用，特别涉及短链脱氢酶CPE基因、编码酶、载体、重组工程菌及在不对称还原羰基化合物中的应用。
背景技术：
β羟基酯是医药、农药、材料及其它精细化工原料的重要组成部分，如4-氯-3-羟基丁酸乙酯(CHBE)，是一种重要的有机合成的中间体，分子中有三个功能基团(-0Η，-Cl，-C00H)，可经由氯的置换反应，还原反应等，引入多种药物中间体。其手性单体(R/S)-CHBE都是非常有前景的手性物质。R-CHBE可以作为合成L-肉毒碱，(_)_大内酰亚胺A，R- Y -氨基-β -羟基丁酸的关键中间体，还可以转化为负霉素。(S) -4-氯-3-羟基丁酸乙酯，可用于合成HGM-CoA还原酶抑制剂(他汀类药物，2007年全球销售额达到160亿美金)和β -I, 4- 二氢吡啶类钙离子通道阻断剂等药物，具有重要的应用价值和广阔的市场。·目前以4-氯乙酰乙酸乙酯为原材料来制备CHBE主要有化学法(手性钌催化剂还原法)和生物催化法两种方法。化学不对称合成方法采用手性催化剂如2，2’ - 二联苯膦基-I, I，-联萘钌配合物(2,2，-bos (dipHenylpHospHino) -I, I，-binapHthyl rutheniumcomplex)作为不对称还原催化剂，该方法反应条件苛刻，需使用高压氢，对反应器要求较高；反应须在高温下进行，能耗比较高；所用的含铑或钌的催化剂价格昂贵且不易获得，因此成本较高；同时由于以金属为催化剂，使得很多制备的药物中金属含量超标，达不到安全使用的标准，无形中增加了生产成本。生物催化法在制备高对映体过量的手性化合物方面具有效率高、成本低、装置简单、对环境污染小等优势，近年来受到广泛关注。生物不对称还原方法利用可以还原4-氯乙酰乙酸乙酯的重组酶，例如短链脱氢酶，酮还原酶等来不对称还原得到手性的4-氯-3-羟基丁酸乙酯。微生物是羰基还原酶和醇脱氢酶的好来源，大量的文献报道了微生物来源的酶法制备手性CHBE的情况。19 9 0 年 Shimizu S 等人(Microbial asymmetric reductiono f ethy I 4-chIorο-3— ο Xobutanoate to optically active ethyl4-chloro-3-hydroxybutanoate. Biotechnology Lett, 1990, 12(8) : 593-596)用微生物菌体进行COBE的还原反应生成(S)-CHBE，产率为85%，光学纯度91% e. e.。同年，Sakayu S等人(Stereoselective reduction of ethyl4-chloro-3_oxobutanoate by a microbialaldethde reductase in an organic solvent-water dipHasic system. Appl EnvironMicrobiol, 1990，56(8) :2374-2377)用能同时表达乙醛还原酶和葡萄糖脱氢酶基因的大肠杆菌转化细胞作为催化剂，在有机溶剂-水(乙酸正丁酯-水50mL/50mL)两相体系中催化反应，50小时后，(R)-CHBE的摩尔转化率为62. 5%，e. e.值为92. 2%。1999 年 Yasohara 等(Synthesis of optically active ethyl4-chloro-3-hydroxybutanoate by microbial reduction. Appl Microbiol Biotechnol, 1999，51:847-851)在葡萄糖存在下从200株酵母菌中筛选到了 13株有COBE还原为(S)-CHBE能力的菌株，但所得到的结果并不理想，产率低，还原的立体选择性不高且随培养条件而改变。于是考察在水/乙酸正丁酯的双相体系中用细胞丙酮干粉进行还原反应，发现Candida magnoliae在葡萄糖、NADP和⑶H的水/乙酸正丁酯的双相体系中可还原90g/L的(S)-CHBE。当细胞经热处理后,还原的立体选择性增加到99% e. e.。2001 年 Saratani Y 等人报道(Stereose I ect i ve reduct ionof ethyl4-chloro-3-oxobutanoate by fungi.Biosci BiotechnolBiotechem，2001，65(7) : 1676-1679)从4个属的具有(S)-对映体还原能力的8个真菌中，筛选出了一株高产率、高光学活性的菌株IF0318555。用其制备的无细胞提取物和细胞丙酮干粉进行COBE的还原转化，得到了 99% e.e.的理想结果，但摩尔转化率仅为64%。并证实在IF0318555中至少有两个或多个NADPH的氧化还原酶可将COBE还原为高e. e.的
(S)-型对映体，而(R)-型选择酶几乎不存在。
Kizaki 等人(Synthesis of opticalIy pure ethyl (s) -4-chloro-3-hydroxybutanoate by Escherichia coli transformant cells coexpressingthe carbonyl reductase and glucose dehydrogenase genes.Appl Microbiolbrotechnol, 2001, 55:590-595.)将基因工程的方法用于(S)-CHBE的生产研究。他们用同时表达Candida magnoliae的羰基还原酶(SI)和Bacillus megtertum的葡萄糖脱氢酶(GDH)基因的大肠杆菌细胞，在有机溶剂/水的双相体系中进行反应，有机相中(S)-CHBE积浓度可达430g/L，克分子产量为85%。在水的单相体系中，通过连续添加C0BE，该菌种可累积(S)-CHBE达208g/L。这两种情况下，(S)-CHBE的光学纯度均为100%e. e.。许多专利也报道了 COBE还原CHBE菌株的筛选。如US5413921筛选的Alternariasolam IF07516 可将 COBE 还原为(S)-CHBE，产率 98. 3%(约 9. 5g/L)，光学纯度 97%e. e.。US5559030从几十株酵母菌、细菌、乳酸细菌中筛选出的LactobaciIIus所得(S)-对映体的浓度为10mg/mL，光学纯度99. 0%e. e. ；US5700670和US5891685也在其专利中列举了大量能够用于制备光学活性的CHBE的微生物，并列举了其所属的种类。国内这方面的研究起步较晚，浙江大学蒋群等(4-氯乙酰乙酸乙酯不对称生物还原反应的研究.第二届生物化工学术会议论文集(杭州)，2002:435-438)用海藻酸钙包埋法固定化面包酵母，在邻苯二甲酸二丁酯溶液中催化COBE的不对称还原，生成76%e.e.的(R)-CHBE;南昌大学陆豫等(酵母菌立体专一性还原的研究.南昌大学学报(理科版)，2000，24⑴，59-64)用COBE为底物经酵母还原得到59. 6%e. e.的(S) -CHBE ;黄和等(面包酵母催化羰基不对称还原合成手性醇的研究.生物加工过程，2004,2(2) :52-55)以COBE为模型底物考察了而包酵母对β-羰基酯中的羰基不对称还原情况，产物以(S)-CHBE为主；陕西师范大学的张敏等((s)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的不对称合成.精细化工中间体，2004, 34 (I): 33-37)同样以面包酵母为还原剂，COBE为原料，选择性的合成(s) -CHBE，反应收率为60. 5%, e. e.值为98. 5% ;西北大学的闻婕等(酵母细胞催化4-氯-乙酰乙酸乙酯的不对称还原反应.现代化工，2004, 24(4) :46-48)用酵母催化COBE生成(S)-CHBE，其产率及e. e.值分别为91. 7%和97. 8%。
发明内容
本发明目的是提供一种短链脱氢酶CPE基因、基因编码酶、载体、重组工程菌及基因编码酶在不对称还原羰基化合物中的应用，现有技术中用来催化4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)还原生成S-4-氯-3-羟基丁酸乙酯((S) -CHBE)的酮还原酶/醇脱氢酶的Km值都比较高，这就意味着，这些酶只有在底物浓度较高的情况下才能达到最大反应速度，而较高的底物浓度对酶的活力会有较大的影响。本发明将通过生物信息学和基因组发掘的手段，开发转化率和e. e.值都较高，同时Km值比较低的还原酶，即短链脱氢酶CPE，该还原酶可以在底物浓度较低的情况下保持较长时间的酶活，同时又能达到最大反应速度，尤其适合工业化流加底物连续生产的模式。本发明采用的技术方案是本发明利用生物信息学手段在NCBI基因数据库中进行筛选和分析，确定在近平滑假丝酵母(Candida parapsilosisCDC317)基因组中的假定蛋白基因 CPAR2601530 (GenBankAccession No. CCE39733. I)为脱氢/还原酶的候选研究对象，通过序列分析初步确定该基因编码的蛋白是一种短链脱氢酶(short chain dehydrogenase/reductase),命名为CPE。 因此，本发明提供一种短链脱氢酶CPE基因，所述基因的核苷酸序列为SEQ IDNo. I所示，所述短链脱氢酶CPE基因的获取方法为用酵母基因组DNA提取试剂盒从近平滑假丝酵母(Candidapara psilosisCDC317)中提取近平滑假丝酵母基因组DNA作为PCR扩增模板进行PCR扩增，PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的基因，即获得短链脱氢酶CPE基因。上游引物设计Nco I酶切位点，下游引物设计Hind III酶切位点，具体引物序列如下上游引物Pl:5，-ATATCCATGGCTCACCACCACCACCACCACATGACAGCAAAGGTTATTGTCTCTG3，。下游引物P2:5’ GCGAAGCTTCTACAATGCACCACTT TTACTCTTT3’。PCR 扩增反应条件94°C 5min ；94 °C 30s, 58 °C 40s, 72 °C lmin20s,25 个循环；72°C IOmin ;4°C恒温。所述核苷酸序列SEQ ID No. I为ATGACAGCAAAGGTTATTGTCTCTGGAGGAACAGGTTTTATTGCTCAACACATTCTCAAACAGTTATTAAACCATAATTACAATGTTGTAACCACAGTTAGATCACAAGCTAAAGGTGATCATTTATTAAAATTGTTTAATTCACCATCTAGTTTGAGCTATGAAATTGTTGAAGATGTTGGTAAACCAGGTGCATTTGATCAAGTGTTGGAAAAGAATCAAGATGCCACAGTTTTCTTGCATACGGCATCGCCATTCCATTATAAAGCTACTGATGTAGCCAAGGAATTGTTGGAGCCAGCAGTTGAAGGTACCAAGAATGCATTAAAGGCAATTCAAAAATATGGGAAAAACATCAAAAATGTTGTAATTACCTCATCTTTTGCCGCTGTTGGTTCTGCTGACAAGACTACTGATCCTAAAGTTGTGTTTACTGAACAAGATTGGAATGATATTACATGGGATGAAGCTGTAAAAAATGTTGTTAATGGATATAGAGGTTCAAAGACATTTGCTGAACGTGCAGCATGGGATTTCATCAAGGAAAATGATTCTCCTTTTAAATTGACAACGGTGAATCCTGGTTTTACATTTGGACCTCAATTGTTTACTTCAGAAATAAAAGATCAATTAAACACATCATCAGAAGTGATTAATTCAATAGTAAAGTTGAAACCAAATGATCCAATCCCAACATTCAAGGGTAATTGGATTGATGTACGTGATGTGGCAAAAGCTCATGTTGTTGCATTTGAAAACCCAAAAGCAGCTGGTCAAAGATTGATTTTAGCTGCAGGTACTTTTACTGAACAATCAATTGTTGATTTGATCAATGCCAAGTTTCCCAATTTGAATCTTCCTAAAGGTGAACCAGGTGCTGATTTAAAGATTAAAAAGGAAGGATTGGCATCAGTTGACAACTCAAAGACTAAAGAAATCTTGGGGTATGAGTTTATTGATCTTGATAAATCAGTTACTGATTCTGTGC AACAAATCTTGGATGCTAAAAAGAGTAAAAGTGGTGCATTGTAG本发明还提供一种由所述短链脱氢酶CPE基因编码的短链脱氢酶CPE。进一步，所述短链脱氢酶CPE的氨基酸序列为SEQ ID No. 2所示。所述氨基酸序列SEQ ID No. 2为MTAKVIVSGGTGFIAQHILKQLLNHNYNWTTVRSQAK ⑶ HLLKLFNSPSSLSYEIVEDVGKPGAFDQVLEKNQDATVFLHTASPFHYKATDVAKELLEPAVEGTKNALKAIQKYGKNIKNVVITSSFAAVGSADKTTDPKVVFTEQDWNDITWDEAVKNVVNGYRGSKTFAERAAWDFIKENDSPFKLTTVNPGFTFGPQLFTSEIKDQLNTSSEVINSIVKLKPNDPIPTFKGNWIDVRDVAKAHVVAFENPKAAGQRLILAAGTFTEQSIVDLINAKFPNLNLPKGEPGADLKIKKE GLASVDNSKTKEILGYEFIDLDKSVTDSVQQILDAKKSKSGAL本发明提供一种含有所述短链脱氢酶CPE基因的重组载体。进一步，所述重组载体按如下方法制备将短链脱氢酶目的基因与pET21d载体连接，获得连接产物CPE-21d重组载体，即为含有短链脱氢酶CPE基因的重组载体。将重组载体转化E. coli DH5a感受态细胞中，然后在含100mg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37°C下180r/min摇床培养lh，将培养液离心，弃部分上清，取沉淀与剩余上清混匀后涂布含有100mg/ml氨苄青霉素的LB固体平板，37°C培养箱放置16h，获得单菌落。挑取平板上的单菌落加到10 μ L灭菌水中，将单菌落混合液加到5mL含100mg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37°C、180r/min摇床培养16h，取培养液用普通质粒提取试剂盒提取CPE_21d重组质粒，即获得含有短链脱氢酶CPE基因的重组质粒。本发明还提供一种含有所述短链脱氢酶CPE基因或重组载体的重组基因工程菌。本发明提供一种所述短链脱氢酶CPE基因在制备重组短链脱氢酶CPE中的应用。进一步，所述的应用为构建含有所述短链脱氢酶CPE基因的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离纯化获得含有重组短链脱氢酶CPE的菌体细胞。更进一步，所述短链脱氢酶CPE基因在制备重组短链脱氢酶CPE中的应用为将重组质粒CPE-21d转化感受态细胞E. coli BL21(DE3)菌株，挑单菌落进行PCR验证后获得所述重组基因工程菌的单菌落，将重组基因工程菌的单菌落于含100mg/ml氨苄青霉素的LB培养基上37°C培养12h至OD6qq=O. 6，加入IPTG终浓度为0. lmmol/L，25°C诱导表达15h，将诱导培养液分离纯化，获得含重组的短链脱氢酶的菌体细胞。本发明提供一种由所述短链脱氢酶CPE基因编码的短链脱氢酶CPE在不对称还原羰基化合物中的应用，所述的应用为在PH值为6. (Γ8. O的PBS缓冲溶液中，以前手性羰基化合物为底物，以含短链脱氢酶CPE基因的重组基因工程菌发酵培养获得的含湿菌体发酵液离心，取沉淀进行超声破碎后再离心获得的上清液为催化剂，在有机溶剂、葡萄糖、葡萄糖脱氢酶和还原型辅酶NADPH的作用下，在2(T40°C进行生物转化反应，反应完全后，将反应液用乙酸乙酯萃取，取有机层用无水硫酸镁干燥，过滤，滤液即为含光学活性手性醇粗品，所述粗品经纯化获得光学活性手性醇；所述前手性羰基化合物为4-氯乙酰乙酸乙酯，所述有机溶剂为二甲基亚砜；所述短链脱氢酶CPE的酶活为2. 97U/mg，所述上清液的体积用量以含湿菌体发酵液中湿菌体的质量计为40mg/ml底物，所述葡萄糖的质量用量以底物的体积用量计为20mmol/ml，所述葡萄糖脱氢酶的酶活为10U/mg，葡萄糖脱氢酶的质量用量以底物的体积用量计为0. 05mg/ml，所述还原型辅酶NADPH的质量用量以底物的体积用量计为50mg/ml，所述有机溶剂与底物的体积比为15:1。更进一步，所述的应用为将含短链脱氢酶CPE基因的基因工程菌发酵培养获得的酶作为酶源与二甲基亚砜、pH值7. O的PBS缓冲液、pH值为7. O的10mg/ml还原型辅酶NADPH的PBS缓冲液、I. 5mol/L的葡萄糖水溶液和pH值为7. O的O. 0075mg/ml葡萄糖脱氢酶的PBS缓冲液混合，以4-氯乙酰乙酸乙酯作为底物构成反应体系，在30°C、ISOrpm条件下摇床转化反应20h，反应完全后，将反应液用乙酸乙酯萃取，取有机层用无水硫酸镁干燥，过滤，滤液即为含S-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的粗品，所述粗品经纯化得到S-4-氯-3-羟基丁酸乙酯；所述酶源来自于含短链脱氢酶CPE基因的重组基因工程菌发酵培养后获得的含湿菌体发酵液离心，取沉淀进行超声破碎后再离心获得的上清液，所述上清液的体积用量以含湿菌体发酵液中湿菌体的质量计为40mg/ml底物，所述反应体系中底物的初始体积浓度为1%，所述二甲基亚砜与底物的体积比为15 :1，PBS缓冲液与底物的体积比为40 :1、还原型辅酶NADPH的PBS缓冲液与底物的体积比为5 :1，葡萄糖水溶 液与底物的体积比为10 I，葡萄糖脱氢酶的PBS缓冲液与底物的体积比为5:1。进一步，所述酶源的获得方法为将含短链脱氢酶CPE基因的重组基因工程菌接种至含100mg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基a中，37 °C震荡培养12h后，获得培养液，将培养液以体积浓度1%的接种量接种到含100mg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基b中，37°C震荡培养至OD值为O. 6，加入IPTG至终浓度为lmmol/L，25°C诱导表达15h，将获得的诱导培养液离心，取沉淀置于PH=7. O的PBS缓冲液中超声破碎细胞IOmin后在4°C、12000rpm/min离心IOmin,取上清液，即为酶源。所述含S-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的粗品分离纯化的方法采用本领域公知的方法即可，比如高压液相分离纯化。本发明所述含100mg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基a和含100mg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基b均为含100mg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基，为便于区分不同步骤所用培养基不同而命名。与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在本发明短链脱氢酶CPE对底物的转化率和产物的e. e.值都较高，同时Km值比较低的还原酶，可以在底物浓度较低的情况下保持较长时间的酶活，在实际工业化生产中就可以减少酶的加量，降低成本；而且在加入低浓度的底物同时就可以达到最大反应速度，这样在实际工业化生产中就可以缩短单位重量产品的生产周期，减少能耗和人工成本。
图I短链脱氢酶CPE的SDS-PAGE分析图，其中泳道M为蛋白分子量标准，泳道I为诱导前菌体破碎上清，泳道2为诱导前菌体破碎沉淀，泳道3为诱导后菌体破碎上清，泳道4为诱导后菌体破碎沉淀，泳道5为纯化后的短链脱氢酶CPE ； 图2短链脱氢酶CPE的pH选择性；图3短链脱氢酶CPE的pH稳定性；图4温度对短链脱氢酶CPE活力和稳定性的影响，曲线a为温度对短链脱氢酶CPE活力的影响，曲线b为短链脱氢酶CPE热稳定性曲线；图5短链脱氢酶CPE还原产物的高效液相色谱图峰a表示溶剂，峰b表示底物COBE，峰c表示杂质1，峰d表示产物(R) -CHBE，峰e表示产物(S) -CHBE，峰f表示杂质2。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例I短链脱氢酶CPE基因、基因编码酶、载体、重组基因工程菌的制备I、材料(I)菌种和质粒
菌种近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis Q3C317)购自美国典型微生物菌种保藏中心(ATCC)，编号 MYA-4646)，质粒 pET21d 来源于 Novagen (Madison, WI, USA)，E.coli DH5a、E.coli BL21(DE3)购于北京全式金生物技术有限公司。(2)试剂pMD_19T 试剂盒、Taq 酶、dNTP mixture (单核苷酸混合物)、IPTG、high-ligation(高效连接酶)、限制性内切酶购于TAKARA公司、4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)购于AlfaAesar,酵母基因组DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、普通质粒小提试剂盒、普通DNA产物纯化试剂盒购于TIANGEN公司，Lowry法蛋白定量分析试剂盒购于Thermo公司。2、短链脱氢酶CPE基因的获得(I)模板基因组DNA的提取用酵母基因组DNA提取试剂盒从近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis⑶C317)中提取近平滑假丝酵母基因组DNA，作为目的基因的模板。(2)短链脱氢酶CPE基因的获得上游引物Pl:5’ -ATATCCATGGCTCACCACCACCACCACCACATGACAGCAAAGGTTATTGTCTCTG3’。下游引物P2:5’ GCGAAGCTTCTACAATGCA CCACTTTTACTCTTT3’。采用PCR方法进行目的基因模板片段的扩增。PCR反应体系为25 μ L，反应体系组成
基因组DNAIpL
pi I1I
A- AΜ. Ip ^ tn/
PjI ,,I
JkΛ Jkrn^
dNTPIpL
rTaq0.5μΙ...
2xGC12.5pL
H :)08uL反应条件94°C5min ；94°C 30s，58°C 40s，72°C lmin20s，25 个循环；72°C IOmin ；4°C恒温。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的基因。将回收的目的基因经PCR验证和DNA序列测序证实，得到的基因片段是目的基因 CPE 片段，与 CPAR2_601530 (GenBank 编号 No. CCE39733. I)序列相同。在 NCBI 的核酸数据库中进行比对，找到了 CPE序列中的属于短链脱氢酶(short-chain dehydrogenase/reductase, SDR)家族的保守序列及相似的二级结构模块(表I所示)，因此可以判定CPE是短链脱氢酶家族中的一员，命名为短链脱氢酶CPE基因，核苷酸序列见SEQ ID No.l所示。表ICPE和其他家族成员二级结构模块对比表
、级结构保備链隨酶(SDR) R块/I· CPE屮的位 校块茳典扭链脱IiniiIlslS CPi功能
pi—eel TGxxxGhGTGxxGhaGGGTGFIA辅__ 合位点pl+al
α3 ilhx|cp 丨HlwfiDhxxxGAFO辅酶 4 腺嚷吟坏β3+α3
合位点
p4GxhDhhhMfDEIxhMJxAAhUiHxASSM!中央 P折叠β4
Milt
a4hNhhGTxxhhchhhxGTKh活性位点a4
p5GxhhxhSShhhhxSSxxliaGVViTSSFAAVGS 性位点p5
α5￥x|AS pTJPYxxf AS|Kxxh| DHGYRGSJCxFAHxAAW p 存d6
K _ _ ]dF
p6h|KR]h|NS|x UKRfaMGPFxLxTxMPxFSt结构* ftSfefi p6
hxFGxxxl'I^; /yjnj在模块中，‘a’代表一个芳香族残基，‘c’代表带电残基，‘h’代表疏水性残基，‘P’代表一个极性残基，‘X’代表任意残基。下划线表示的是保守氨基酸位点。中括号内的表示是可变氨基酸位点。经典短链脱氢酶和拓展短链脱氢酶二级结构模块是基于 3 α，20 β -hydroxysteroid dehydrogenase (PDB 数据库编号 2hsd)和 UDP-galactose
4-epimerase (PDB数据库标号lek6)构建的。3、CPE-T克隆质粒的构建a、T载体的连接短链脱氢酶CPE目的基因与pMD-19T载体(购于TAKARA公司)连接，连接反应体系如下pMD-19T 载体 0. 8 μ L溶液I5 μ LDNA 5 μ L将连接反应体系(DNA即为步骤2获得的SEQ ID No. I所示的短链脱氢酶CPE基因，溶液I为PMD-19T载体试剂盒(购于TAKARA公司)自带的溶液I混匀后，于16°C的低温水浴中进行连接反应16h，获得连接产物CPE-T克隆载体，即为含有短链脱氢酶CPE基因的克隆载体。b、CPE-T克隆载体转化连接产物CPE-T克隆载体转化E. coli DH5 α感受态细胞中，转化步骤如下将10 μ L上述步骤a的连接产物加到50 μ L感受态细胞中，混匀后冰浴30min，然后42°C水浴中热击90s，再冰浴lmin，加入ImL含100mg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37°C下180r/min摇床培养lh,将培养液在4000r/min离心3min,弃上清800 μ L,取沉淀与剩余上清混匀后涂布含100mg/ml的LB固体培养基平板，在37°C培养箱放置16h，获得单菌落。挑取平板上的单菌落加到10 μ L灭菌水中，取I μ L进行PCR验证，将验证后剩余的目的单菌落混合液9 μ L加到5mL含100mg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37°C、180r/min摇床培养16h，取培养液用普通质粒提取试剂盒提取CPE-T克隆质粒，即获得含有短链脱氢酶CPE基因的克隆质粒。4、短链脱氢酶CPE的获取(I)表达质粒的构建利用限制性内切酶Nco I和Hind III对克隆质粒CPE-T和质粒pET21d分别进行酶切，酶切回收后的DNA片断通过粘性末端连接，连接产物转化E.coli DH5a感受态细胞， 通过PCR阳性筛选和质粒提取试剂盒获得CPE-21d表达质粒，方法如下a、双酶切与连接克隆质粒CPE-T和质粒pET21d分别进行双酶切，反应体系如下
IQxK5μΙ,
IJCA^,,T
I) Li j \ 7
€Ρ]·-'1νρ]；Γ2!(13%L
Hf/1,,1
IUi.,
Nco I3pL
Hiiui Π 3μ 反应体系混匀后，37°C水浴3h，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收克隆质粒CPE-T酶切产物，用普通DNA产物纯化试剂盒回收质粒pET21 d酶切产物，将两者在16 °C进行连接，连接反应体系如下pET21d 酶切产物 5yLCPE-T 酶切产物 5 μ LLigation High IOuL将连接反应体系混合后，在16°C反应过夜，获得连接产物CPE_21d重组载体。b、CPE-21d重组载体的转化连接产物CPE_21d重组载体转化到E. coli DH5 α感受态细胞中，步骤同CPE-T克隆载体转化操作，获得单菌落。挑取平板上的单菌落加到10 μ L灭菌水中，取I μ L进行PCR验证，取验证后剩余的目的单菌落9μ L加到5mL含100mg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37°C、180r/min摇床培养16h，最后取培养液用普通质粒小提取试剂盒提取CPE-21d重组质粒。(2)基因的表达，即短链脱氢酶CPE的获取将重组质粒CPE_21d转化感受态细胞E. coli BL21菌株，步骤同CPE-T克隆载体转化操作，获得单菌落。挑取平板上的单菌落加到10 μ L灭菌水中，取I μ L进行PCR验证，经过验证的目的单菌落剩余9 μ L加到7mL含100mg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37°C震荡培养12h后，获得培养液，取部分培养离心，分别对上清液和沉淀进行凝胶电泳分析，见图I所示，取ImL菌液(即培养液)转接到IOOmL含100mg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 °C震荡培养3h至OD值为O. 6，加入IPTG至最终浓度为lmmol/L，25°C诱导表达15h，获得的诱导培养液，取部分诱导培养液离心，分别对上清液和沉淀进行凝胶电泳分析，见图I所示。(3)表达产物的鉴定及蛋白浓度测定a、酶源的制备将步骤(2)发酵培养物(即诱导培养液)在4°C,6000rpm/min离心15min,所得沉淀O. 4g悬浮于IOmL去离子水中，4°C,6000rpm/min离心15min,弃上清、所得沉淀悬浮于IOmL PBS缓冲液(pH=7. O)中4°C、6000rpm/min离心15min,弃上清、将沉淀悬浮于IOmL PBS缓冲液(pH=7. O)中超声破碎细胞IOmin后在4°C、12000rpm/min离心lOmin，收集上清(即含重组短链脱氢酶CPE的溶液)并进行凝胶电泳分析，见图I所示，沉淀用IOmL PBS缓冲液(pH=7. O)悬浮，获得表达产物悬浮液；b、表达产物的鉴定取40 μ L上述步骤a制备的表达产物悬浮液,加入10 μ L 5 X LoadingBuffer (上样缓冲液)煮沸5min，并用15%SDS-PAGE蛋白胶进行蛋白电泳，检测目的蛋白表达，结果见图I所示，从图I看出目的蛋白得到了过量表达。C、表达产物蛋白浓度测定用Lowry法蛋白定量分析试剂盒测定上述步骤a制备的上清液的蛋白浓度,在750nm处测定吸光度值并用标准蛋白浓度公式计算出蛋白浓度值。d、表达产物蛋白纯化镍柱(规格是250 15cm)再生后，取经孔径O. 45 μ m的滤膜过滤后的步骤a制备的上清液20mL上样，4°C电脑恒温层析柜(常规陈列柜亦可，在4°C下静置即可)中孵育4h。4h后，排出柱中的液体(上样液和上清液的混合液)20mL进行凝胶电泳分析，检测上清液中目的蛋白是否被吸附上，并用咪唑终浓度分别50、150、250和500mM的上样缓冲液逐一进行梯度洗脱镍柱，分别收集洗脱液，并分别在280nm处测吸光度值，再分别取洗脱液40 μ L进行15%SDS-PAGE蛋白电泳和蛋白浓度测定。根据蛋白浓度值及蛋白电泳图的结果将含目的蛋白浓度较高的洗脱液在透析膜(截留分子量1KD)中进行透析，以pH7. O的PBS缓冲液为透析液，4°C电脑恒温层析柜中透析12h，取截留液，获得纯化的表达蛋白，即短链脱氢酶CPE，纯化结果见表2所示。经IPTG诱导后，目的蛋白在大肠杆菌宿主细胞中得到了过量表达，占菌体总蛋白的35%以上(见图I所示)，经过纯化的CPE蛋白纯度在90%以上。表2重组大肠杆菌来源的CPE的纯化
权利要求
1.一种短链脱氢酶CPE基因，其特征在于所述基因的核苷酸序列为SEQID No. I所示。
2.一种由权利要求I所述短链脱氢酶CPE基因编码的短链脱氢酶CPE。
3.如权利要求2所述短链脱氢酶CPE的氨基酸序列为SEQID No. 2所示。
4.一种含有权利要求I所述短链脱氢酶CPE基因的重组载体。
5.一种含有权利要求I或4所述短链脱氢酶CPE基因或重组载体的重组基因工程菌。
6.一种权利要求I所述短链脱氢酶CPE基因在制备重组短链脱氢酶CPE中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述的应用为构建含有所述短链脱氢酶CPE基因的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离纯化获得含有重组短链脱氢酶CPE的菌体细胞。
8.一种由权利要求I所述短链脱氢酶CPE基因编码的短链脱氢酶CPE在不对称还原羰基化合物中的应用，其特征在于所述的应用为将含有短链脱氢酶CPE基因的基因工程菌发酵培养获得的酶作为酶源与二甲基亚砜、PH值7. O的PBS缓冲液、pH值为7. O的10mg/ml还原型辅酶NADPH的PBS缓冲液、I. 5mol/L的葡萄糖水溶液和pH值为 . O的O. 0075mg/ml葡萄糖脱氢酶的PBS缓冲液混合，以4-氯乙酰乙酸乙酯作为底物构成反应体系，在30°C、ISOrpm条件下摇床转化反应20h，反应完全后，将反应液用乙酸乙酯萃取，取有机层用无水硫酸镁干燥，过滤，滤液即为含S-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的粗品，所述粗品经纯化获得S-4-氯-3-羟基丁酸乙酯；所述酶源来自于含短链脱氢酶CPE基因的重组基因工程菌发酵培养后获得的含湿菌体发酵液离心，取沉淀进行超声破碎后再离心获得的上清液，所述上清液的体积用量以含湿菌体发酵液中湿菌体的质量计为40mg/ml底物，所述反应体系中底物的初始体积浓度为1%，所述二甲基亚砜与底物的体积比为15 :1，PBS缓冲液与底物的体积比为40 I、还原型辅酶NADPH的PBS缓冲液与底物的体积比为5 :1，葡萄糖水溶液与底物的体积比为10 :1，葡萄糖脱氢酶的PBS缓冲液与底物的体积比为5:1。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述酶源的获得方法为将含短链脱氢酶CPE基因的重组基因工程菌接种至含100mg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基a中，37°C震荡培养12h后，获得培养液，将培养液以体积浓度1%的接种量接种到含100mg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基b中，37°C震荡培养至OD值为O. 6，加入IPTG至终浓度为lmmol/L，25°C诱导表达15h，将获得的诱导培养液离心，取沉淀置于pH=7. O的PBS缓冲液中超声破碎细胞IOmin后在4°C、12000rpm/min离心IOmin,取上清液，即为酶源。
全文摘要
本发明公开了一种短链脱氢酶CPE基因、基因编码酶、载体、重组工程菌及基因编码酶在不对称还原羰基化合物中的应用，本发明短链脱氢酶CPE的转化率和e.e.值都较高，同时Km值比较低的还原酶，可以在底物浓度较低的情况下保持较长时间的酶活，在实际工业化生产中就可以减少酶的加量，降低成本；而且在加入低浓度的底物同时就可以达到最大反应速度，这样在实际工业化生产中就可以缩短单位重量产品的生产周期，减少能耗和人工成本。
文档编号C12N9/02GK102827850SQ20121032003
公开日2012年12月19日 申请日期2012年8月31日 优先权日2012年8月31日
发明者殷晓浦, 谢恬, 王秋岩, 谌容, 裴晓林, 曹丹, 赵淑娟 申请人:杭州师范大学