专利名称：凝血酶的检测试剂及其检测试剂盒和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种凝血酶的检测试剂及其检测试剂盒和应用。
背景技术：
定量分析检测低丰度蛋白标志物对于疾病的预防和诊断是非常重要的。在医疗诊断和生物分析技术中，荧光分析一直是占有主导地位的技术，利用金属纳米结构可以改变荧光特性而发展的荧光检测技术是一种新兴的分析检测技术。适配体作为一种新颖的捕获试剂，可以与金属离子、代谢物、蛋白质和细胞反应，与抗体相比，它具有独特的优势，容易合成及易于化学修饰，稳定性好，无毒。适配体修饰的纳米材料将成为一种有前途的功能纳
米材料用于生命分析中。磁性纳米颗粒由于其磁性和易于被生物分子修饰的特点，作为生物分子分离平台而受到广泛的关注。目前为止，很少有同时进行分离，富集和检测蛋白质的集成平台见诸报道，磁珠/纳米银/适配体复合材料集合了磁珠的分离特性，纳米银的荧光增强特性以及适配体的识别特性，是一种新型的分析富集试剂。
发明内容
本发明所要解决的技术问题，是提供一种凝血酶的检测试剂。本发明还要解决的技术问题，是提供包含上述试剂的检测试剂盒。本发明最后要解决的技术问题，是提供上述检测试剂盒的应用。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下凝血酶的检测试剂，它包括磁珠-纳米银-适配体复合材料(简称磁珠-纳米银-适配体)以及纳米银荧光探针；其中，所述的磁珠-纳米银-适配体复合材料，以链霉亲和素修饰的磁珠为内核，表面键合适配体和生物素修饰的纳米银，其中，所述的适配体和生物素修饰的纳米银是以直径为10 30nm的纳米银球为内核，银球外表面键合有适配体分子链I和生物素分子链；其中，所述的适配体分子链I为5，-SH-AAAAAAAAAAAAAAAGGTTGGTGTGGTTGG ；其中，所述的生物素分子链为5’ -SH-AAAAA AAAAA AAAAA-生物素；所述的适配体和生物素修饰的纳米银具有能和磁性纳米粒子结合的特性以及识别蛋白质分子的特性。通过巯基的自组装在纳米银表面连接上适配体分子和生物素分子。所述的磁珠-纳米银-适配体复合材料是在链霉亲和素修饰的磁珠表面，通过链霉亲和素和生物素的相互作用，连接生物素修饰的纳米银制备而成。其中，所述的纳米银荧光探针以直径为10 30nm的纳米银球为内核，银球外表面键合有荧光分子链、适配体分子链II和掺杂分子链；其中，所述的荧光分子链为
5， -SH-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-Cy3 ；其中，所述的适配体分子链II为5，-SH-AAAAAAAGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT ；其中，所述的掺杂分子链为5， -SH-AAAAAAAAAAAAAAA。所述的纳米银荧光探针具有荧光特性且能特异性识别目标蛋白质分子。通过巯基的自组装在纳米银表面连接上荧光分子，适配体分子及掺杂分子。上述凝血酶的检测试剂的制备方法，它包括(I)磁珠-纳米银-适配体复合材料的制备方法，包括如下步骤(Ia)在冰浴条件下，将2-20mmol/L硝酸银溶液逐滴加入3-30mmol/L硼氢化钠溶液中，硝酸银与硼氢化钠的摩尔比为1: 3，不断搅拌至反应完全，然后补加硼氢化钠溶液，补加的硼氢化钠的摩尔量为上述参与反应的硼氢化钠的摩尔量的7%，继续搅拌至室温，得到纳米银溶液；(Ib)将生物素分子链和适配体分子链I按摩尔比(I 10) : (I 10)加入步骤(Ia)得到的纳米银溶液中，静置10-24小时，生物素分子链和适配体分子链I的总摩尔量与纳米银摩尔量之比为(100-1000) : I ；其中，所述的适配体分子链I，其核苷酸序列为5 ’ -AAAAAAAAAAAAAAAGGTTGGTGTGGTTGG，其 5 ’ 端由巯基修饰；其中，所述的生物素分子链，其核苷酸序列为5’ -AAAAAAAAAAAAAAA，其5’端由巯基修饰，3’端由生物素标记；(Ic)向步骤(Ib)得到的混合体系中加入IXPBS缓冲溶液，使PBS的终浓度为O. 1XPBS，静置3 10小时；(Id)向步骤(Ic)得到的混合体系中加入I 5mol/L氯化钠溶液，静置2 4小时，重复加入氯化钠溶液与静置的步骤I 4次，使氯化钠的终浓度为O. I O. 3mol/L ；(Ie)将步骤(Id)得到的混合体系静置24 72小时，取上清液；(If)将步骤(Ie)得到的上清液经离心去除上清，取沉淀加入IXPBS缓冲溶液重悬，重复离心与重悬的步骤I 4次，PBS缓冲溶液每次的加入体积为待加入的混合体系体积的O. I 5倍；最后离心得到的沉淀用I XPBSM缓冲溶液重悬即得适配体和生物素修饰的纳米银；(Ig)将步骤(If)得到的适配体和生物素修饰的纳米银溶液I. 3nmol/L与O. 25mg/ml的链霉亲和素修饰的磁珠等体积混合，置摇床中37°C反应I小时，磁分离，I XPBST清洗2 4次，最后I XPBSM重悬即得到磁珠-纳米银-适配体复合材料；(2)纳米银荧光探针的制备方法，包括如下步骤(2a)在冰浴条件下，将2-20mmol/L硝酸银溶液逐滴加入3-30mmol/L硼氢化钠溶液中，硝酸银与硼氢化钠的摩尔比为1: 3，不断搅拌至反应完全，然后补加硼氢化钠溶液，补加的硼氢化钠的摩尔量为上述参与反应的硼氢化钠的摩尔量的7%，继续搅拌至室温，得到纳米银溶液；(2b)将荧光分子链、适配体分子链II和掺杂分子链按摩尔比(I 10) : (I 10) : (2 20)加入步骤(2a)得到的纳米银溶液中，静置10-24小时，荧光分子链、适配体分子链II和掺杂分子链的总摩尔量与纳米银摩尔量之比为(100-1000) : I ；其中，所述的荧光分子链，其核苷酸序列为5’ -AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA,其5’端由巯基修饰，3’端由荧光分子Cy3标记；其中，所述的适配体分子链II，其核苷酸序列为 5，-AAAAAAAGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT，其 5 ’ 端由巯基修饰；其中，所述的掺杂分子链，其核苷酸序列为5，-AAAAAAAAAAAAAAA,其 5，端由巯基修饰；(2c)向步骤(2b)得到的混合体系中加入IXPBS缓冲溶液，使PBS的终浓度为O. 1XPBS，静置3 10小时；(2d)向步骤(2c)得到的混合体系中加入I 5mol/L氯化钠溶液，静置2 4小时，重复加入氯化钠溶液与静置的步骤I 4次，使氯化钠的终浓度为O. I O. 3mol/L ；(2e)将步骤(2d)得到的混合体系静置24 72小时，取上清液；(2f)将步骤(2e)得到的上清液经离心去除上清，取沉淀加入IXPBS缓冲溶液重悬，重复离心与重悬的步骤I 4次，PBS缓冲溶液每次的加入体积为待加入的混合体系体积的O. I 5倍；最后离心得到的沉淀用I XPBSM缓冲溶液重悬即得纳米银荧光探针。步骤(Ib)中，生物素分子链和适配体分子链I按摩尔比优选为3:1 ;静置时间优选为18小时；生物素分子链和适配体分子链I的总摩尔量与纳米银摩尔量之比为优选为288 ；步骤(Ic)和步骤(2c)中，I X PBS为包含如下物质的水溶液137mM NaCl，
2.7mMKCl, IOmM Na2HPO4. 12H20,2mM KH2PO4 ;静置时间优选为 6h。步骤(Id)和步骤(2d)中，氯化钠溶液的浓度优选为2mol/L ;氯化钠的终浓度优选为O. 2mol/L ;静置时间优选为3h。步骤(Ie)和(2e)中，静置时间优选为48h。步骤(If)和(2f)中，所述的离心条件为10000 20000rpm条件下离心10 30分钟，优选15000rpm条件下离心15分钟。所述的I XPBSM配方为I XPBS和lmmol/L MgCl20步骤(Ig)中，IXPBST配方为 IXPBS 中加入 O. 05 (v/v)%Tween_20。步骤(2b)中，荧光分子链、适配体分子链II和掺杂分子链按摩尔比优选为1:1:2;静置时间优选为18小时；荧光分子链、适配体分子链II和掺杂分子链的总摩尔量与纳米银摩尔量之比优选为288。上述凝血酶的检测试剂在制备检测凝血酶试剂中的应用。当有目标分子凝血酶存在时，由于两种适配体分子可以特异性结合凝血酶的两个结合位点，形成夹心结构磁珠-纳米银-适配体/凝血酶/纳米银探针，不同浓度的凝血酶导致不同含量的夹心结构的产生，从而产生不同的荧光信号强度。一种检测凝血酶的试剂盒，该试剂盒包含如下试剂磁珠-纳米银-适配体复合材料、纳米银荧光探针、PBS缓冲液、tween-20、凝血酶。上述检测凝血酶的试剂盒在检测凝血酶中的应用。利用检测凝血酶的试剂盒检测凝血酶含量的具体方法，依次顺序包括如下步骤(I)配制溶液磁珠-纳米银-适配体复合材料0. 25mg/ml, 2mL ；
纳米银突光探针1. 3nmol/L, 2mL ;稀释液IX PBS，IOml ；洗涤液I X PBS溶液中，按O. 05%的体积比加入tween-20溶液，50ml ；检测蛋白配制不同浓度的凝血酶标准品；(2)将磁珠-纳米银-适配体复合材料、纳米银荧光探针与凝血酶标准品等体积混合，置摇床中37V反应15分钟，磁分离，干燥后用IXPBS缓冲液稀释，IXPBS缓冲液的加入体积为磁分离后混合体系总体积的5 20% ；(3)将所得到的样品超声处理后点制在光学玻片上，I μ I/点；(4)待样品干后，用Luxscan-10K/A Microarray Scanner生物芯片扫描仪扫描，不
同浓度凝血酶标准品对应不同的荧光信号强度，得到凝血酶的标准曲线；(5)将待测样品替换步骤(2)中的凝血酶标准品，重复步骤(2)和(3)，待样品干后,用Luxscan-10K/A Microarray Scanner生物芯片扫描仪扫描,根据得到的突光信号强度和步骤(4)得到的标准曲线计算样品中凝血酶的含量。图I为磁珠-纳米银-适配体的制备以及夹心结构分析凝血酶的示意图。有益效果本发明建立了以磁性纳米粒子-纳米银-适配体复合物为分离富集载体，凝血酶为检测目标，同时修饰有适配体和荧光分子的纳米银为检测探针的新型集富集分离与检测为一体的高灵敏生物分析方法。当凝血酶浓度在O. 39ng/ml-25ng/ml，荧光信号强度与浓度具有指数关系，当凝血酶浓度在O. 39-3. 12ng/ml之间，荧光信号强度与浓度具有线性关系，检测限为78pg/ml。此方法也具有很好的特异性，其他蛋白质如人血清白蛋白，溶菌酶及人免疫球蛋白对该方法的干扰非常小。磁性纳米粒子-纳米银-适配体复合物高效的分离特性结合纳米荧光探针灵敏的检测特性，实现了对目标蛋白质凝血酶的高灵敏分离富集及检测。此外，本发明方法是一种集分离富集检测于一体的分析方法，分离材料与荧光信号分子作为一个整体直接被检测。该分析方法与其他基于适配体检测凝血酶的荧光分析方法相比，具有检测限低，分析时间短的优势。
图I为磁珠-纳米银-适配体的制备以及夹心结构分析凝血酶的示意图。图2为紫外-可见表征图。图3为扫描电镜显微镜表征图。图4对凝血酶的分析检测。图5特异性试验。图6重复性试验。
具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例I :磁珠-纳米银-适配体复合材料的制备方法。
(Ia)在冰浴条件下，将10mmol/L硝酸银溶液逐滴加入20mmol/L硼氢化钠溶液中，硝酸银与硼氢化钠的摩尔比为1: 3，不断搅拌至反应完全，然后补加硼氢化钠溶液，补加的硼氢化钠的摩尔量为上述参与反应的硼氢化钠的摩尔量的7%，继续搅拌至室温，得到纳米银溶液；(Ib)将生物素分子链和适配体分子链I按摩尔比3:1加入步骤(Ia)得到的纳米银溶液中，静置18小时，生物素分子链和适配体分子链I的总摩尔量与纳米银摩尔量之比为 288:1 ;其中，所述的适配体分子链I，其核苷酸序列为5，-AAAAAAAAAAAAAAAGGTTGGTGTGGTTGG，其 5 ’ 端由巯基修饰；其中，所述的生物素分子链，其核苷酸序列为5’ -AAAAAAAAAAAAAAA，其5’端由巯基修饰，3’端由生物素标记；(Ic)向步骤(Ib)得到的混合体系中加入IXPBS缓冲溶液(1XPBS配方137mMNaCl,2. 7mM KCl，IOmM Na2HPO4. 12H20, 2mM KH2PO4,以下相同)，使 PBS 的终浓度为O. 1XPBS，静置6小时；(Id)向步骤(Ic)得到的混合体系中加入2mol/L氯化钠溶液，静置3小时，重复加入氯化钠溶液与静置的步骤3次,使氯化钠的终浓度为O. 2mol/L ；(Ie)将步骤(Id)得到的混合体系静置48小时，取上清液；(If)将步骤(Ie)得到的上清液经离心(离心条件15000rpm条件下离心15分钟)去除上清,取沉淀加入IXPBS缓冲溶液重悬，重复离心与重悬的步骤3次，PBS缓冲溶液每次的加入体积为待加入的混合体系体积的O. 2倍；最后离心得到的沉淀用I XPBSM缓冲溶液(I XPBSM配方为I X PBS和lmmol/L MgCl2，以下相同)重悬即得适配体和生物素修饰的纳米银；(Ig)将步骤(If)得到的适配体和生物素修饰的纳米银溶液I. 3nmol/L与O. 25mg/ml的链霉亲和素修饰的磁珠等体积混合，置摇床中37°C反应I小时，磁分离，IXPBST (I XPBST配方为IXPBS中加入O. 05 (v/v) %Tween_20，以下相同)清洗3次，最后I XPBSM重悬即得到磁珠-纳米银-适配体复合材料；实施例2 :磁珠-纳米银-适配体复合材料的制备方法。(Ia)在冰浴条件下，将2mmol/L硝酸银溶液逐滴加入3mmol/L硼氢化钠溶液中，硝酸银与硼氢化钠的摩尔比为1: 3，不断搅拌至反应完全，然后补加硼氢化钠溶液，补加的硼氢化钠的摩尔量为上述参与反应的硼氢化钠的摩尔量的7%，继续搅拌至室温，得到纳米银溶液；(Ib)将生物素分子链和适配体分子链I按摩尔比1:10加入步骤(Ia)得到的纳米银溶液中，静置10小时，生物素分子链和适配体分子链I的总摩尔量与纳米银摩尔量之比为 100:1 ;其中，所述的适配体分子链I，其核苷酸序列为5 ’ -AAAAAAAAAAAAAAAGGTTGGTGTGGTTGG，其 5 ’ 端由巯基修饰；其中，所述的生物素分子链，其核苷酸序列为5’ -AAAAAAAAAAAAAAA，其5’端由巯基修饰，3’端由生物素标记；(Ic)向步骤(Ib)得到的混合体系中加入IXPBS缓冲溶液，使PBS的终浓度为O. 1XPBS，静置3小时；(Id)向步骤(Ic)得到的混合体系中加入lmol/L氯化钠溶液，静置2小时，重复加入氯化钠溶液与静置的步骤I次，使氯化钠的终浓度为O. lmol/L ；(Ie)将步骤(Id)得到的混合体系静置24小时，取上清液；(If)将步骤(Ie)得到的上清液经离心(离心条件为IOOOOrpm条件下离心30分钟)去除上清,取沉淀加入IXPBS缓冲溶液重悬，重复离心与重悬的步骤I次，PBS缓冲溶液每次的加入体积为待加入的混合体系体积的O. I倍；最后离心得到的沉淀用I XPBSM缓冲溶液重悬即得适配体和生物素修饰的纳米银；(Ig)将步骤(If)得到的适配体和生物素修饰的纳米银溶液I. 3nmol/L与
O. 25mg/ml的链霉亲和素修饰的磁珠等体积混合，置摇床中37°C反应I小时，磁分离，I XPBST清洗2次，最后I XPBSM重悬即得到磁珠-纳米银-适配体复合材料；实施例3 :磁珠-纳米银-适配体复合材料的制备方法。(Ia)在冰浴条件下，将20mmol/L硝酸银溶液逐滴加入30mmol/L硼氢化钠溶液中，硝酸银与硼氢化钠的摩尔比为1: 3，不断搅拌至反应完全，然后补加硼氢化钠溶液，补加的硼氢化钠的摩尔量为上述参与反应的硼氢化钠的摩尔量的7%，继续搅拌至室温，得到纳米银溶液；(Ib)将生物素分子链和适配体分子链I按摩尔比10:1加入步骤(Ia)得到的纳米银溶液中，静置24小时，生物素分子链和适配体分子链I的总摩尔量与纳米银摩尔量之比为 1000:1 ；其中，所述的适配体分子链I，其核苷酸序列为5 ’ -AAAAAAAAAAAAAAAGGTTGGTGTGGTTGG，其 5 ’ 端由巯基修饰；其中，所述的生物素分子链，其核苷酸序列为5’ -AAAAAAAAAAAAAAA，其5’端由巯基修饰，3’端由生物素标记；(Ic)向步骤(Ib)得到的混合体系中加入I XPBS缓冲溶液，使PBS的终浓度为O. 1XPBS，静置10小时；(Id)向步骤(Ic)得到的混合体系中加入5mol/L氯化钠溶液，静置4小时，重复加入氯化钠溶液与静置的步骤4次,使氯化钠的终浓度为O. 3mol/L ；(Ie)将步骤(Id)得到的混合体系静置72小时，取上清液；(If)将步骤(Ie)得到的上清液经离心(离心条件为20000rpm条件下离心10分钟)去除上清,取沉淀加入IXPBS缓冲溶液重悬，重复离心与重悬的步骤4次，PBS缓冲溶液每次的加入体积为待加入的混合体系体积的5倍；最后离心得到的沉淀用I XPBSM缓冲溶液重悬即得适配体和生物素修饰的纳米银；(Ig)将步骤(If)得到的适配体和生物素修饰的纳米银溶液1.3nmol/L与O. 25mg/ml的链霉亲和素修饰的磁珠等体积混合，置摇床中37°C反应I小时，磁分离，I XPBST清洗4次，最后I XPBSM重悬即得到磁珠-纳米银-适配体复合材料；实施例4 :纳米银荧光探针的制备方法。(2a)在冰浴条件下，将10mmol/L硝酸银溶液逐滴加入20mmol/L硼氢化钠溶液中，硝酸银与硼氢化钠的摩尔比为1: 3，不断搅拌至反应完全，然后补加硼氢化钠溶液，补加的硼氢化钠的摩尔量为上述参与反应的硼氢化钠的摩尔量的7%，继续搅拌至室温，得到纳米银溶液；(2b)将荧光分子链、适配体分子链II和掺杂分子链按摩尔比1:1:2加入步骤(2a)得到的纳米银溶液中，静置18小时，荧光分子链、适配体分子链II和掺杂分子链的总摩尔量与纳米银摩尔量之比为288:1 ；其中，所述的荧光分子链，其核苷酸序列为5’ -AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA，其5’端由巯基修饰，3’端由荧光分子Cy3标记；其中，所述的适配体分子链II，其核苷酸序列为5 ’ -AAAAAAAGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT，其 5 ’ 端由巯基修饰；其中，所述的掺杂分子链，其核苷酸序列为5，-AAAAAAAAAAAAAAA,其 5，端由巯基修饰；(2c)向步骤(2b)得到的混合体系中加入IXPBS缓冲溶液，使PBS的终浓度为O. 1XPBS，静置6小时；(2d)向步骤(2c)得到的混合体系中加入2mol/L氯化钠溶液，静置3小时，重复加入氯化钠溶液与静置的步骤3次,使氯化钠的终浓度为O. 2mol/L ；(2e)将步骤(2d)得到的混合体系静置48小时，取上清液；(2f)将步骤(2e)得到的上清液经离心(离心条件为15000rpm条件下离心15分钟)去除上清,取沉淀加入IXPBS缓冲溶液重悬，重复离心与重悬的步骤2次，PBS缓冲溶液每次的加入体积为待加入的混合体系体积的2倍；最后离心得到的沉淀用I XPBSM缓冲溶液重悬即得纳米银荧光探针。实施例5 :纳米银荧光探针的制备方法。(2a)在冰浴条件下，将2mmol/L硝酸银溶液逐滴加入3mmol/L硼氢化钠溶液中，硝酸银与硼氢化钠的摩尔比为1: 3，不断搅拌至反应完全，然后补加硼氢化钠溶液，补加的硼氢化钠的摩尔量为上述参与反应的硼氢化钠的摩尔量的7%，继续搅拌至室温，得到纳米银溶液；(2b)将荧光分子链、适配体分子链II和掺杂分子链按摩尔比1:10:20)加入步骤(2a)得到的纳米银溶液中，静置10小时，荧光分子链、适配体分子链II和掺杂分子链的总摩尔量与纳米银摩尔量之比为100:1 ；其中，所述的荧光分子链，其核苷酸序列为5’ -AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA，其5’端由巯基修饰，3’端由荧光分子Cy3标记；其中，所述的适配体分子链II，其核苷酸序列为5，-AAAAAAAGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT，其 5 ’ 端由巯基修饰；其中，所述的掺杂分子链，其核苷酸序列为5，-AAAAAAAAAAAAAAA,其 5，端由巯基修饰；(2c)向步骤(2b)得到的混合体系中加入IXPBS缓冲溶液，使PBS的终浓度为O. 1XPBS，静置3小时；(2d)向步骤(2c)得到的混合体系中加入lmol/L氯化钠溶液，静置2小时，重复加入氯化钠溶液与静置的步骤I次，使氯化钠的终浓度为O. lmol/L ；(2e)将步骤(2d)得到的混合体系静置24小时，取上清液；(2f)将步骤(2e)得到的上清液经离心(离心条件为IOOOOrpm条件下离心10分钟)去除上清,取沉淀加入IXPBS缓冲溶液重悬，重复离心与重悬的步骤I次，PBS缓冲溶液每次的加入体积为待加入的混合体系体积的O. I倍；最后离心得到的沉淀用I XPBSM缓冲溶液重悬即得纳米银荧光探针。实施例6 :纳米银荧光探针的制备方法。(2a)在冰浴条件下，将20mmol/L硝酸银溶液逐滴加入30mmol/L硼氢化钠溶液中，硝酸银与硼氢化钠的摩尔比为1: 3，不断搅拌至反应完全，然后补加硼氢化钠溶液，补加的硼氢化钠的摩尔量为上述参与反应的硼氢化钠的摩尔量的7%，继续搅拌至室温，得到纳米银溶液；(2b)将荧光分子链、适配体分子链II和掺杂分子链按摩尔比10:1:2加入步骤(2a)得到的纳米银溶液中，静置24小时，荧光分子链、适配体分子链II和掺杂分子链的总摩尔量与纳米银摩尔量之比为1000:1 ；其中，所述的荧光分子链，其核苷酸序列为5’ -AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA，其5’端由巯基修饰，3’端由荧光分子Cy3标记；其中，所述的适配体分子链II，其核苷酸序列为5 ’ -AAAAAAAGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT，其 5 ’ 端由巯基修饰；其中，所述的掺杂分子链，其核苷酸序列为5，-AAAAAAAAAAAAAAA,其 5，端由巯基修饰；(2c)向步骤(2b)得到的混合体系中加入IXPBS缓冲溶液，使PBS的终浓度为O. 1XPBS，静置10小时；(2d)向步骤(2c)得到的混合体系中加入5mol/L氯化钠溶液，静置4小时，重复加入氯化钠溶液与静置的步骤4次,使氯化钠的终浓度为O. 3mol/L ；(2e)将步骤(2d)得到的混合体系静置72小时，取上清液；(2f)将步骤(2e)得到的上清液经离心(离心条件为20000rpm条件下离心30分钟)去除上清,取沉淀加入IXPBS缓冲溶液重悬，重复离心与重悬的步骤4次，PBS缓冲溶液每次的加入体积为待加入的混合体系体积的5倍；最后离心得到的沉淀用I XPBSM缓冲溶液重悬即得纳米银荧光探针。实施例7 :检测凝血酶的试剂盒。一种检测凝血酶的试剂盒，该试剂盒包含如下试剂磁珠-纳米银-适配体复合材料、纳米银荧光探针、PBS缓冲液、tween-20、凝血酶。实施例8 :利用检测凝血酶的试剂盒检测凝血酶含量的方法。(I)配制溶液磁珠-纳米银-适配体复合材料0. 25mg/ml, 2mL ；纳米银突光探针1. 3nmol/L, 2mL ;稀释液IX PBS，IOml ；洗涤液I XPBS溶液中，按O. 05%的体积比加入tween-20溶液，50ml ；检测蛋白配制不同浓度的凝血酶标准品(O. 39ng/ml-25ng/ml)；(2)将磁珠-纳米银-适配体复合材料、纳米银荧光探针与凝血酶标准品等体积混合，置摇床中37V反应15分钟，磁分离，干燥后用IXPBS缓冲液稀释，IXPBS缓冲液的加入体积为磁分离后混合体系总体积的5 20% (最佳体积为8. 3%)；
(3)将所得到的样品超声处理后点制在光学玻片上，I μ I/点；(4)待样品干后，用Luxscan-10K/A Microarray Scanner生物芯片扫描仪扫描，不同浓度凝血酶标准品对应不同的荧光信号强度，得到凝血酶的标准曲线和扫描图，见图4 ；利用磁珠-纳米银-适配体及纳米银荧光探针对凝血酶进行检测，当凝血酶浓度在O. 39ng/ml-25ng/ml之间，荧光信号强度与浓度的对数值之间具有指数相关性，当凝血酶浓度在O. 39ng/ml-3. 12ng/ml之间，荧光信号强度与浓度的对数值之间具有线性相关性，线性关系好;(5)将待测样品替换步骤(2)中的凝血酶标准品，重复步骤(2)和(3)，待样品干后,用Luxscan-10K/A Microarray Scanner生物芯片扫描仪扫描,根据得到的突光信号强度和步骤(4)得到的标准曲线计算样品中凝血酶的含量。实施例9:制备方法同实施例1，所不同的是，步骤(If)得到的适配体和生物素修饰的纳米银，取200 μ I (1.3ηΜ)测紫外-可见吸收光谱得到图2-a。将200 μ I购买的链霉亲和素修饰的磁珠(O. 25mg/ml)测紫外-可见吸收光谱得到图2-b0将步骤(Ig)得到的磁珠-纳米银-适配体复合材料，取200 μ I测紫外-可见吸收光谱得到图2-c。将步骤(Ig)中磁分离得到的上清溶液，取200 μ I测紫外-可见吸收光谱得到图
2—do通过紫外可见光谱来表征磁珠-纳米银-适配体的结合程度，生物素和适配体修饰的纳米银在407. 5nm处有一尖锐的吸收峰(a)，而购买的链霉亲和素修饰的磁珠在300nm-700nm的区间内吸收峰很弱(b)，当磁珠表面通过链霉亲和素和生物素的作用连接上大量纳米银颗粒时，纳米银的吸收峰发生很大的变化，大量红移而且吸收峰下降预示着大量纳米银颗粒在磁珠表面的聚集(C)，磁分离后的磁珠-纳米银-适配体的上清没有吸收峰(d)，说明纳米银全部连接到磁珠表面，磁珠的巨大表面积可以容纳大量的纳米银颗粒。实施例10 :同实施例I的方法，所不同的是步骤(If)得到的适配体和生物素修饰的纳米银溶液，在透射电子显微镜下观察并采集图像见图3-a。步骤(Ig)得到的磁珠-纳米银-适配体，在透射电子显微镜下观察并采集图像见图3c。同实施例4的方法，所不同的是步骤(2f)得到的纳米银荧光探针，在透射电子显微镜下观察并采集图像见图
3_b ο透射电子显微镜显示生物素和适配体修饰的纳米银粒子大部分成球形粒径为17. 2±3. 4nm(采集的粒子数为102个)，纳米银荧光探针的粒径为19. I ±3. 6nm(采集的粒子数为81个)，电镜图显示大量的纳米粒子聚集在磁珠表面。实施例11 :特异性实验。
(I)配制溶液,配制凝血酶样品(20ng/ml),溶菌酶(200ng/ml),人免疫球蛋白IgG(20 μ g/ml),人血清白蛋白(20 μ g/ml)。(2)磁珠-纳米银-适配体和纳米银荧光探针分别与凝血酶、溶菌酶、人免疫球蛋白、人血清白蛋白等体积混合，置摇床中37°C反应15分钟，磁分离，干燥后用IXPBS稀释，所加的体积为原来总体积的5%-20% (最佳体积为8. 3%)(3)将所得到的样品超声处理后点制在光学玻片上，I μ I/点；(4)待样品干后，用Luxscan-10K/A Microarray Scanner生物芯片扫描仪扫描，不同样品对应不同的突光信号强度。通过研究了磁珠-纳米银-适配体及纳米银荧光探针对其它蛋白质的分析情况
(图5)，发现对其它蛋白的荧光信号远远弱于对凝血酶的荧光信号。因此此方法特异性好。实施例12 :重复性实验。(I)配制溶液，配制8份凝血酶样品(20ng/ml)。(2)磁珠-纳米银-适配体，纳米银探针与8份凝血酶等体积混合，置摇床中37°C反应15分钟,磁分离,干燥后用I XPBS稀释,所加的体积为原来总体积的5%-20% (最佳体积为8. 3%)(3)将所得到的样品超声处理后点制在光学玻片上，I μ I/点；(4)待样品干后，用Luxscan-IOK/A Microarray Scanner生物芯片扫描仪扫描，不同样品对应不同的突光信号强度。曲线b:8次数据的平均值，通过进行重复性实验，发现此方法重复性好，重复的8次实验中，只有一次的数据落偏离平均值较远，7次的数据均在10%误差范围内(图6)。证明此种方法的重现性好。
权利要求
1.凝血酶的检测试剂，其特征在于，它包括磁珠-纳米银-适配体复合材料以及纳米银荧光探针； 其中，所述的磁珠-纳米银-适配体复合材料，以链霉亲和素修饰的磁珠为内核，表面键合适配体和生物素修饰的纳米银，其中，所述的适配体和生物素修饰的纳米银是以直径为10 30nm的纳米银球为内核，银球外表面键合有适配体分子链I和生物素分子链；其中，所述的适配体分子链I为5’ -SH-AAAAAAAAAAAAAAAGGTTGGTGTGGTTGG ； 其中，所述的生物素分子链为 5，-SH-AAAAA AAAAA AAAAA-生物素； 其中，所述的纳米银荧光探针以直径为10 30nm的纳米银球为内核，银球外表面键合有荧光分子链、适配体分子链II和掺杂分子链； 其中，所述的荧光分子链为5， -SH-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-Cy3 ； 其中，所述的适配体分子链II为5’ -SH-AAAAAAAGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT ； 其中，所述的掺杂分子链为5，-SH-AAAAAAAAAAAAAAA。
2.权利要求I所述的凝血酶的检测试剂的制备方法，其特征在于，它包括 (I)磁珠-纳米银-适配体复合材料的制备方法，包括如下步骤 (Ia)在冰浴条件下，将2-20mmol/L硝酸银溶液逐滴加入3-30mmol/L硼氢化钠溶液中，硝酸银与硼氢化钠的摩尔比为1:3，不断搅拌至反应完全，然后补加硼氢化钠溶液，补加的硼氢化钠的摩尔量为上述参与反应的硼氢化钠的摩尔量的7%，继续搅拌至室温，得到纳米银溶液； (Ib)将生物素分子链和适配体分子链I按摩尔比(I 10) : (I 10)加入步骤(Ia)得到的纳米银溶液中，静置10-24小时，生物素分子链和适配体分子链I的总摩尔量与纳米银摩尔量之比为(100-1000):1 ； 其中，所述的适配体分子链I，其核苷酸序列为 5’ -AAAAAAAAAAAAAAAGGTTGGTGTGGTTGG，其 5’ 端由巯基修饰； 其中，所述的生物素分子链，其核苷酸序列为 5’ -AAAAAAAAAAAAAAA，其5’端由巯基修饰，3’端由生物素标记； (Ic)向步骤(Ib)得到的混合体系中加入I X PBS缓冲溶液，使PBS的终浓度为O.1XPBS，静置3 10小时 (Id)向步骤(Ic)得到的混合体系中加入I 5mol/L氯化钠溶液，静置2 4小时，重复加入氯化钠溶液与静置的步骤I 4次，使氯化钠的终浓度为O. I O. 3mol/L ； (Ie)将步骤(Id)得到的混合体系静置24 72小时，取上清液； (If)将步骤(Ie)得到的上清液经离心去除上清，取沉淀加入IXPBS缓冲溶液重悬，重复离心与重悬的步骤I 4次，PBS缓冲溶液每次的加入体积为待加入的混合体系体积的O. I 5倍；最后离心得到的沉淀用I XPBSM缓冲溶液重悬即得适配体和生物素修饰的纳米银；(Ig)将步骤(If)得到的适配体和生物素修饰的纳米银溶液I. 3nmol/L与O. 25mg/ml的链霉亲和素修饰的磁珠等体积混合，置摇床中37V反应I小时，磁分离，IXPBST清洗.2 4次，最后I XPBSM重悬即得到磁珠-纳米银-适配体复合材料； (2)纳米银荧光探针的制备方法，包括如下步骤 (2a)在冰浴条件下，将2-20mmol/L硝酸银溶液逐滴加入3-30mmol/L硼氢化钠溶液中，硝酸银与硼氢化钠的摩尔比为1: 3，不断搅拌至反应完全，然后补加硼氢化钠溶液，补加的硼氢化钠的摩尔量为上述参与反应的硼氢化钠的摩尔量的7%，继续搅拌至室温，得到纳米银溶液； (2b)将荧光分子链、适配体分子链II和掺杂分子链按摩尔比(I 10) : (I 10) : (2 .20)加入步骤(2a)得到的纳米银溶液中，静置10-24小时，荧光分子链、适配体分子链II和掺杂分子链的总摩尔量与纳米银摩尔量之比为(100-1000) :1 ; 其中，所述的荧光分子链，其核苷酸序列为 . 5，-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA，其5，端由巯基修饰，3，端由荧光分子Cy3标记； 其中，所述的适配体分子链II，其核苷酸序列为 .5’ -AAAAAAAGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT，其 5’ 端由巯基修饰； 其中，所述的掺杂分子链，其核苷酸序列为 .5，-AAAAAAAAAAAAAAA，其 5，端由巯基修饰； (2c)向步骤(2b)得到的混合体系中加入I X PBS缓冲溶液，使PBS的终浓度为.O.1XPBS，静置3 10小时； (2d)向步骤(2c)得到的混合体系中加入I 5mol/L氯化钠溶液，静置2 4小时，重复加入氯化钠溶液与静置的步骤I 4次，使氯化钠的终浓度为O. I O. 3mol/L ； (2e)将步骤(2d)得到的混合体系静置24 72小时，取上清液； (2f)将步骤(2e)得到的上清液经离心去除上清，取沉淀加入IXPBS缓冲溶液重悬，重复离心与重悬的步骤I 4次，PBS缓冲溶液每次的加入体积为待加入的混合体系体积的.O.I 5倍；最后离心得到的沉淀用I XPBSM缓冲溶液重悬即得纳米银荧光探针。
3.根据权利要求2所述的凝血酶的检测试剂的制备方法，其特征在于，步骤(If)和步骤(2f)中，所述的离心条件为10000 20000rpm条件下离心10 30分钟。
4.权利要求I所述的凝血酶的检测试剂在制备检测凝血酶试剂中的应用。
5.—种检测凝血酶的试剂盒,其特征在于,该试剂盒包含如下试剂磁珠-纳米银-适配体复合材料、纳米银荧光探针、PBS缓冲液、tween-20、凝血酶。
6.权利要求5所述的检测凝血酶的试剂盒在检测凝血酶中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，利用检测凝血酶的试剂盒检测凝血酶含量的具体方法，依次顺序包括如下步骤 (I)配制溶液 磁珠-纳米银-适配体复合材料0. 25mg/ml, 2mL ； 纳米银突光探针1. 3nmol/L, 2mL ； 稀释液lXPBS,10ml ； 洗涤液1 XPBS溶液中，按O. 05%的体积比加入tween-20溶液，50ml ； 检测蛋白配制不同浓度的凝血酶标准品；(2)将磁珠-纳米银-适配体复合材料、纳米银荧光探针与凝血酶标准品等体积混合，置摇床中37°C反应15分钟，磁分离，干燥后用I XPBS缓冲液稀释，IXPBS缓冲液的加入体积为磁分离后混合体系总体积的5 20% ； (3)将所得到的样品超声处理后点制在光学玻片上，Iμ I/点； (4)待样品干后,用Luxscan-10K/AMicroarray Scanner生物芯片扫描仪扫描,不同浓度凝血酶标准品对应不同的荧光信号强度，得到凝血酶的标准曲线； (5)将待测样品替换步骤(2)中的凝血酶标准品，重复步骤(2)和(3)，待样品干后，用 Luxscan-10K/A Microarray Scanner生物芯片扫描仪扫描,根据得到的突光信号强度和步骤⑷得到的标准曲线计算样品中凝血酶的含量。
全文摘要
本发明公开了凝血酶的检测试剂，它包括磁珠-纳米银-适配体复合材料以及纳米银荧光探针；其中，所述的磁珠-纳米银-适配体复合材料，以链霉亲和素修饰的磁珠为内核，表面键合适配体和生物素修饰的纳米银；所述的纳米银荧光探针以纳米银球为内核，银球外表面键合有荧光分子链、适配体分子链和掺杂分子链。本发明还公开了包含上述试剂的检测试剂盒及其应用。本发明的磁珠-纳米银-适配体复合材料具有很好的分离和富集的能力，而且适配体相对于抗体具有合成简单，易于修饰，成本低等特点。
文档编号C12Q1/56GK102796824SQ20121032130
公开日2012年11月28日 申请日期2012年9月3日 优先权日2012年9月3日
发明者许丹科, 李慧, 羌维兵 申请人:南京大学