一种具有排镉功能的植物乳杆菌及其用途的制作方法

专利名称：一种具有排镉功能的植物乳杆菌及其用途的制作方法
一种具有排镉功能的植物乳杆菌及其用途技术领域：
本发明属于微生物技术领域。更具体地，本发明涉及一种具有排镉功能的植物乳杆菌，本发明还涉及所述植物乳杆菌的用途。
背景技术：
镉是一种对人体健康极其有害的重金属，在环境中非常稳定，为已知的最易在体内蓄积的毒物。镉可溶于水，它与氧、氯、硫等元素生成无机化合物分布于自然界中，并被广泛应用于电镀、电池、合金、颜料、塑料等的各个技术领域。随着镉在工业和生活中的应用，其在水体和土壤中的含量逐年增加，继而在一些植物或动物体内蓄积(如镉污染区的大米、烟草、贝壳类海鲜、动物肝肾脏等)，最终通过食物链在人体内蓄积。镉污染情况在亚洲国家尤为严重，1955年日本爆发了震惊世界的痛痛病事件，其病因就是由于神通川水域遭受镉污染，导致居民食用的大米中镉严重超标。在中国，每年由工业废弃物排放到环境中 的镉总量约680余吨，镉已经成为水源和耕地最主要的污染源之一。中国科学院地理科学与资源研究所环境修复研究中心主任陈同斌指出，中国受镉污染的耕地达到8000万亩左右，在一些污染严重的地区，稻田有效镉含量甚至是国家允许值的26倍。2002年农业部对全国市场稻米的抽查表明10%左右的市售大米镉含量超标，2007年南京农业大学潘根兴教授和他的研究团队在全国六个地区(华东、东北、华中、西南、华南和华北)县级以上市场的抽样调查再次证明了这一结果。镉具有毒性强、潜伏期长的特点。1997年以来，美国毒性物质与疾病登记署(ATSDR)和环境保护署(EPA) —直将镉列为第六位危害人类健康的有毒物质，其对人体的危害主要涉及到骨骼、肾脏、肝脏、呼吸系统、血液系统及生殖器官，另外镉还是致癌物，在1993年即被国际抗癌联盟列为IA级致癌物。急性镉中毒导致人体出现咳嗽、胸闷、呼吸困难、恶心、呕吐及腹痛等症状，摄入大剂量镉甚至会由于急性肝损伤而导致死亡。慢性镉中毒涉及肾损伤(蛋白尿、肾结石、慢性肾衰竭)、骨损伤(骨痛、骨质疏松、骨软化、自发性骨折)、生殖器官损伤(睾丸、卵巢损伤)及癌症(肺癌、前列腺癌)。镉进入人体后生物学半衰期长达10到30年，其隐蔽性和滞后性往往容易被人忽视。对于由镉中毒引起的各种生理病症，通常使用依地酸二钠钙、二巯基丁二酸钠等螯合剂进行注射治疗，以达到排镉的目的，例如中国药典第二版(2000年)记载了依地酸二钠钙作为镉和铅等重金属中毒的解毒剂。然而，这些药物都存在着一定的毒副作用。依地酸二钠钙是一种广谱性络合剂，具有较强的肾毒性，且用药时会经尿排出大量人体不可缺少的微量元素，例如锌、铜、锰、铁等，而这些元素与很多酶的活性有关，因此大量使用依地酸二钠钙会危及人的身体健康。二巯基丁二酸钠可能导致消化系统功能紊乱，并造成头痛、恶心、四肢酸痛等症状，同时必须在摄入镉之后极短时间之内给药，否则不能得到良好的疗效(Kojima，S.，Sugimura，et. al，“Effects of dithiocarbamates on testiculartoxicity in rats caused by acute exposure to cadmium，，，((Toxicology and appliedpharmacology)), 116，24-29 (1992))。
鉴于传统治疗方法存在的多种问题，针对镉中毒寻找一种新的干预或治疗方法显得十分必要。乳酸菌是一类能够使碳水化合物发酵并产生乳酸的细菌的统称，广泛存在于自然发酵乳制品、发酵植物食品，如泡菜、酸菜、青贮饲料以及人肠道中。长期科学研究结果表明，以乳酸菌为代表的益生菌是人体必不可少的且具有重要生理功能的有益菌，其主要生理功能有防治乳糖不耐症、恢复人体肠道内菌群平衡维护人体健康、抗肿瘤和预防癌症作用、控制人体内毒素水平、保护肝脏并增强肝脏的解毒等功能。乳酸菌作为一种食品级的微生物，不像螯合剂有严重的毒副作用，且已有报道表明其在体外对镉、铅等重金属离子具有较好的吸附作用(Halttunen, T. , Collado, M. C. , et. al, “Combining strains of lacticacid bacteria may reduce their toxin and heavy metal removal efficiency fromaqueous solution”《Letters in Applied Microbiology)),46, 160-165 (2007)),因此很有潜力成为具有排镉功能的新型保健食品。目前，一些专利或专利申请文献涉及排镉保健食品及其制备方法，例如CN1336208公开了一种由脱臭大蒜粉、醋粉、冰明粉等制成的保健食品，经常食用可有效排除人体因空气、水、农药污染而累积超标的镉；CN1328845公开了一种由土茯苓、红参、三七等配方制成 的中药制剂，可有效治疗和预防镉中毒且长期服用无毒副作用。但是，目前涉及具有排镉功能的乳酸菌专利申请文件不多，例如CN101153272公开了一种伯克霍尔德氏菌J62，它对镉具有高耐受性，可应用于环境工程技术领域中促进植物生长，强化植物富集重金属镉，提高植物提取修复效率。另外，CN101252943A公开了一些植物乳杆菌，它用于促进哺乳动物吸收铁、锌、韩、镁离子。因此，筛选出一种具有对镉具有优良耐受和吸附能力的乳酸菌，并且证明它们在动物模型中具有良好的排镉作用，同时研制这些乳酸菌实际的用途就显得十分必要。本发明试图进一步地挖掘益生菌的功能，开发具有更高保健价值的乳酸菌，为利用膳食策略缓解镉中毒效应开辟出新的途径和解决方案。本发明人在总结现有技术的基础上，通过大量实验研究，终于完成了本发明。

发明内容[要解决的技术问题]本发明的目的是提供一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) CCFM8610。本发明的另一个目的是提供所述植物乳杆菌CCFM8610的用途。[技术方案]本发明是通过下述技术方案实现的。本发明涉及一种乳酸菌，利用形态特征、培养性状和生理生化特征等微生物学特性对该乳酸菌鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCFM8610,该菌株已于2012年5月3日在北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No. 6077。所述的植物乳杆菌CCFM8610具有下述性质⑴具有耐酸性，在pH3. 0-9. O环境条件下生长良好，在pH2. 5环境下存活良好；⑵在体外含镉培养基中培养，对镉离子有良好的耐受能力；⑶在体外含镉水溶液中孵育,对镉离子有良好的吸附能力；
⑷具有降低镉暴露小鼠体内镉含量和促进镉暴露小鼠通过粪便排镉的作用。本发明还涉及所述的植物乳杆菌CCFM8610在制备缓解镉中毒的药物组合物与发酵食品中的用途。根据本发明的一种优选实施方式，所述的药物组合物是由植物乳杆菌CCFM8610菌剂与在药学上可接受的载体组成的。根据本发明的另一种优选实施方式，所述的植物乳杆菌CCFM8610菌剂是将含有所述植物乳杆菌CCFM8610的菌液通过常规冷冻干燥工艺制备或其它方法制备所得到的粉齐U，它含有106CFU/g以上的活性植物乳杆菌CCFM8610。根据本发明的另一种优选实施方式，在药学上可接受的载体是一种或多种选自在药学上通常使用的填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂或矫味剂的载体。根据本发明的另一种优选实施方式，所述的药物组合物是颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液剂型。根据本发明的另一种优选实施方式，所述的发酵食品是使用含有植物乳杆菌CCFM8610囷种的发酵剂生广的乳制品、 制品与果蔬制品。根据本发明的另一种优选实施方式，所述的发酵剂是通过下述制备步骤得到的Α、培养基的制备使用以所述培养基总重量计87. 7%水将10%酶水解脱脂乳、O. 5%葡萄糖、I. 5%胰蛋白胨与O. 3%酵母浸膏溶解，然后调整其pH为6. 8，这样得到所述的培养基;B、保护剂的制备使用水与保护剂原料混合制备得到含有100g/L脱脂奶粉、30mL/L甘油、100g/L麦芽糊精、150g/L海藻糖、10g/L L-谷氨酸钠的保护剂；C、将植物乳杆菌CCFM8610菌种按照以所述培养基的重量计2_4%接种量接种到在温度110-120°C下灭菌8-12min的所述培养基中，在温度37°C下培养18h，用pH7. 2磷酸盐缓冲液清洗2-4次，用所述保护剂重悬达到浓度101(lCFU/ml ;接着，让该悬浮液在温度37°C下预培养60min，再进行冷冻干燥得到所述的发酵剂。根据本发明的另一种优选实施方式，所述的乳制品是牛奶、酸奶油或干酪；所述的豆制品是豆奶、豆豉或豆酱；所述的果蔬制品是黄瓜、胡萝卜、甜菜、芹菜或圆白菜制品。
下面将更详细地描述本发明。本发明涉及一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) CCFM8610,该菌株已于2012年5月3日在北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No. 6077。本发明人根据下述筛选标准，通过大量筛选实验与分析验证，从我国传统食品，例如泡菜，发酵奶酒中筛选出的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) CCFM8610具有下述性质⑴具有耐酸性，在pH3. 0-9. O环境条件下生长良好，在pH2. 5环境下存活良好；⑵在体外含镉培养基中培养，对镉离子有较好的耐受能力；⑶在体外含镉水溶液中孵育，对镉离子有良好的吸附能力； ⑷具有降低镉暴露小鼠体内镉含量和促进镉暴露小鼠通过粪便排镉的作用。下面将详细描述这些实验与分析认证结果。I、具有耐酸性，在pH3. 0-9. O环境条件下生长良好，在pH2. 5环境下存活良好
将冷冻保存的本发明植物乳杆菌CCFM8610分别接种于MRS培养基(例如青岛海博生物技术有限公司的产品)中，在温度37°C下培养24h，再经MRS培养液传代培养2 3次后，取ImL植物乳杆菌CCFM8610培养液，分别接种于19mL不同pH值(3. 0-9. O)的MRS液体培养基中，在温度37°C下培养24h，测定初始和培养结束后的0D_值，利用这个值测量在细菌培养液中的细胞浓度，从而估计细菌的生长情况。0D_值是采用分光光度法在波长600nm处测定的细菌培养液的吸光值，它通常用于表示在细菌培养液中细胞浓度，以确定液体培养物中细菌的生长情况。试验结果证明植物乳杆菌CCFM8610在pH3. 0-9. O的环境中生长良好，因此得以进行后续实验。采用与前面所述的同样培养方式，用1.0mLpH7. 2PBS(磷酸盐缓冲液)清洗菌体两次，再用I. OmL pH7. 2磷酸盐缓冲液重悬，其重悬乳杆菌菌体与9. OmL pH 2. 5人工胃液混合，然后在温度37°C下进行培养，分别在开始(Oh)和3h时取样，用MRS琼脂培养基浇注培养进行平板菌落计数，测定活菌数并计算其存活率。存活率是在该培养液中在第3h时的活菌数对数值与在第Oh时活菌数对数值之比，以％表示。本发明筛选存活率在80%以上 的菌株进行后续研究。实验结果表明，植物乳杆菌CCFM8610在pH2. 5的人工胃液环境中的存活率在90%以上。由此可见，植物乳杆菌CCFM8610具有耐酸性，在pH2. 5的环境下存活良好。2、在体外含镉培养基中培养，对镉离子有良好的耐受能力通过植物乳杆菌CCFM8610在不同镉含量培养基中的生长曲线可以研究其在体外对镉离子的耐受能力。在无菌条件下，向IL水中加入O. 3423g3CdS04 · 8H20,即得到浓度为150mg/L的镉离子水溶液。使用这种镉离子水溶液溶解MRS固体培养基干粉得到含150mg/L镉离子的MRS液体培养基。同样地，分别配制50mg/L、500mg/L镉离子浓度的MRS液体培养基。按照以含镉离子的MRS液体培养基重量计2%接种量将进入稳定期的植物乳杆菌CCFM8610菌液接入所述含镉离子的MRS液体培养基中。在其培养过程中，分别在0h、2h、4h、6h、8h、12h、16h、20h、24h时进行标准平板计数，从而得到如附图I所示的植物乳杆菌CCFM8610生长曲线。附图I的结果表明，本发明植物乳杆菌CCFM8610对镉离子的具有良好的耐受能力。3、在体外含镉水溶液中孵育，对镉离子有良好的吸附能力在无菌条件下，按照耐酸性(在pH3. O能够生长)的筛选标准，从我国传统食品，例如泡菜，发酵奶酒中筛选出9株乳酸菌。对这9株乳酸菌进行纯化和活化培养后，将上述菌株转移至150mg/L镉溶液中，使菌体最终浓度达到lg/L。将含有上述菌株的样品在37°C下培养Ih,使用Beckman离心机以6000r/min离心20min,再用无菌水洗漆、离心一次。分离除去上清液，向得到的菌体中加入纯硝酸，放入微波消解炉中消解20min，得到的消解液使用原子吸收光谱分析仪(Spectr AA 220，Varian，USA)测定镉离子含量，以确定各菌株对镉离子的吸附能力。这些测定结果列于附图2中。附图2清楚地表明，与其它试验菌株相比，本发明植物乳杆菌CCFM8610对镉离子的吸附量最大，因此，对镉离子具有良好的吸附能力。4、具有降低镉暴露小鼠组织内镉含量和促进镉暴露小鼠通过粪便排镉的作用。取20_25g健康雄性昆明小鼠60只，随机分为3组，每组含小鼠20只阴性对照组，镉暴露模型对照组与植物乳杆菌CCFM8610治疗组。试验第一天，阴性对照组灌胃O. 5mL普通饮用水；其余2组灌胃O. 5mL镉浓度为3. 6mg/L的硫酸镉溶液。第一次灌胃结束I小时后，阴性对照组和镉暴露模型组灌胃O. 5mL脱脂乳，植物乳杆菌CCFM8610治疗组灌喂O. 5mL按本说明书实施例3制备的浓度2. OX 109CFU/mLCCFM8610脱脂乳悬液。在第一次灌胃结束48小时后处死所有小鼠，分别取肝、肾，消化处理后采用上述原子吸收分光光度法测定组织中的镉含量。这些测定结果列于附图3中。在第一次灌胃结束后的4h，8h，12h，24h和48h分别采集小鼠的粪便，消化处理后测定粪便中的镉含量。这些测定结果列于附图4中。 通过对镉暴露模型组(仅灌胃镉)及植物乳杆菌CCFM8610组治疗组(灌胃镉后I小时灌胃CCFM8610)小鼠体内肝脏、肾脏及粪便中的镉含量的比较，发现本发明植物乳杆菌CCFM8610能够降低小鼠肝脏、肾脏、中的镉含量，并促进小鼠通过粪便将镉排出。本发明的植物乳杆菌CCFM8610具有下述生物学特性菌体特征呈革兰氏染色阳性杆状细菌，菌体约O. 9-1. 2 μ m宽，3-8 μ m长，不形成 芽孢，两端呈钝圆形，参见附图5。菌落特征在MRS培养基上形成明显的菌落，直径在O. 3-2. 3mm之间，正面形态圆形，侧面形态呈突起状，边缘整齐，乳白色，不透明，表面湿润光滑，不产生色素，参见附图6。生长特性该菌株的最低生长温度为12°C，最高生长温度为43°C，在温度30_37°C下生长最佳，最高和最低初始生长pH为9. O和2. 5，最适生长初始pH为6. O ;本发明植物乳杆菌CCFM8610菌株的延迟期相对较短，4h左右开始进入对数生长期，16h就达到稳定期。本发明植物乳杆菌保存方法所述植物乳杆菌CCFM8610原始菌种在温度_75°C下以30%重量百分数的甘油悬液形式保存，或者在温度4°C下以冷冻干燥菌粉的形式保存备用。本发明植物乳杆菌CCFM8610培养方法与培养条件在MRS培养基中在兼性厌氧条件与温度37°C的条件下培养18-36h即可使用。本发明还涉及所述的植物乳杆菌CCFM8610在制备具有排镉作用的药物组合物与发酵食品中的用途。所述的药物组合物是植物乳杆菌CCFM8610菌剂与在药学上可接受的载体组成的。根据本发明，所述的植物乳杆菌CCFM8610菌剂是采用通常的冷冻干燥制备技术将含有所述的植物乳杆菌的菌液制成的冻干粉剂，或是采用其它方法如喷雾干燥法制备得到的粉剂。所述的植物乳杆菌CCFM8610菌剂含有106CFU/mL以上的活性植物乳杆菌CCFM8610。植物乳杆菌CCFM8610含量测定方法是本技术领域的技术人员熟知的MRS平板菌落计数法。在所述的药物组合物中，所述植物乳杆菌CCFM8610菌剂的量是所述药物组合物重量的15-35%，优选地是18-32%，更优选地是20_30%。根据本发明，在药学上可接受的载体应该是指在药学领域中的常规药物载体，例如是一种或多种选自在药学上通常使用的填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂或矫味剂的载体。根据本发明，所述的填充剂应该理解是用来增加片剂重量和体积而便于压片的辅料稀释剂；或者应该理解是用以吸收原料中多余液体成分的辅料吸收剂。所述的填充剂选自淀粉、蔗糖、乳糖、硫酸钙或微晶纤维素。优选地，所述的填充剂选自淀粉、蔗糖或微晶纤维素。更优选地，所述的填充剂选自淀粉或微晶纤维素。根据本发明，所述的润湿剂应该理解是药物本身无粘性，但可润湿其药物原辅料并诱发其粘性而制成颗粒的液体。所述的润湿剂选自水、乙醇、淀粉或糖浆。
优选地，所述的润湿剂选自水、乙醇或淀粉。本发明使用润湿剂的量是以所述药物组合物总重量计O. 1-3. 0%。根据本发明，所述的粘合剂应该理解是当原料药物本身无粘性或粘性不足时，需加入粘性物质以便于制粒，这种粘性物质称为粘合剂。所述的粘合剂选自纤维素衍生物、藻酸盐、明胶或聚乙烯吡咯烷酮。优选地，所述的粘合剂选自纤维素衍生物、明胶或聚乙烯吡咯烷酮。更优选地，所述的粘合剂选自明胶或聚乙烯吡咯烷酮。本发明使用粘合剂的量是以所述药物组合物总重量计O. 5-5. 0%。根据本发明，所述的崩解剂应该理解是一种能够加入片剂中而促进其片剂在胃肠液中快速崩解成细小粒子的辅料。人们知道，片剂经过压缩后的硬度大，如果其中不含有可以促进崩解作用的辅料，它在胃肠道中崩解很慢，影响疗效。所述的崩解剂选自羧甲基淀粉钠、羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素、琼脂、碳酸钙或碳酸氢钠。优选地，所述的崩解剂选自羧甲基淀粉钠、羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素、琼脂或碳酸氢钠。更优选地，所述的崩解剂选自羧甲基淀粉钠、羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素或碳酸氢钠。本发明使用崩解剂的量是以所述药物组合物总重量计5. 0-15. 0%。根据本发明，所述的润滑剂应该理解是一种有利于提高片剂在制粒过程中的流动性，防止片剂材料粘附在制片机模子上，有利于片剂脱模的化学物质。所述的润滑剂选自滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、微粉硅胶或聚乙二醇。优选地，所述的润滑剂选自滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁或聚乙二醇。更优选地，所述的润滑剂选自滑石粉或硬脂酸钙。本发明使用润滑剂的量是以所述药物组合物总重量计O. 5-3. 0%。根据本发明，所述的矫味剂应该理解是在药品中用以改善或屏蔽药物不良气味和味道，使病人难以觉察药物强烈苦味或其它异味，例如辛辣、刺激等的药用辅料。所述的矫味剂例如选自单糖浆、蔗糖、卵磷脂、橙皮糖浆或樱桃糖浆的甜味剂；柠檬、茴香或薄荷油的芳香剂；海藻酸钠、阿拉伯胶、明胶、甲基纤维素或羧甲基纤维素钠的胶浆剂；柠檬酸、酒石酸与碳酸氢钠混合物的泡腾剂。优选地，所述的矫味剂选自单糖浆、蔗糖、橙皮糖浆或樱桃糖浆的甜味剂；柠檬或薄荷油的芳香剂；海藻酸钠、阿拉伯胶、明胶或羧甲基纤维素钠的胶浆剂；酒石酸与碳酸氢钠混合物的泡腾剂。更优选地，所述的矫味剂选自蔗糖、橙皮糖浆或樱桃糖浆的甜味剂；柠檬油芳香剂；海藻酸钠或阿拉伯胶的胶浆剂；酒石酸与碳酸氢钠混合物的泡腾剂。本发明使用矫味剂的量是以所述药物组合物总重量计O. 5%-2. 0%。本发明的植物乳杆菌CCFM8610菌剂可以与在药学上可接受的载体或赋形剂组合制成各种剂型，例如颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液，其中在药学上可接受的载体或赋形剂可以根据不同剂型进行选择，所使用的这些载体或赋形剂及其用量对于制药技术领域的普通技术人员都是容易确定的，也是显而易见的。在本发明中，采用制药技术领域的普通技术人员熟知的普遍使用的方法和设备制备本发明药物颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液。 所述的“剂型”一般应该理解是适用于人的单剂量药物形式，单个剂型含有为达到所需药量的预定活性物质，例如本发明的植物乳杆菌CCFM8610菌剂。在本发明中，所述的发酵食品是使用含有植物乳杆菌CCFM8610菌种的发酵剂生广的乳制品、 制品与果蔬制品。。所述发酵剂的制备方法如下Α、培养基的制备使用以所述培养基总重量计87. 7%水将10%酶水解脱脂乳、O. 5%葡萄糖、I. 5%胰蛋白胨与O. 3%酵母浸膏溶解，然后调整其pH为6. 8，这样得到所述的培养基;B、保护剂的制备使用水与保护剂原料制备得到含有100g/L脱脂奶粉、30mL/L甘油、100g/L麦芽糊精、150g/L海藻糖、10g/L L-谷氨酸钠的保护剂；C、植物乳杆菌CCFM8610按照以所述培养基的重量计2_4%接种量接种到在温度110-120°C下灭菌8-12min的所述培养基中，然后在温度37°C下培养18h，用pH7. 2磷酸盐缓冲液清洗2-4次，用所述保护剂重悬达到浓度101(lCFU/ml ;接着，让该悬浮液在温度37°C下预培养60min，再采用冻干法制成所述的发酵剂。所述的乳制品是牛奶、酸奶油或干酪。在本发明中，所述的牛奶应该理解是牛乳、马乳或还原乳。所述的还原乳是用以还原乳总重量计10-15%奶粉与85-90%软化水配制的。所述的奶粉是目前市场上广泛销售的
口
广BH ο所述的酸奶油是稀奶油经乳酸菌发酵制成的奶油。酸奶油比甜奶油有更多的优越性，香味更浓郁，奶油产量也更高；另外由于乳酸菌抑制了有害微生物，所以消毒杀菌后再次污染微生物的风险也较低。所述的干酪是由牛奶经发酵制成的一种营养价值很高的食品。所述的豆制品是豆奶、豆豉或豆酱。它们都是我国的传统食品或调味品。所述的果蔬制品是黄瓜、胡萝卜、甜菜、芹菜或圆白菜制品。在生产乳制品、豆制品与果蔬制品时，按照下述方法使用本发明的植物乳杆菌CCFM8610菌剂发酵剂通常，在生产乳制品、豆制品和果蔬制品的常规生产过程中，把本发明的植物乳杆菌CCFM8610菌剂发酵剂按照常规使用量接种到待处理的原料中，在能够使所述植物乳杆菌CCFM8610繁殖的温度、压力下进行发酵或存活，其代谢产物使发酵制品具有一定的酸度、香味等优异特性，同时使产品延长了保藏时间，改善了产品营养价值和消化性。[有益效果]本发明的植物乳杆菌CCFM8610具有耐酸性，在体外对镉离子有良好的耐受和吸附能力，可降低小鼠肝脏和肾脏中的镉含量，并促进小鼠通过粪便将镉排出体外。所述的植物乳杆菌CCFM8610可用于制备具有排镉功能的药物组合物与发酵食品，具有非常广泛的应用前景。

图I是植物乳杆菌CCFM8610于含起始浓度为50mg/L，150mg/L, 500mg/L的镉离子培养基中的生长曲线；图2是9株乳酸菌对镉离子的吸附情况。 其中CCFM8610, CCFM8614和CCFM8661为植物乳杆菌。CCFM8761为罗伊氏乳杆菌。CCFM8004为保加利亚乳杆菌。CCFM8602为加氏乳杆菌。LGG为鼠李糖乳杆菌。CCFM8622为两歧双歧杆菌。CCFM8147为德氏乳杆菌。图3是植物乳杆菌CCFM8610对镉暴露小鼠肝脏和肾脏中镉水平的降低作用；
a,b, c表示不同字母所代表的组别都存在显著性差异(P〈0. 05)。图4是植物乳杆菌CCFM8610促进小鼠通过粪便排镉的作用；a，b表示不同字母所代表的组别都存在显著性差异(p〈0. 05)。图5是植物乳杆菌CCFM8610的菌体形态(1000X )。图6是植物乳杆菌CCFM8610的菌落形态。
具体实施方式实施例I :植物乳杆菌CCFM8610对镉离子的耐受能力实验在无菌条件下，向IL水中加入O. 3423g 3CdS04 · 8H20，得到150mg/L的镉离子水溶液。使用这种镉离子水溶液溶解MRS培养基固体配料，得到含150mg/L镉离子的MRS液体培养基。MRS培养基是本技术领域的技术人员熟知的培养基，它含有胰蛋白胨、酵母浸膏、葡萄糖、醋酸钠、柠檬酸二铵、吐温80、硫酸镁、硫酸锰，pH 6. 2 6. 4。以与前面描述的同样方式配制含有50mg/L与500mg/L镉离子浓度的MRS液体培养基。将进入稳定期的植物乳杆菌CCFM8610按照以含镉的MRS液体培养基重量计2%接种量接种于所述的含镉MRS液体培养基中，在37 °C条件下进行培养，分别在Oh、2h、4h、6h、8h、12h、16h、20h、24h时取样，进行标准平板计数，得到如附图I所示的植物乳杆菌CCFM8610生长曲线。另外，将ImL所述的菌液接入不含镉的MRS液体培养基中，在同样条件下进行培养并计数，其结果作为空白对照结果，这些试验结果也列于附图I中。由附图I可以看出，在三个不同镉离子浓度下，植物乳杆菌CCFM8610虽然在开始时生长受到抑制，但随后其生长量迅速增加。24h时，CCFM8610在50mg/L与150mg/L镉离子浓度中的生长量已经接近了空白对照组。因此，其结果表明植物乳杆菌CCFM8610对镉离子具有良好的耐受能力。实施例2 :植物乳杆菌CCFM8610对镉离子的吸附能力实验
按照耐酸性(在pH3. O环境中能够生长)的筛选标准，从我国传统食品，例如泡菜，发酵奶酒中筛选出9株乳酸菌，将这9株乳酸菌在无菌条件下使用MRS培养基进行纯化和活化。将这些活化菌液振荡均勻，以转速6000r/min进行离心15min。得到的菌体转移到装有150mg/L镉离子浓度溶液的容器中，而空白组则转移到去离子水中。根据菌体质量确定蓝盖瓶中液体的体积，使菌体的最终浓度达到lg/L。将以上样品于温度37°C下培养lh。使用Beckman离心机以转速6000r/min离心20min,再用无菌水洗漆、离心一次。分离除去上清液，向得到的菌体中加入纯硝酸，放入微波消解炉中消解20min，得到的消解液使用本申请说明书描述的原子吸收光谱分析仪与方法测定镉离子含量，以确定不同菌株吸附镉离子的能力。其试验结果如附图2所示。由附图2可以看出，不同的菌种对镉离子的吸附能力差异较大。其中植物乳杆菌CCFM8610的吸附能力最强，可吸附10. 92mg/g镉离子，而德氏 乳杆菌CCFM8147对镉离子的吸附能力较差，只能吸附3. 22mg/g的镉离子，其吸附能力远低于本发明的植物乳杆菌CCFM8610。实施例3 :植物乳杆菌CCFM8610灌喂小鼠的耐受剂量实验将植物乳杆菌CCFM8610冻干菌粉重悬于脱脂乳中，制成浓度为2. OX 109cfu/mL的悬液。取约20g健康雄性昆明小鼠10只，每日给予该浓度悬液灌胃一次，观察一周，记录死亡和体重情况。这些试验结果列于表I中。这些结果表明，喂食浓度2. OX 109cfu/mL的植物乳杆菌CCFM8610未对小鼠造成明显影响，体重明显上升，无死亡现象产生。小鼠外观无明显病
理症状。表I :喂食浓度2. OX 109cfu/mL的植物乳杆菌CCFM8610对小鼠体重的变化情况
时间(天) I_2_3_4_5_6_7
体—I (g) 22.3土2.9 22.9±1.3 23.1±2.2 23.2±2.1 23.6±0.9 24.6±1.1 25.0土1.2 死 I -fn-------注_:小鼠无死亡实施例4 :植物乳杆菌CCFM8610对镉暴露小鼠肝脏和肾脏中镉水平的降低作用取20_25g健康雄性昆明小鼠60只，随机分为3组，每组含小鼠20只阴性对照组，镉暴露模型对照组与植物乳杆菌CCFM8610治疗组。试验第一天，阴性对照组灌胃O. 5mL普通饮用水；其余2组灌胃O. 5mL镉浓度为3. 6mg/L的硫酸镉溶液。第一次灌胃结束I小时后，阴性对照组和镉暴露模型组灌胃O. 5mL脱脂乳，植物乳杆菌CCFM8610治疗组灌喂O. 5mL按本说明书实施例3制备的浓度2. OX 109CFU/mL CCFM8610脱脂乳悬液。在第一次灌胃结束48小时后处死所有小鼠，分别取肝脏和肾脏，消化处理后采用本申请说明书描述的原子吸收分光光度法测定组织中的镉含量。这些试验结果如附图3所示。通过对镉暴露模型组(仅灌胃镉)及植物乳杆菌CCFM8610组治疗组(灌胃镉后I小时灌胃CCFM8610)小鼠体内肝脏和肾脏中的镉含量的比较可以发现，本发明的植物乳杆菌CCFM8610治疗组中小鼠肝脏和肾脏中的镉含量均比阴性对照组高，但低于镉暴露模型对照组。肝脏和肾脏是镉攻击机体的靶器官，也是镉最易在机体中蓄积的两个器官。在镉暴露后一小时内灌胃CCFM8610可使小鼠肝脏和肾脏中的镉含量明显降低，均具有显著性(P〈0. 05),这也说明植物乳杆菌CCFM8610确实具有降低镉暴露小鼠体内镉含量的作用。实施例2已经表明植物乳杆菌CCFM8610对镉离子有较强的吸附能力，CCFM8610进入机体后可能迅速吸附镉离子，从而阻止镉离子被肠道吸收进入血液和组织。实施例5 :植物乳杆菌CCFM8610促进镉暴露小鼠通过粪便排镉的作用取20_25g健康雄性昆明小鼠60只，随机分为3组，每组含小鼠20只阴性对照组，镉暴露模型对照组与植物乳杆菌CCFM8610治疗组。试验第一天，阴性对照组灌胃O. 5mL普通饮用水；其余2组灌胃O. 5mL镉浓度为3. 6mg/L的硫酸镉溶液。第一次灌胃结束I小时后，阴性对照组和镉暴露模型组灌胃O. 5mL脱脂乳，植物乳杆菌CCFM8610治疗组灌喂O. 5mL按本说明书实施例3制备的浓度2. OX 109CFU/mL CCFM8610脱脂乳悬液。在第一次灌胃结 束后的4h，8h，12h，24h和48h分别采集小鼠的粪便，消化处理后采用本申请说明书描述的原子吸收分光光度法测定粪便中的镉含量。这些试验结果如附图4所示，阴性对照组粪便中无法检测到镉，因此在图中没有显示。通过对镉暴露模型组(仅灌胃镉)及植物乳杆菌CCFM8610组治疗组(灌胃镉后I小时灌胃CCFM8610)小鼠不同时间段粪便中的镉含量比较可以发现，本发明的植物乳杆菌CCFM8610治疗组中的小鼠在8h，12h及24h粪便中的镉含量均比镉暴露模型组要高，且具有显著性(P〈0. 05)，这也说明植物乳杆菌CCFM8610确实具有促进镉暴露小鼠排镉的作用。实施例2已经表明植物乳杆菌CCFM8610对镉离子有较强的吸附能力，CCFM8610进入机体后可能迅速吸附镉离子，并通过粪便排出体外，从而达到排镉的效果。以上这些动物实验表明，本发明植物乳杆菌CCFM8610能够促进小鼠通过粪便排镉，并显著降低镉暴露小鼠组织内的镉含量。应用实施例I :利用本发明植物乳杆菌CCFM8610制造含该菌的牛乳按照下述步骤制备发酵剂A、培养基的制备使用以所述培养基总重量计87. 7%水将10%酶水解脱脂乳、O. 5%葡萄糖、I. 5%胰蛋白胨与O. 3%酵母浸膏溶解，然后调整其pH为6. 8，这样得到所述的培养基；所述的酶水解脱脂乳、葡萄糖、胰蛋白胨与酵母浸膏都是目前市场上销售的产品。B、保护剂的制备使用水与保护剂原料制备得到含有100g/L脱脂奶粉、30mL/L甘油、100g/L麦芽糊精、150g/L海藻糖、10g/L L-谷氨酸钠的保护剂。C、植物乳杆菌CCFM8610按照以所述培养基的重量计3%接种量接种到在温度110-120°C下灭菌8-12min的所述培养基中，然后在温度37°C下培养18h，用pH7. 2磷酸盐缓冲液清洗3次，用所述保护剂重悬达到浓度101(lCFU/ml ;接着，让该悬浮液在温度37°C下预培养60min，再采用冻干法制成所述的发酵剂。将原料乳脱脂奶在95°C热杀菌20min，然后冷却至4°C，再加入上述制备的植物乳杆菌CCFM8610发酵剂，使其浓度达到106CFU/ml以上，在4°C下冷藏保存，于是得到含本发明植物乳杆菌CCFM8610活菌的牛乳。应用实施例2 :利用本发明植物乳杆菌CCFM8610制造含该菌的豆奶采用软水浸泡大豆，在温度80°C下浸泡2h，再去除大豆皮。接着，浙去浸泡水，再加沸水磨浆，并在高于80°C的温度条件下保温12min。得到的浆料用150目筛网过滤，接着进行离心分离，得到的离心液即为粗豆奶，再将它加热到温度140-150°C，然后将热粗豆奶迅速导入真空冷却室进行抽真空，所述粗豆奶中的异味物质随着水蒸汽迅速排出。经过真空脱气后，将其温度降至约37°C，再接入本发明的植物乳杆菌CCFM8610工作发酵剂，使其浓度达到106CFU/ml以上，在温度4°C下冷藏保存，于是得到含本发明植物乳杆菌CCFM8610活菌的豆奶。应用实施例3 :利用本发明植物乳杆菌CCFM8610制造含该菌的果蔬饮料选用新鲜蔬菜洗净后榨汁，接着进行高温瞬间灭菌，在温度140°C下高温热杀菌2秒后，立即降温到温度约37°C，再接入本发明制备的植物乳杆菌CCFM8610菌剂发酵齐U，使其浓度达到106CFU/mL以上，在温度4°C下冷藏保存，于是得到含本发明植物乳杆菌CCFM8610活菌的果蔬饮料。应用实施例4 :制备含有本发明植物乳杆菌CCFM8610的胶囊制品
将本发明的植物乳杆菌CCFM8610在MRS培养基中培养24h，在温度4°C与4000r/min的条件下离心20min，用pH7. 2磷酸盐缓冲液冲洗两次，使用脱脂乳重悬菌体使最终菌体浓度达到2 X 101(lCFU/mL。将菌悬液加入到3重量％海藻酸钠溶液中，充分搅拌，使得细胞均匀地分散于海藻酸钠溶液中，然后将此混合液挤压到2重量％氯化钙溶液中形成胶粒，静止固化30min，过滤收集胶粒，将收集得到的胶粒进行冷冻干燥48h，得到含本发明植物乳杆菌CCFM8610的粉剂，把这种粉剂装入到在目前市场上销售的药用胶囊中，得到所述的胶囊制品。应用实施例5 :使用本发明植物乳杆菌CCFM8610制备用于生产乳制品、豆制品以及果蔬制品的发酵剂将植物乳杆菌CCFM8610按照以所述培养基重量计3%接种量接种于115°C温度下灭菌IOmin的培养基中，该培养基由以该培养基总重量计10%酶水解脱脂乳、O. 5%葡萄糖、I. 5%胰蛋白胨、O. 3%酵母浸膏和余量水组成，pH6. 8。然后，让接种植物乳杆菌CCFM8610的培养基在温度37°C下培养18h，用pH7. 2磷酸盐缓冲液清洗两次，再用保护剂重悬达到浓度1010CFU/ml。所述的保护剂含有100g/L脱脂奶粉、30mL/L甘油、100g/L麦芽糊精、150g/L海藻糖与10g/L L-谷氨酸钠。接着，让该悬浮液在温度37°C下预培养60min，再进行冷冻干燥，得到所述的乳制品、豆制品以及果蔬制品的发酵剂。应用实施例6 :利用本发明植物乳杆菌CCFM8610制备发酵乳鲜奶加糖溶解后，在温度65°C与20MPa条件下进行均质，然后在温度95°C下保温杀菌5min，再将温度降到温度35°C，加入本发明植物乳杆菌CCFM8610、商业干粉发酵剂保加利亚乳杆菌和商业干粉发酵剂嗜热链球菌组成的混合菌，它们的质量比例为1: 1: 1，所述混合菌的接种量为鲜奶重量的0. 03%，混匀，在温度35°C下保温发酵，凝乳后，在温度4°C下冷藏24h，得到所述的发酵乳。应用实施例7 :利用本发明植物乳杆菌CCFM8610制备片剂分别称取采用冷冻干燥方法制备的本发明植物乳杆菌CCFM8610菌粉制剂25. 7重量份、淀粉55. O重量份、纤维素衍生物4. 5重量份、羧甲基淀粉钠12. O重量份、滑石粉0. 8重量份、蔗糖I. O重量份与水I. O重量份，混合，采用常规方法制成湿颗粒，然后使用中南制药机械厂生产的压片机进行压片，然后使用青州市益康中药机械有限公司生产的小型药物 干燥机中进行干燥，再包装得到本发明的片剂。
权利要求
1.一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CCFM8610,该菌株已于 2012 年 5 月 3日在北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No. 6077。
2.根据权利要求I所述的植物乳杆菌CCFM8610，其特征在于它具有下述性质 ⑴具有耐酸性，在PH3. 0-9. O环境条件下生长良好，在pH2. 5环境下存活良好； (2)在体外含镉培养基中培养，对镉离子有良好的耐受能力； ⑶在体外含镉水溶液中孵育，对镉离子有良好的吸附能力； ⑷具有降低镉暴露小鼠体内镉含量和促进镉暴露小鼠通过粪便排镉的作用。
3.根据权利要求I所述的植物乳杆菌CCFM8610在制备具有排镉功能的药物组合物与发酵食品中的用途。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于所述的药物组合物是由植物乳杆菌CCFM8610菌剂与在药学上可接受的载体组成的。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于所述的植物乳杆菌CCFM8610菌剂是将含有所述植物乳杆菌CCFM8610的菌液通过常规冷冻干燥工艺制备或其它工艺制备所得到的粉齐U，它含有106CFU/g以上的活性植物乳杆菌CCFM8610。
6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于在药学上可接受的载体是一种或多种选自在药学上通常使用的填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂或矫味剂的载体。
7.根据权利要求3或4所述的用途，其特征在于所述的药物组合物是颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液剂型。
8.根据权利要求2所述的用途，其特征在于所述的发酵食品是使用含有植物乳杆菌CCFM8610囷种的发酵剂生广的乳制品、 制品与果蔬制品。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于所述的发酵剂是通过下述制备步骤得到的 Α、培养基的制备使用以所述培养基总重量计87. 7%的水将10%酶水解脱脂乳、O. 5%葡萄糖、I. 5%胰蛋白胨与O. 3%酵母浸膏溶解，然后调整其pH为6. 8，这样得到所述的培养基; B、保护剂的制备使用水与保护剂原料混合制备得到含有100g/L脱脂奶粉、30mL/L甘油、100g/L麦芽糊精、150g/L海藻糖、10g/L L-谷氨酸钠的保护剂； C、植物乳杆菌CCFM8610菌种按照以所述培养基的重量计2-4%接种量接种到在温度110-120°C下灭菌8-12min的所述培养基中，然后在温度37°C下培养18h，用pH7. 2磷酸盐缓冲液清洗2-4次，用所述的保护剂重悬达到浓度101(lCFU/ml ;接着，让该悬浮液在温度37°C下预培养60min，再进行冷冻干燥得到所述的发酵剂。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于所述的乳制品是牛奶、酸奶油或干酪；所述的豆制品是豆奶、豆豉或豆酱；所述的果蔬制品是黄瓜、胡萝卜、甜菜、芹菜或圆白菜制品O
全文摘要
本发明涉及一种具有排镉功能的植物乳杆菌及其用途。本发明的植物乳杆菌CCFM8610具有耐酸性，在体外对镉离子有良好的耐受能力和吸附能力，能降低镉暴露小鼠肝脏和肾脏中的镉含量，并具有促进镉暴露小鼠通过粪便排镉的作用。所述的植物乳杆菌CCFM8610用于具有排镉功能的药物组合物与发酵食品，具有非常广泛的应用前景。
文档编号C12R1/25GK102827796SQ20121032212
公开日2012年12月19日 申请日期2012年9月3日 优先权日2012年9月3日 公开号201210322124.发明者陈卫, 田丰伟, 翟齐啸, 王刚, 刘小鸣, 张秋香, 范大明, 赵建新, 张灏 申请人:江南大学