专利名称：一种克隆原病毒插入位点的方法
技术领域：
本发明属于生命科学和生物技术领域，具体的涉及一种以生物素-链霉亲和素为基础的纯化，采用纳米级链霉亲和素磁珠，并以补加末端腺苷的引物延伸反应，来改进克隆原病毒插入位点的方法。
背景技术：
人类基因组及大部分模式生物基因组序列的确定和利用，极大地推动了生命科学和生物技术逐渐进入功能基因组时代。随着越来越多的生物医学有机体和工业上重要物种的序列被测定，了解这些序列所携带的生命信息，以及它们是如 何影响细胞的发育、个体的健康和行为、甚至是生物的进化，是一个重要有趣且长期的工作。插入诱变方法，在很多功能基因组学的研究工作中，已经被证明是一种卓有成效的方法。在过去的十年里，我们已经见证插入诱变在探索肿瘤相关的遗传问题方面的应用，这涉及到不同方面的细胞活性调节，包括细胞周期、增殖、分化、细胞凋亡及衰老。而这一策略的成功运用，核心在于是否能够获得一种高效鉴定诱变剂插入位点的技术方法。在已开发的各种方法里，以连接介导的聚合酶链式反应(简称，LM-PCR)为基础的方法，已经被成功地应用于鉴定不同的插入诱变剂的位点中，如逆转录病毒和转座子，等。目前，已经报道了两种基于连接介导PCR的、用于分离原病毒插入位点(简称，PISs)的方法，即=SplinkBlunt-PCR和SplinkTA-PCR(STA-PCR)。这两种方法已经被用于鉴定由近交系小鼠BXH-2衍生出来的白血病细胞里存在的PISs位点。BXH-2小鼠可以在生命的早期，自发产生一种鼠白血病病毒(简称，B-MuLV)。这种BXH-2MuLV不仅可以作为一种DNA插入诱变剂引起白血病，而且可以作为一种白血病相关基因的标签，帮助人们来寻找白血病基因。所以，由BXH-2小鼠生成的白血病细胞中的遗传基因突变，可以通过分离BXH-2MuLV的PISs位点来鉴定。然而为了获得最大的PISs回收率，以往需要对每一个DNA样本同时运用两种PCR方法。这不仅需要很多繁琐的操作，而且会耗费更多常常得来不易、数量有限、宝贵的DNA样本资源。因此，设计和评估出可以用于有效研究DNA元件的PISs及其他类型的插入位点的新方法是迫切需要的。
发明内容
为克服现有技术的不足，本发明的目的，在于提供一种效率更高、更简便节约的克隆原病毒插入位点的方法。为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现—种克隆原病毒插入位点的方法,首先,提取基因组DNA为起始材料,然后,进行以腺苷为末端的引物延伸反应方案，最后，在基础的鼠基因组数据库中通过BLAST寻找比对分析得到基因组DNA序列的侧翼原病毒插入物序列；所述以腺苷为末端的引物延伸反应方案包括以下步骤
3. I)酶切，使用限制性内切酶混合物Hind III，Pvu II and Xho I (Thermo)对不同基因组DNA进行酶切，37°C孵育2 3hrs，然后，使用AxyPi^p PCR纯化试剂盒(Axygen, California, CA, USA)依照使用说明对酶切产物进行纯化；简而言之，加入3倍体积的Buffer PCR-A，混匀并转移至AxyPapTMPCR洗脱柱中，12，000 Xg离心lmin，用700μ IBuffer W2进行洗涤，然后用拖O洗脱出DNA ；3. 2)延伸;3.3)纯化，为了捕获所述延伸产物，使用链霉亲和素 包裹的磁珠和引物延伸产物混合，室温20_25°C孵育O. 5-2hrs ;所述磁珠在使用前需洗漆并重悬于2X封闭洗漆缓冲液中，所述缓冲液包含IOmMTris-HCl，pH 7. 5, ImM EDTA和2M NaCl ;然后，使用磁力架收集带有生物素的DNA片段；3.4)连接，使用T4DNA连接酶将捕获到的带有生物素的DNA连接到适量的SplinkTA上，16°C孵育16_20h ;所述SplinkTA是将等分子量的寡核苷酸splinkerette和PrimerLongTA混匀，92°C孵育2min后缓慢降温至室温20_25°C而制得；3. 5) PCR及巢式PCR，使用捕获连接的带有生物素的DNA片段，并以此作为PCR模板；首轮 PCR 是在含有 I. 5mM MgCl2、O. 2mMdNTPs、20pmol 引物 AKVp7774、20pmol 引物P-short及2. 5UTaq DNA聚合酶的反应体系中进行，其反应程序是95 °C lmin 30s ；94°C 15s，70°C 2min 40s，共 10 个循环；94°C 15s，64°C 30s, 70°C 2min 10s，共 20 个循环；最后70°C延伸IOmin ;在二轮PCR中，除了是使用首轮PCR产物作为模板并将引物替代为巢式引物AKVp8712和P-nested，所有反应成分和首轮PCR相同，其热循环参数改为95°C lmin30s -M0C 15s,70°C 2min 10s，共 11 个循环；94°C 15s,64°C 30s, 70°C lmin 45s，共 25 个循环；最后70°C延伸IOmin ;最后，使用I %琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检验。3. 6) PCR产物克隆；使用所述AxyPi^p PCR纯化试剂盒纯化第二轮PCR的产物，根据操作说明连接到pMD 19-T载体上，然后进行转化，鉴定阳性克隆并测序。进一步的，所述基因组DNA可以、但不限于通过以下方法获得步骤I)培养细胞系所述细胞系是BXH-2小鼠白血病细胞系，培养在常规的ASM培养液中并在含有5% CO2的潮湿的环境中37°C孵育；步骤2)提取基因组DNA :使用天根基因组提取试剂盒依据操作说明对收集的细胞进行基因组DNA的提取，然后溶解于超纯水中并在_30°C的温度下贮存。进一步的，所述延伸通过以下过程实现，每一个酶切的DNA均在含有I. 5mMMgC12,0. 2mM dNTPs，20pmol 生物素化的引物 Bio_AKVp7711 及 2. 5U Taq DNA polymerase的缓冲液中95°C孵育5min，然后64°C孵育30min、72°C中孵育20min ;然后将所得延伸产物用AxyPrep PCR纯化试剂盒进行纯化。优选的，步骤3. 3的纯化过程中使用纳米级链霉亲和素包裹的磁珠得到更多的特异性目的条带，表明该方法克隆PIS位点的效率更高。与现有技术相比，本发明的方法是一种高效率的、更便宜快速的用于克隆筛选PIS位点的工具，具体的说，具有以下有益效果(I)采用了 SplinkTA,它是由splinkerette变型而来,末端延伸的胸苷可以提高双链DNA的连接效率，并减少形成平末端连接产物而可能造成的错误判断。(2)纯化时用纳米级磁珠替代微米级链霉亲和素的磁珠可以产生更清晰的背景并获得更高的效率。上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。本发明的具体实施方式
由以下实施例及其附图详细给出。
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中图I为用于克隆基因组DNA侧翼序列的原病毒插入位点的APE-PCR方法的原理流程图。由一组限制性内切酶混合物(X，Y andz)对包含有原病毒基因组序列(黑框)的基因组DNA(水平线)进行酶切，且在用于首轮和第二轮PCR的引物(水平箭头)的下游没有识别位点。对酶切后的双链DNA进行变性，5’末端生物素化(实心圆圈)的原病毒序列特异性的引物退火结合到单链DNA片段上的互补区域，立即使用Taq DNA聚合酶进行引物延伸， 其合成的DNA在3’末端产生额外的腺苷(空星形)，然后将引物延伸产物连接到SplinkTA上,SplinkTA是在Splinkerette末端添加一个胸苷(实星形)变型而来的连接物(13,14)。随后将产物连接到SplinkBlunt上。用链霉亲和素包裹的磁珠对带有生物素化的DNA片段进行纯化。然后进行两轮PCR，并将PCR产物进行克隆和测序。图2是两种不同的细胞系，使用以腺苷为末端的引物延伸反应和SplinkBlunt-PCR两种方法的结果比较；其中，图2(a)为B117H，图2(b)为B139，分别是BXH2小鼠衍生的白血病样本；M DL10, 000DNA marker.白色箭头显示的是比较后多出的条带；空心圈指示的是不清晰的条带；DNA Marker的大小标注在了电泳图的右侧。图3为使用不同量的基因组DNA测定以腺苷为末端的引物延伸反应方法的敏感性；PCR产物使用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定；M1 DL1, 000DNA marker ；M2 DL1, 000DNAmarker.基因组DNA来源于B140pA细胞系；加入基因组DNA的质量由少到多分别是0. 1，O. 5,1. O, I. 5 μ g. DNA marker的大小标注在电泳图的两侧。图4为使用以腺苷为末端的引物延伸反应方法时，采用不同尺寸大小的磁珠、鉴定原病毒插入位点间的比较；基因组DNA来源于B114细胞系；M1 DL1, 000DNA marker ；M2 DLl, 000DNA marker. DNA marker的大小标注在电泳图的两侧。
具体实施例方式下面将参考附图并结合实施例，来详细说明本发明。一种克隆原病毒插入位点的方法，其包括以下步骤步骤I)培养细胞系，所述细胞系是BXH-2小鼠白血病细胞系，培养在常规的ASM培养液中并在含有5% CO2的潮湿的环境中37°C孵育；步骤2)提取基因组DNA，使用天根基因组提取试剂盒依据操作说明对收集的细胞进行基因组DNA的提取，然后溶解于超纯水中的DNA贮存在-30°C中；步骤3)进行以腺苷为末端的引物延伸反应(APE-PCR)，所述以腺苷为末端的引物延伸反应包括以下步骤3. I)酶切，使用限制性内切酶混合物Hind III，Pvu II and Xho I (Thermo)对不同基因组DNA进行酶切，37°C孵育2 3hrs ;然后，使用AXyPapTM PCR纯化试剂盒(Axygen，California, CA，USA)依照使用说明对酶切产物进行纯化；3. 2)延伸，每一个酶切的DNA均在含有L 5mM MgCl2，O. 2mMdNTPs, 20pmol生物素化的引物 Bio-AKVp7711 及 2. 5U Taq DNApolymerase 的缓冲液中 95°C孵育 5min，然后 64°C孵育30min、72°C中孵育20min ;然后将所得延伸产物用AxyPi^p PCR纯化试剂盒进行纯化；3.3)纯化，为了捕获所述延伸产物，使用链霉亲和素包裹的磁珠和引物延伸产物混合，室温20_25°C孵育O. 5-2hrs ;所述磁珠在使用前需洗漆并重悬于2X封闭洗漆缓冲液 中，所述缓冲液包含IOmMTris-HCl，pH 7. 5, ImM EDTA和2M NaCl ;然后，使用磁力架收集带有生物素的DNA片段；3.4)连接，使用T4DNA连接酶将捕获到的带有生物素的DNA连接到适量的SplinkTA上，16°C孵育16_20h ;所述SplinkTA是将等分子量的寡核苷酸splinkerette和PrimerLongTA混匀，92°C孵育2min后缓慢降温至室温20_25°C而制得；3.5)首轮PCR及第二轮PCR，使用捕获连接的带有生物素的DNA片段，并以此作为 PCR 模板；首轮 PCR 是在含有 I. 5mM MgCl2、O. 2mM dNTPs、20pmol 引物 AKVp7774、20pmol引物P-short及2. 5U Taq DNA聚合酶的反应体系中进行，其反应程序是95°C lmin 30s ；94°C 15s，70°C 2min 40s，共 10 个循环；94°C 15s，64°C 30s, 70°C 2min 10s，共 20 个循环；最后70°C延伸IOmin ;在二轮PCR中，除了是使用首轮PCR产物作为模板并将引物替代为巢式引物AKVp8712和P-nested，所有反应成分和首轮PCR相同，其热循环参数改为95°C lmin30s -M0C 15s,70°C 2min 10s，共 11 个循环；94°C 15s,64°C 30s, 70°C lmin 45s，共 25 个循环；最后70°C延伸IOmin ;最后，使用I %琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检验。3. 6) PCR产物克隆；使用所述AxyPi^p PCR纯化试剂盒纯化第二轮PCR的产物，根据操作说明连接到pMD 19-T载体上，然后进行转化，鉴定阳性克隆并测序。步骤4)在基础的鼠基因组数据库中通过BLAST寻找比对分析得到基因组DNA序列的侧翼原病毒插入物序列。本实施例比较分析SplinkBlunt-PCR和以腺苷为末端的引物延伸反应新的操作方法可知，限制性内切酶可被替换为Hindlll，pvu II和Xho I，而引物延伸反应是由Axygen纯化试剂盒纯化而不是YM-30洗脱柱.我们尝试了改进的方法，证明使用得很好而且便宜效率又高。我们之前的研究显示，对于一些样本单独使用SplinkBlunt-PCR和SplinkTA-PCR这两种方法不能获得完整的PIS位点回收，表明我们需要同时运用这两种方法，才可以获得更好的Pis回收率。但这种做法，显然浪费人力物力。APE-PCR采用了我们先前研究的与Taq DNA聚合酶通过非模板聚合机制产生额外的腺苷形成黏性连接，它不仅可以提高连接效率，减少形成假的串联的平末端连接的DNA片段的可能性，去除大多数的非特异性的模板DNA，还可以使用不同的限制性内切酶产生不同的酶切片段可以使相容性最大化。这样可以在PCR胶上产生更少的背景并使PCR条带更易回收。显然，以腺苷为末端的引物延伸反应的方法可以提高原病毒插入位点的筛选率。所以我们进行了一系列的实验来证明我们的猜想。具体的，参见图I所示用于克隆基因组DNA侧翼序列的原病毒插入位点的APE-PCR方法的原理流程图。由一组限制性内切酶混合物(X，Y and Z)对包含有原病毒基因组序列(黑框)的基因组DNA(水平线)进行酶切，且在用于首轮和第二轮PCR的引物(水平箭头)的下游没有识别位点。对酶切后的双链DNA进行变性，5’末端生物素化(实心圆圈)的原病毒序列特异性的引物退火结合到单链DNA片段上的互补区域，立即使用Taq DNA聚合酶进行引物延伸，其合成的DNA在3’末端产生额外的腺苷(空星形)，然后将引物延伸产物连接到SplinkTA上,SplinkTA是在Splinkerette末端添加一个胸苷(实星形)变型而来的连接物(13，14)。随后将产物连接到SplinkBlunt上。用链霉亲和素包裹的磁珠对带有生物素化的DNA片段进行纯化。然后进行两轮PCR，并将PCR产物进行克隆和测序。参见图2所不，图2为两种不冋的细胞系，使用以腺昔为末端的弓I物延伸反应和SplinkBlunt-PCR两种方法的结果比较。其中，图2(a)为B117H，图2(b)为B139分别是BXH2小鼠衍生的白血病样本；M:DL 10, 000DNA marker.白色箭头显示的是比较后多出的条带；空心圈指示的是不清晰的条带；DNA Marker的大小标注在了电泳图的右侧。
本实施例中选择的两种不同的细胞系都是BXH-2急性髓性白血病细胞系。这两种基因组DNA分别使用SplinkBlunt-PCR和以腺苷为末端的引物延伸反应方法进行操作。此后选择1%凝胶进行电泳。虽然使用不同的细胞系，但是得到相似的结果。由以腺苷为末端的引物延伸反应方法得到的条带比使用SplinkBlum-PCR方法得到的条带要明显增多。我们发现使用以腺苷为末端的引物延伸反应方法得到的部分产物长度达到了几千bp (见图2)。此外，单独收集第二轮PCR产物，然后克隆到pMD 19-T载体中进行蓝白斑筛选并测序。测序得到的结论与电泳图谱得到的结论是一致的(数据没有显示)。总而言之，这些实验数据证实了本实施例的方法的有效性，同时也是一种以PCR技术为基础的鉴定原病毒插入位点较好的方法。参见图3所示，所述图3为使用不同质量的基因组DNA测定以腺苷为末端的引物延伸反应方法的敏感性；PCR产物使用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定；M1 DL1, 000DNA marker ；M2 DL1, OOODNAmarker.基因组DNA来源于B140pA细胞系；加入基因组DNA的质量由少到多分别是O. 1,0. 5，I. O, I. 5μ g. DNA marker的大小标注在电泳图的两侧。此外，运用本实施的方法对基因组DNA质量敏感性进行了一些初步探索研究。测定了四种细胞系，从中得知，DNA质量从O. 1μ g_3y g都是可以的。使用O. 01 μ g的基因组DNA可以得到模糊的部分条带但不清晰(见图3，数据没有显示完全)。我们还发现对于不同的细胞系需要基因组DNA的最佳量是不同的，但是I. 5μ g基因组DNA是最佳的选择。参见图4所示，所述图4为使用以腺苷为末端的引物延伸反应方法时，采用不同尺寸大小磁珠鉴定不同原病毒插入位点间的比较；基因组DNA来源于BI 14细胞系；Ml :DLl, 000DNA marker ；M2 DL1, 000DNA marker. DNA marker 的大小标注在电泳图的两侧。NanoLink 链霉亲和素磁珠是O. 8 μ m，而Dynabeads M-280链霉亲和素磁珠是2. 8 μ m大小。它们都是超顺磁颗粒并包含有共价交联的链霉亲和素，具有亲水性，内层包裹有多聚合物(没有裸露的铁原子)，而且有快速的磁铁反应时间。在这个方法里,本实施例使用以往常用的微米级的链霉亲和素磁珠(Invitrogen,直径2.8 μ m)纯化得到特异性目的条带。包裹有链霉亲和素的磁珠作为一种固相基质可以简单有效地结合生物素化的寡核苷酸。理论上来说，减小磁珠的直径可以增大有效面积比和负载能力，同时用量少、可减少大量的大颗粒可能带来的不利影响，如可能的空间位阻效应。减少固定结合生物素化产物的磁珠颗粒使用量还可以降低成本、减少非特异性的产物背景。本实施例使用纳米级链霉亲和素磁珠(Solulink, diameter 150_850nm)来验证这一理论猜想。本实施例的方法对不同的DNA样本进行这一实验猜想。实验结果表明，纳米级磁珠的效果更好。这里本实施例展示了使用微米级磁珠和纳米级磁珠鉴却114细胞系中原病毒插入位点的比较(豳)。电泳图中显示了较小尺寸的磁珠可以得到更多的条带以及更清晰的电泳图背景。综上所述，我们的实验数据显示，在以腺苷为末端的引物延伸反应方法中使用纳米级链霉亲和素磁珠可以得到更好的结果。本实施例的方法已经在BXH-2小鼠白血病细胞中鉴定PIS位点获得了成功，而这也同样适用于筛选其他种类的逆转录病毒导致的癌症模型的插入位点，或者是绘制其它类型插入诱变核酸片段的插入位点，如转基因、转座子和反转录转座子(又称逆转座子)等插入位点的鉴定。这个技术也可以用来测定基因组DNA片段的终止子，染色体断点的缺失和易位，内含子-外显子的连接以及基因调控区域。
术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种克隆原病毒插入位点的方法，首先，提取基因组DNA为起始材料，其特征在于然后，进行以腺苷为末端的引物延伸反应，最后，在基础的鼠基因组数据库中通过BLAST寻找比对分析得到基因组DNA序列的侧翼原病毒插入物序列；所述以腺苷为末端的引物延伸反应包括以下步骤 3.I)酶切，使用限制性内切酶混合物Hind III，Pvu II and Xho I对不同基因组DNA进行酶切，37°C孵育2 3hrs ;然后，使用AxyPi^p PCR纯化试剂盒依照使用说明对酶切产物进行纯化； 3.2)延伸； 3.3)纯化，为了捕获所述延伸的产物，使用链霉亲和素包裹的磁珠和引物延伸产物混合，室温20-25°C孵育O. 5-2hrs ;所述磁珠在使用前需洗漆并重悬于2X封闭洗漆缓冲液中，所述缓冲液包含IOmM Tris-HCl,pH 7. 5, ImM EDTA和2M NaCl ;然后，使用磁力架收集带有生物素的DNA片段； 3.4)连接，使用T4DNA连接酶将捕获到的带有生物素的DNA连接到适量的SplinkTA上，16 V孵育16-20h ；所述SplinkTA是将等分子量的寡核苷酸splinkerette和PrimerLongTA混匀，92°C孵育2min后缓慢降温至室温20_25°C而制得； 3.5)首轮PCR及第二糊CR，使用捕获连接的带有生物素的DNA片段，并以此作为首轮 PCR 的模板；所述首轮 PCR 是在含有 I. 5mMMgCl2、0. 2mM dNTPs、20pmol 引物 AKVp7774、20pmol引物P-short及2. 5U Taq DNA聚合酶的反应体系中进行，其反应程序是95°C Imin30s -M0C 15s,70°C 2min 40s，共 10 个循环；94°C 15s,64°C 30s, 70°C 2min 10s，共 20 个循环；最后70°C延伸IOmin ;在二轮PCR中，除了是使用所述首轮PCR的产物作为模板并将引物替代为巢式引物AKVp8712和P-nested，所有反应成分和所述首轮PCR相同，其热循环参数为 95°C Imin 30s ；94°C 15s，70°C 2min 10s，共 11 个循环；94°C 15s，64°C 30s, 70°C Imin45s，共25个循环；最后70°C延伸IOmin ;最后，使用I %琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检验。
3.6) PCR产物克隆；使用所述AxyPrep PCR纯化试剂盒纯化第二轮PCR的产物，根据操作说明连接到pMD 19-T载体上，然后进行转化，鉴定阳性克隆并测序。
2.根据权利要求I所述的克隆原病毒插入位点的方法，其特征在于，所述基因组DNA通过以下方法获得 步骤I)培养细胞系所述细胞系是BXH-2小鼠白血病细胞系，培养在常规的ASM培养液中并在含有5% CO2的潮湿的环境中37°C孵育； 步骤2)提取基因组DNA :使用天根基因组提取试剂盒依据操作说明对收集的细胞进行基因组DNA的提取，然后溶解于超纯水中并在_30°C的温度下贮存。
3.根据权利要求I或2所述的克隆原病毒插入位点的方法，其特征在于所述延伸通过以下过程实现，每一个酶切的DNA均在含有I. 5mM MgCl2,0. 2mM dNTPs,20pmol生物素化的引物 Bio-AKVp7711 及 2. 5U Taq DNA polymerase 的缓冲液中 95°C孵育 5min，然后 64°C孵育30min、72°C中孵育20min ;然后将所得延伸产物用所述AxyPi^p PCR纯化试剂盒进行纯化。
4.根据权利要求I或2所述的克隆原病毒插入位点的方法，其特征在于在所述的步骤3. 3纯化过程中，使用纳米级链霉亲和素包裹的磁珠得到特异性目的条带。
全文摘要
本发明公开了一种克隆原病毒插入位点的方法，包括以下步骤1)培养细胞系；2)提取基因组DNA；3)进行以腺苷为末端的引物延伸反应，包括酶切、延伸、纯化、连接、首轮PCR及第二轮PCR和PCR产物克隆；4)在基础的鼠基因组数据库中通过BLAST寻找比对分析得到基因组DNA序列的侧翼原病毒插入物序列。本发明是一种高效率的、更便宜、快速的用于精确定位外源遗传元件在另一个遗传物质中插入位点的工具；即使是微量的样品DNA，也可以从中分离、分析其病毒插入位点。该方法将不仅应用于定位白血病细胞中的病毒插入位点、寻找白血病相关基因，而且也将在定位其它DNA片段的插入位点时发挥重要作用。
文档编号C12N15/10GK102816755SQ201210323558
公开日2012年12月12日 申请日期2012年9月5日 优先权日2012年9月5日
发明者尹斌, 毛政伟, 徐中娟 申请人:苏州大学