专利名称：一种用于禽蛋中沙门氏菌检测的增菌培养液的制作方法
技术领域：
本发明涉及ー种用于禽蛋中沙门氏菌检测的选择性增菌培养液，更具体地说，本发明涉及ー种用于禽蛋中极低数量受亚致死性损伤沙门氏菌检测的选择性增菌培养液，属于选择性富集禽蛋中极低数量受亚致死损伤沙门氏菌的增菌培养液技术领域。
背景技术：
沙门氏菌ewierica)是ー种全球性的人畜共患的食源性致病菌。全球毎年有2亿人到13亿人感染非伤寒沙门氏菌，其中估计有300万人死亡。沙门氏菌菌型繁多，全球已经发现2500多个菌型以上，其中鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌对人类健康威胁最大。我国的禽蛋总产量居世界首位，而且鸡蛋在我国食品消费中占有重要地位。虽然 蛋清中含有溶菌酶、卵转铁蛋白和碱性的环境能抑制微生物的生长，但是肠炎沙门氏菌的Ta/ガ基因却能帮助克服这些抑菌物质，因此肠炎沙门氏菌是从鸡蛋中分离出的最常见的菌型，因而鸡蛋和蛋制品是肠炎沙门氏菌最普遍的传播媒介。2010年美国由鸡蛋感染肠炎沙门氏菌而引起近2000例的食物中毒。开发准确并具有高灵敏度性的禽蛋中肠炎沙门氏菌的检测方法，有助于控制沙门氏菌在人类食品安全中构成的潜在威胁。由于食品进行冷藏、加热、冷冻、高盐、干燥等加工，能使食品中微生物受到亚致死性损伤，在这种状态下的微生物将会变得对ー些物质敏感。在GB中的食品微生物检测过程中会用到选择性增菌液和选择性培养基，如用于沙门氏菌检测的四硫磺酸钠煌绿增菌液(TTB )、木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂(XLD )，这些选择性增菌液和选择性培养基中的胆盐、煌绿等选择性成分不利于亚致死细胞的生长。因此，为了克服选择性增菌液对亚致死沙门氏菌的漏检，GB中规定使用两步增菌的过程，即采用非选择性增菌与选择性增菌。但是，两步增菌过程需48小时，不利于快速检测。目前国内外的大多数研究一般使用人エ接种法制备样品，其中的沙门氏菌往往较多，检出较容易。但在实际生产和产品中，沙门氏菌感染食品时数量往往是很低的，一般认为的极低数量为I 10 cfu/50g (每50g样品中I 10个沙门氏菌)。虽然目前开发了很多快速检测方法，但是食品中的沙门氏菌常常数量极低且受亚致死性损伤，造成了漏检的情况发生，因此增菌步骤是不可缺少的。目前尚未发现有针对极低数量亚致死损伤的沙门氏菌的一歩快速富集增菌培养液的报道，以及在实际食品样品中的应用。国家知识产权局于2009. 10. 28公开了一件申请号为200810093449. 1，名称为“引起食物中毒沙门氏菌属快检试剂”的发明专利，该专利涉及ー种引起食物中毒沙门氏菌属快检试剂，特别是食源性鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、付伤寒甲、こ沙门氏菌的快检试剂及其制备方法。该快检试剂具有快速、准确、灵敏度高等特点，较传统方法更具有应用价值，对指导临床诊断和治疗，防止滥用抗菌药物具有重要意义。本发明是在增菌液中増加了特异性的沙门氏菌属多价及单价血清，使检测确诊过程缩短至2-6小吋，增菌时能够利用特异血清的血清凝集反应，鉴定的准确率均在97%以上。检测致病菌时耗时少、灵敏度高，准确性強。上述专利其特征在于具有如下配方(克/每升蒸馏水)蛋白胨5. 0-10. O ;乳糖
3.5-4. 5 ;磷酸氢ニ钠4. 0-5. O ;磷酸ニ氢钠5. 0-6. O ;复合生长因子10. 0-20. O ;亚硒酸氢钠3. 5-4. 5 ;无菌沙门氏菌属多价及单价血清10-20ml ;蒸馏水加至IOOOmL,调pH7. I。上述专利是ー种快速检测试剂，其缺点之一是只针对健康的沙门氏菌进行增菌，没有特别针对受亚致死性损伤的沙门氏菌的增菌，而生产中遇到的食品中的沙门氏菌常常处于受亚致死性损伤的情况，且沙门氏菌的数量通常极低；缺点ニ是没有明确的对非目标菌的抑制作用，不能有效避免非目标造成的假阳性。国家知识产权局于2008. 5. 28公开了一件申请号为200710032778. 0，名称为“沙门氏菌显色培养基、检测试剂盒及检测方法”的发明专利，该专利涉及的一种沙门氏菌显色培养基、检测试剂盒及检测方法，属于食品微生物安全监测领域。检测试剂盒由加入了
O.I O. 5g细菌特异性酶的混合显色底物M-galactoside的显色培养基与增菌液A缓冲蛋白胨水培养基、B四硫磺酸钠煌绿增菌液组成；检测时，对食品样品进行前处理，先后利用增菌液A、B进行增菌培养，最后将二次增菌液接种至显色培养基上培养，若出现光滑、略凸起、直径I 3_、边缘整齐的品红色菌落，说明样品存在沙门氏菌。所述的显色培养基成本低廉，试剂盒配置简单，检测方法检测灵敏度高，周期短、可操作性強、适用于处理大通量的样本、易于产业化生产，可以广泛推广应用到食品卫生、环境监测等领域。上述专利其特征在于配方为蛋白胨20 30g、酵母膏粉3 7g、氯化钠4 7g、胆盐 O. I O. 5g、琼脂 12 15g、混合显色底物 M-galactoside 0. 05 0. 95g、Na2C03
0.02 0. 04g、选择性添加剂0. 01 0. 05g。上述专利的增菌液缺点是使用的是国标中的两种增菌液，检测周期长，容易漏 检，无法对现实生产中极低数量的受亚致死性损伤的沙门氏菌进行增菌。
发明内容
本发明g在解决现有技术中用于禽蛋中沙门氏菌检测的选择性增菌液和选择性培养基不利于亚致死性细胞的生长，从而使食品中极低数量的受亚致死性损伤的沙门氏菌出现漏检的情況，同时现有的非选择性和选择性两步法增菌过程需要48小时，耗费大量时间，不利于快速检测。我们g在提供ー种用于禽蛋中极低数量受亚致死性损伤沙门氏菌检测的增菌培养液，在达到具有选择性、不便非目标菌增长的同时，克服禽蛋蛋清对沙门氏菌的抑制作用，具有显著的沙门氏菌增菌效果，避免禽蛋以及禽蛋制品中极低数量受亚致死性损伤沙门氏菌漏检，且能够使极低数量受亚致死性损伤沙门氏菌快速富集，并在ー个步骤内快速检出的目的。为了实现上述发明目的，本发明的具体技术方案如下
ー种用于禽蛋中沙门氏菌检测的增菌培养液，其特征在于包括以下原料组分组成 按照IL所述增菌培养液中的含量计
蛋白胨7 llg/L
氯化钠5 8g/L
磷酸氢ニ钠7 9g/L磷酸ニ氢钾O. 5 lg/L
煌绿6 8 mg/L
牛胆盐O. 5 lg/L
萘唳酸10 14mg/L
脱脂牛奶粉15 40g/L。本发明在上述基本技术方案的基础上，其原料组分配比更优选的为
按照IL所述增菌培养液中的含量计
蛋白胨10. Og/L
氯化钠5. Og/L
磷酸氢ニ钠9. Og/L
磷酸ニ氢钾I. 5g/L
煌绿6.08mg/L
牛胆盐I. Og/L
萘啶酸13.88mg/L
脱脂牛奶粉20g/L。一种用于禽蛋中沙门氏菌检测的增菌培养液的制备方法，其特征在干包括以下エ艺步骤
A、基础液配制
将蛋白胨、氯化钠、磷酸氢ニ钠、磷酸ニ氢钾、牛胆盐、脱脂牛奶粉加入到蒸馏水中，搅拌均匀，煮沸溶解，再加蒸馏水调节PH值为7. O 7. 4，灭菌得到基础液备用；
B、萘啶酸溶液配制
将萘啶酸充分溶解于O. 05mol/L的NaOH溶液，溶解后再加入O. 05mol/L的NaOH溶液定容得到萘啶酸溶液；
C、煌绿溶液配制
将煌绿充分溶解于蒸馏水中，溶解后再加入蒸馏水定容，灭菌后得到煌绿溶液备用；
D、增菌培养液配制
按照先后顺序将步骤B得到的萘啶酸溶液、步骤C得到的煌绿溶液加入到步骤A得到的基础液中，摇匀得到所述的用于禽蛋中沙门氏菌检测的增菌培养液。在步骤A中所述的灭菌为在110 121°C下灭菌15 20min。在步骤C中所述的灭菌为将煌绿溶液存于暗处，自然灭菌至少I天。ー种禽蛋沙门氏菌的检测方法，其特征在于包括以下步骤
A、取蛋清、蛋黄、蛋壳分别加入到增菌培养液中；
B、在36 42で下培养18 24h后，将样品增菌培养液涂在木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂板(XLD )和固体培养基(TSAYE )上，计算非目标菌；
C、采用PCR扩增hilA基因，检测样品增菌培养液中的沙门氏菌。在步骤A中所述的蛋清与增菌培养液的体积比为1:9，蛋黄与增菌培养液的体积比为1:9，蛋壳加入到20 IOOml的增菌培养液中。本发明带来的有益技术效果
I、本发明为了解决现有技术中用于禽蛋中沙门氏菌检测的选择性增菌液和选择性培养基不利于亚致死性细胞的生长，使得食品中极低数量的受亚致死性损伤的沙门氏菌出现漏检的情況，同时现有的非选择性和选择性两步法增菌过程需要48小时，耗费大量时间，不利于快速检测的问题，提供了一种新的用于禽蛋中沙门氏菌检测的增菌培养液配方。该配方是通过对增菌培养液组分以及配比的优化和改进，其几种组分和配比相互作用，使得该增菌培养液具有选择性，不会使非目标菌增长的同时，克服禽蛋蛋清对沙门氏菌的抑制作用，具有显著的沙门氏菌增菌效果，避免禽蛋以及禽蛋制品中极低数量受亚致死性损伤沙门氏菌漏检，且能够使极低数量受亚致死性损伤沙门氏菌快速富集，并在ー个步骤快速检出禽蛋中的极低数量受亚致死性损伤沙门氏菌。与现有技术中的两步增菌，耗费48小时相比，采用本发明的增菌培养液，只需要一步增菌，用时24小吋，大大节约了检测时间，提高了效率，在时间缩短的同时，本发明的增菌培养液选择性的不会对非目标菌进行增菌，排除了干扰，提高了检测准确度，进ー步的，本发明的增菌培养液能够对禽蛋食品中极低数量(I 10 cfu/50g)的，且受到亚致死性损伤的沙门氏菌进行增菌，避免了常规增菌培养液无法对受到亚致死性损伤的沙门氏菌进行增菌造成的漏检情况，提高了检测质量，保证了食品安全。
2、本发明增菌培养液中由于加入了三种抑制剂，三种抑制剂相互配合能抑制非目标菌在增菌培养液中的生长，煌绿、牛胆盐、萘啶酸能抑制大肠杆菌、变形杆菌以及其他的部分革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌；促进剂脱脂牛奶粉能够克服蛋清的抑制作用，对受到亚致死性损伤的沙门氏菌有提高复活率的帮助；且本发明通过响应曲面优化，确定了促进剂脱脂牛奶粉和三种抑制剂的最适浓度范围，因此，通过加入促进剂脱脂牛奶粉提高亚致死沙门氏菌的复活率和克服蛋清的抑制作用，同时在不影响亚致死沙门氏菌复活的情况下，通过抑制剂来抑制非目标菌的生长，简化国标中的两步增菌步骤，达到对极低数量受亚致死性损伤沙门氏菌的检出目的。另外，同样通过响应曲面优化，在配方中配比范围的基础上，得到组分在增菌培养液中的最佳浓度，使得非目标菌的抑制效果和受亚致死性损伤的沙门氏菌的促进效果达到最佳。3、本发明的配方采用常规的制备方法，以及常规的检测方法就能达到本发明的发明目的，更优选的，本发明提供了一种增菌培养液的制备方法和采用增菌培养液检测禽蛋中沙门氏菌的方法，该制备方法具有操作简单的优点，该检测方法具有特异性强，检测灵敏度高，检测时间短的优点。
本发明的图I为实施例13中PCR扩增hilA基因检测I 15号样品結果；
本发明的图2为实施例13中PCR扩增Ai以基因检测16 30号样品結果。
具体实施例方式实施例I
ー种用于禽蛋中沙门氏菌检测的增菌培养液，其特征在于包括以下原料组分组成 按照IL所述增菌培养液中的含量计
蛋白胨7g/L
氯化钠5g/L磷酸氢ニ钠7g/L
磷酸ニ氢钾O. 5g/L
煌绿6 mg/L
牛胆盐O. 5g/L
萘啶酸10mg/L
脱脂牛奶粉15g/L。实施例2
ー种用于禽蛋中沙门氏菌检测的增菌培养液，其特征在于包括以下原料组分组成 按照IL所述增菌培养液中的含量计
蛋白胨llg/L
氯化钠8g/L
磷酸氢ニ钠9g/L
磷酸ニ氢钾lg/L
煌绿8 mg/L
牛胆盐lg/L
萘啶酸14mg/L
脱脂牛奶粉40g/L。实施例3
ー种用于禽蛋中沙门氏菌检测的增菌培养液，其特征在于包括以下原料组分组成 按照IL所述增菌培养液中的含量计
蛋白胨9g/L
氯化钠6. 5g/L
磷酸氢ニ钠8g/L
磷酸ニ氢钾O. 75g/L
煌绿7mg/L
牛胆盐O. 75g/L
萘啶酸12mg/L
脱脂牛奶粉27. 5g/L。实施例4
ー种用于禽蛋中沙门氏菌检测的增菌培养液，其特征在于包括以下原料组分组成 按照IL所述增菌培养液中的含量计
蛋白胨8g/L
氯化钠7g/L
磷酸氢ニ钠8. 5g/L
磷酸ニ氢钾O. 8g/L
煌绿6. 5mg/L
牛胆盐0.6g/L
萘啶酸11.5mg/L
脱脂牛奶粉33g/L。
实施例5
本发明最佳配比如下
ー种用于禽蛋中沙门氏菌检测的增菌培养液，其特征在于
按照IL所述增菌培养液中的含量计
蛋白胨10. Og/L
氯化钠5. Og/L
磷酸氢ニ钠9. Og/L
磷酸ニ氢钾I. 5g/L
煌绿6.08mg/L
牛胆盐I. Og/L
萘啶酸13.88mg/L
脱脂牛奶粉20g/L。上述配比为通过响应曲面优化，在配方中配比范围的基础上，得到组分在增菌培养液中的最佳浓度，使得非目标菌的抑制效果和受亚致死性损伤的沙门氏菌的促进效果达到最佳。实验内容
I.材料与方法 I. I材料
肠炎沙门氏菌(SahofleBa enterica serovar Enteritidis CVCC3377),菌株于含有20%甘油的TSBYE中于-40で保存，且使用吋，菌株于TSBYE中37で培养24 h，保存于4で以备使用；鸡蛋购买于超市，并于4で保存；缓冲蛋白胨水(BPW)、木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂(XLD)含0. 6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤(TSBYE)购自广东环凯微生物科技有限公司；牛胆盐(BS)、萘啶酸(NA)、煌绿(BG)购自Sigma公司；脱脂牛奶粉(SM)购自Oxid公司。I. 2 方法
I.2. I基础培养基的形成
BPff是GB中增菌步骤中的第一歩使用的增菌缓冲液，其大部分成分为缓冲剂，能有效地克服食品引起剧烈的PH波动，保护受损的细胞和帮助其复活。因此BPW作为本发明的基础培养基，成分为蛋白胨10. O 8/し氯化钠5.0 8/し磷酸氢ニ钠9.0 8/し磷酸ニ氢钾1.5
g/しI. 2. 2单因子试验
为确定添加剂的种类和用量，分别将在4で放置40天的IO2 CFU/mL的沙门氏菌接种至含有不同添加剂成分的50 mL BPW中，以不含有添加剂成分的BPW作为空白对照。接种后在37で下静置培养24 h后測量光密度OD54tl，含有SM成分的小组在37で静置培养24h后，适当稀释，涂平板于XLD上，37で下培养24 h后进行菌落计数，并计算抑制率。该实验重复3次，每小组3个平行，结果见表I。考虑到促进剂对非目标菌也有促进作用，促进剂SM使用较低浓度20 g/L，而FE对目标菌的促进作用相对于SM较小，且FE价格昂贵，因此促进剂只使用SM。表I :不同抑制剂及促进剂对目标菌生长的影响
权利要求
1.ー种用于禽蛋中沙门氏菌检测的增菌培养液，其特征在于包括以下原料组分组成 按照IL所述增菌培养液中的含量计蛋白胨7 llg/L氯化钠5 8g/L 磷酸氢ニ钠7 9g/L 磷酸ニ氢钾O. 5 lg/L煌绿6 8 mg/L 牛胆盐O. 5 lg/L 萘唳酸10 14mg/L 脱脂牛奶粉15 40g/L。
2.根据权利要求I所述的ー种用于禽蛋中沙门氏菌检测的增菌培养液，其特征在于包括以下原料组分组成 按照IL所述增菌培养液中的含量计蛋白胨10.0g/L氯化钠5. Og/L 磷酸氢ニ钠9. Og/L 磷酸ニ氢钾I. 5g/L煌绿6.08mg/L牛胆盐I. Og/L 萘啶酸13.88mg/L 脱脂牛奶粉20g/L。
3.根据权利要求I或2所述的ー种用于禽蛋中沙门氏菌检测的增菌培养液，其特征在于所述用于禽蛋中沙门氏菌检测的增菌培养液的制备方法包括以下エ艺步骤 A、基础液配制 将蛋白胨、氯化钠、磷酸氢ニ钠、磷酸ニ氢钾、牛胆盐、脱脂牛奶粉加入到蒸馏水中，搅拌均匀，煮沸溶解，再加蒸馏水调节PH值为7. O 7. 4，灭菌得到基础液备用； B、萘啶酸溶液配制 将萘啶酸充分溶解于O. 05mol/L的NaOH溶液，溶解后再加入O. 05mol/L的NaOH溶液定容得到萘啶酸溶液； C、煌绿溶液配制 将煌绿充分溶解于蒸馏水中，溶解后再加入蒸馏水定容，灭菌后得到煌绿溶液备用； D、增菌培养液配制 按照先后顺序将步骤B得到的萘啶酸溶液、步骤C得到的煌绿溶液加入到步骤C得到的基础液中，摇匀得到所述的用于禽蛋中沙门氏菌检测的增菌培养液。
4.根据权利要求3所述的ー种用于禽蛋中沙门氏菌检测的增菌培养液，其特征在于所述增菌培养液制备方法的步骤A中，灭菌是在110 121°C下灭菌15 20min。
5.根据权利要求3所述的ー种用于禽蛋中沙门氏菌检测的增菌培养液，其特征在于所述增菌培养液制备方法的步骤C中，灭菌是将煌绿溶液存于暗处，自然灭菌至少I天。
6.根据权利要求I所述的ー种用于禽蛋中沙门氏菌检测的增菌培养液，其特征在于采用增菌培养液检测禽蛋中沙门氏菌的方法，包括以下步骤 A、取蛋清、蛋黄、蛋壳分别加入到增菌培养液中； B、在36 42で下培养18 24h后，将样品增菌培养液涂在木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂板XLD和固体培养基TSAYE上，计算非目标菌； C、采用PCR扩增hilA基因，检测样品增菌培养液中的沙门氏菌。
7.根据权利要求6所述的ー种用于禽蛋中沙门氏菌检测的增菌培养液，其特征在于采用增菌培养液检测禽蛋中沙门氏菌时，在步骤A中所述的蛋清与增菌培养液的体积比为1:9，蛋黄与增菌培养液的体积比为1:9，蛋壳加入到20 IOOml的增菌培养液中。
全文摘要
本发明涉及一种用于禽蛋中沙门氏菌检测的增菌培养液，属于选择性富集禽蛋中极低数量受亚致死损伤沙门氏菌的增菌培养液技术领域。本发明的增菌培养液包括以下原料组分组成按照1L所述增菌培养液中的含量计蛋白胨7～11g/L、氯化钠5～8g/L、磷酸氢二钠7～9g/L、磷酸二氢钾0.5～1g/L、煌绿6～8mg/L、牛胆盐0.5～1g/L、萘啶酸10～14mg/L、脱脂牛奶粉15～40g/L。本发明的增菌培养液是一种选择性富集低数量受亚致死损伤沙门氏菌的增菌培养液，缩短食品中沙门氏菌检测的增菌处理步骤的同时，克服漏检样品中低数量亚致死沙门氏菌的缺陷，提高了食品中沙门氏菌检测的可靠性和准确度。
文档编号C12R1/42GK102864204SQ20121032762
公开日2013年1月9日 申请日期2012年9月7日 优先权日2012年9月7日
发明者孙群, 李婉丽, 余洋, 祝国强, 邓鹜远, 马沁沁, 温文婷 申请人:四川大学