专利名称：绵羊皮肤组织中内参基因的筛选方法
技术领域：
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及基因的筛选方法。
背景技术：
随着对不同物种全基因组序列的揭晓，基因的定量表达水平研究在生命科学领域日趋显得重要了。RT-PCR技术作为一种高效的定量PCR技术，可以实现对某个基因进行实时监测，监测其在不同组织、细胞、个体以及不同发育阶段或经过某种特殊条件处理后的表达水平。为了去除不同样本在RNA的产量、质量、逆转录效率以及移液器上可能存在的差异而获得目标基因特异性表达的真正差异，通常选择特定的内参基因进行标准化校正。内参基因扩增中的变化能反映RNA产量、质量和/或cDNA合成效率的变化。因此，为减少样本间的差异选择适当的内参基因是必要的(wong等,2005 ；Nolan等,2006 ；Vandesom等，2002)。理想的内参基因应该表达量适中，不存在假基因，在不同的细胞、组织中其无显著性表达量差异，并且其不受任何实验处理措施的影响而体现在表达水平与目标基因相似(陈凤花等，2005)。放之四海而皆准的内参基因是不存在的，因此，必须在特定的实验条件下检测多种内参基因的稳定性，从而筛选出符合实验特定条件的理想内参(T h e 11 i η等，1999 ;Sturzenbaum等，2001)。有研究报道，定量PCR采取单一的内参校正与标准化目标基因的表达的研究达到了 90%以上[69] (suzuki等，2000 ；vandesompel等，2002)其还阐明仅使用单个内参的方法，可能使得实验表达数据产生二十倍甚至以上的误差，盲目地使用一个持家基因作内参，不但可能难以发现目标基因的微小差异表达，甚至可能得出错误的悖论。根据Thellin等[7CI], (1999), vandesompele 等，(2002),Brinor 等，(2006)和 PeterSeta[71] (2007)等的研究表明至少要使用两个及其以上内参基因才能对定量PCR进行准确的校正。因此，用于评估内参基因稳定性的统计分析软件geNorm(Vandesompele等,2002)应运而生。目前，常用的内参基因有GAPDH、ACTB、18SrRNA、B2M、TBP、RPL13A等基因。目前，对于中国美利奴羊(新疆型)GAPDH基因作为皮肤组织的内参基因研究还未见报道。
发明内容
本发明提供一种绵羊皮肤组织中内参基因的筛选方法，本发明解决了目前还没有对中国美利奴羊(新疆型)GAPDH基因作为皮肤组织内参基因筛选方法的问题。为解决上述问题，本发明采用如下技术方案绵羊皮肤组织中内参基因的筛选方法，包括以下步骤—、确定内参基因的方法以绵羊皮肤组织为试验样品，首先，取10_20mg皮肤组织组织液氮中彻底研磨，RNA提取试剂盒对皮肤组织样进行总RNA提取，I %琼脂糖凝胶电泳，O. 5 X TBE电泳缓冲液，100V, 15min来检测RNA完整性；二、取一定量的RNA提取物，用ddH20稀释2_10倍，用ddH20将分光光度计调零，取稀释液进行测定RNA纯度，取0D260/0D280读数在I. 8-2. O之间的RNA样品进行后续试验，计算RNA终浓度(ng/ μ L) = (0D260) X (稀释倍数η) X 40 ;三、其次，取50ng/ μ L的RNA样品作为模板，采用cDNA合成试剂盒进行反转录合成cDNA，参考GenBank中绵羊相应基因的核苷酸序列，分别设计并合成18S rRNA、β -Actin、GAPDH、B2M、RPL13A、TBP 这 6 个内参基因的引物；四、再次，以反转录合成CDNA为模板，分别以6个内参基因为引物，采用SYBRGreen I荧光染料试剂盒，进行优化条件的实时荧光定量PCR，每个分析对象均取3次重复实验数据的平均值，每次实验用ddH20作为阴性对照，读取实时荧光定量PCR仪系统检测的每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数，即Ct值；五、最后,采用geNorm程序计算6个内参基因标准化因子Vn/n+Ι的配对差异分析从而判定最适内参基因的数目，同时，统计分析各内参基因的表达稳定度平均值，即M值，并对其进行排序，M值越小，基因表达越稳定，最终筛选出在绵羊皮肤组织中表达最稳定的 内参基因是18S rRNA、β-Actin、GAPDH三个内参基因。本发明的技术效果理想的看家基因应在各种实验因素条件下，各种类型的组织或细胞中均恒定表达。大量的研究表明，任何一种内参基因的所谓恒定表达都仅仅是在一定类型的细胞或实验因素作用下“有范围”的恒定。采用传统的一种内参基因作标准化将导致相对大的误差；而选择多种内参基因的几何平均数作为标准化因子来校正目的基因的表达效果更好。大量的研究证实在同一实验中选用2-4个内参可有效提高目标基因的定量准确性。经筛选对所有组织或细胞的内参基因，最终确定出2个甚至以上标准作为内参基因，从而得出更可信的结果，该程序对于任何基因的准确定量均具有极其重要意义。本发明在绵羊皮肤组织中同时使用β -Actin、GAPDH、18SrRNA等3个内参基因，即标准内参基因的
循环阈值计算公式为
Gt (内参基因)\8SrRNA ^ A-Actin ^ GAPDH以校正目的基因表达水平。本发明首次利用SYBR Green I特异性地与双链DNA结合发出荧光的特性，以LightCycler 2. O为平台，建立了中国美利奴羊(新疆型)皮肤组织中GAPDH基因的SYBRGreen I实时荧光定量PCR检测方法，旨在为进一步研究中国美利奴羊(新疆型)相关基因的定量表达奠定基础。为解决这一问题，首先选定合适的内参并检测内参基因稳定性，最终确定出最适内参的个数，都将需要在实验设计时考虑周全。目前，国内尚未见绵羊皮肤组织中定量PCR分析基因表达研究中关于内参基因筛选的相关报道。本研究将选择18SrRNA、ACTB、GAPDH、B2M、TBP、RPL13A等6个内参基因，检测其在绵羊皮肤组织中表达稳定性，旨在为后续RT-PCR最适内参基因的选择奠定基础。
图I是本发明绵羊皮肤组织中总RNA提取检测结果图；图中M D2000 marker ;1、
2:细型细毛羊mRNA样品；3、4 :超细型细毛羊mRNA样品；图2是本发明GAPDH基因RT-PCR产物检测结果图；图中M D2000 marker ;1、2、3、4 :RT-PCR 产物；
图3是本发明GAPDH扩增曲线及标准曲线对比图；其中a、GAPDH基因扩增曲线，b、GAPDH基因标准曲线；图4是本发明6个内参基因中Log (起始浓度)与循环阈值Ct线性关系图；图5是本发明GAPDH基因熔解曲线图；图6是本发明19个绵羊皮肤组织样品在6个内参基因中的循环阈值统计分析图；图7是本发明内参基因表达稳定性平均值图表；
图8是本发明最适标准化内参基因数目的确定图表。
具体实施例方式下面用最佳的实施例对本发明做详细的说明。I提取过程绵羊皮肤组织中内参基因的筛选方法，包括以下步骤—、确定内参基因的方法以绵羊皮肤组织为试验样品，首先，取10_20mg皮肤组织组织液氮中彻底研磨，RNA提取试剂盒对皮肤组织样进行总RNA提取，I %琼脂糖凝胶电泳，O. 5 X TBE电泳缓冲液，100V, 15min来检测RNA完整性；二、取一定量的RNA提取物，用ddH20稀释2_10倍，用ddH20将分光光度计调零，取稀释液进行测定RNA纯度，取0D260/0D280读数在I. 8-2. O之间的RNA样品进行后续试验，计算RNA终浓度(ng/ μ L) = (0D260) X (稀释倍数2-10) X 40 ;三、其次，取50ng/ μ L的RNA样品作为模板，采用cDNA合成试剂盒进行反转录合成cDNA，参考GenBank中绵羊相应基因的核苷酸序列，分别设计并合成18S rRNA、β -Actin、GAPDH、B2M、RPL13A、TBP 这 6 个内参基因的引物；四、再次，以反转录合成cDNA为模板，分别以6个内参基因为引物，采用SYBRGreen I荧光染料试剂盒，进行优化条件的实时荧光定量PCR，每个分析对象均取3次重复实验数据的平均值，每次实验用ddH20作为阴性对照，读取实时荧光定量PCR仪系统检测的每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数，即Ct值；五、最后，采用geNorrm程序计算6个内参基因标准化因子Vn/n+Ι的配对差异分析从而判定最适内参基因的数目，同时，统计分析各内参基因的表达稳定度平均值，即M值，并对其进行排序，M值越小，基因表达越稳定，最终筛选出在绵羊皮肤组织中表达最稳定的内参基因是18S rRNA、β-Actin、GAPDH三个内参基因。2具体实验过程2. I实验材料2. I. I实验羊来源及样品采集本实验所用19只中国美利奴羊(新疆型)均由新疆巩乃斯种羊场提供，其中，9只周岁超细型细毛羊，10只周岁细型细毛羊，采集其肩胛部皮肤组织样品液氮中冻存。2. I. 2主要仪器设备I. BIOFUGE PRIMO R型低温离心机美国Thermo公司2. ZHJH C1112B型超净工作台上海智诚3. Eppendorf 移液器德国 Eppendorf 公司4. DK-8P型电热恒温水槽国产精宏
5. IKA MS3型圆周振荡器上海吉延环境仪器有限公司6. Mini-6K型微型离心机北京戴美克科技有限公司7. LightCycler 2. O 突光定量 PCR 仪Roche 公司8. My Cycler 型 PCR 仪美国 Bio-Rad 公司9. PowerPac Basic 型电泳仪美国 Bio-Rad 公司10. DYCP-31CN型琼脂糖水平电泳槽北京六一仪器厂11. NAN0DR0P 2000型分光光度计美国Thermo公司
12. GZX-9140MBE型电热恒温鼓风干燥箱上海博讯实业有限公司13. LDZX-75KBS型立式压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂14.摩尔Σ H20超纯水机上海摩勒科学仪器厂15.微波炉国产美的公司16.电冰箱中国海尔公司2. I. 3试剂盒及普通试剂RNA抽提试剂盒、cDNA合成试剂盒(含IOXRT mix、dNTP混合液、Oligo dT15、Quant Reverse Transcriptase、RNase-free · ddH20)、SYBR Green I 突光染料试剂盒(含2. 5XReal Master Mix、20XSYBR Solution、RNase-free · ddH20)、Taq 酶(含 IOXTaqbuffer>25mmol/LMg2+) > dNTP>D2000> Marker I 等均购自 Tiangen 公司；硼酸、EDTA、琼脂糖(Agrose H)、溴化乙锭(EB)，无水乙醇、DEPC等试剂均由北京鼎国生物有限公司提供。2. I. 4溶液与缓冲液的配制(I) I %琼脂糖lg琼脂糖，溶于IOOmL O. 5 X TBE，微波炉加热溶解；(2)2%琼脂糖2g琼脂糖，溶于IOOmL O. 5XTBE，微波炉加热溶解；(3)溴化乙锭 Etfc(10mg/mL) : IOOmL O. 5 X TBE 缓冲液中加入 8 μ L EtBr，完全熔
解后置棕色瓶中招箔包裹4°C保存；(4) 10XTBE 108g Tris 碱、55g 硼酸、9. 3g EDTA 溶于 IOOOmL 去离子水中。2. 2实验方法2. 2. I内参基因引物设计参考GeneBank中绵羊相应基因的核苷酸序列,采用Primer 5. O软件设计引物，由生工生物(上海)有限公司合成，内参基因的基本信息见表2-1。表2-1内参基因的基本信息
权利要求
1.绵羊皮肤组织中内参基因的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤 一、确定内参基因的方法以绵羊皮肤组织为试验样品，首先，取10-20mg皮肤组织组织液氮中彻底研磨，RNA提取试剂盒对皮肤组织样进行总RNA提取，1%琼脂糖凝胶电泳，O. 5 X TBE电泳缓冲液，100V, 15min来检测RNA完整性； 二、取一定量的RNA提取物，用ddH20稀释2-10倍，用ddH20将分光光度计调零，取稀释液进行测定RNA纯度，取0D260/0D280读数在I. 8-2. O之间的RNA样品进行后续试验，计算 RNA 终浓度(ng/ μ L) = (0D260) X (稀释倍数 2-10) X 40 ； 三、其次，取50ng/l·!L的RNA样品作为模板，采用cDNA合成试剂盒进行反转录合成cDNA，参考GenBank中绵羊相应基因的核苷酸序列，分别设计并合成18S rRNA、β-Actin、GAPDH、B2M、RPL13A、TBP这6个内参基因的引物； 四、再次，以反转录合成cDNA为模板，分别以6个内参基因为引物，采用SYBRGreen I荧光染料试剂盒，进行优化条件的实时荧光定量PCR，每个分析对象均取3次重复实验数据的平均值，每次实验用ddH20作为阴性对照，读取实时荧光定量PCR仪系统检测的每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数，即Ct值； 五、最后，采用geNorm程序计算6个内参基因标准化因子Vn/n+Ι的配对差异分析从而判定最适内参基因的数目，同时，统计分析各内参基因的表达稳定度平均值，即M值，并对其进行排序，M值越小，基因表达越稳定，最终筛选出在绵羊皮肤组织中表达最稳定的内参基因是18S rRNA、β-Actin、GAPDH三个内参基因。
全文摘要
绵羊皮肤组织中内参基因的筛选方法，涉及生物工程技术领域。步骤确定内参基因的方法；取一定量的RNA提取物，用ddH2O稀释2-10倍；其次，取50ng/μL的RNA样品作为模板，采用cDNA合成试剂盒进行反转录合成cDNA；再次，以反转录合成cDNA为模板，分别以6个内参基因为引物；最后，采用geNorm程序计算6个内参基因标准化因子Vn/n+1的配对差异分析从而判定最适内参基因的数目。本发明解决了目前还没有对中国美利奴羊(新疆型)GAPDH基因作为皮肤组织内参基因筛选方法的问题。本发明利用SYBR Green I特异性与双链DNA结合发出荧光的特性，建立了中国美利奴羊(新疆型)皮肤组织中GAPDH基因的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法。
文档编号C12Q1/68GK102839215SQ20121033127
公开日2012年12月26日 申请日期2012年9月10日 优先权日2012年9月10日
发明者田可川, 黄锡霞, 田月珍, 徐新明, 狄江, 哈尼克孜·吐拉甫, 吴伟伟, 付雪峰 申请人:新疆维吾尔自治区畜牧科学院畜牧科学研究所