专利名称：乙型肝炎病毒荧光定量pcr检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及ー种检测こ型肝炎病毒核酸荧光定量PCR试剂盒，适用于各种组织、细胞、血液及其它体液中的こ型肝炎病毒核酸的定量检测。
背景技术：
こ型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染不仅引起急慢性病毒性肝炎,而且与肝纤维化、肝细胞癌密切相关，是ー个严重危害全世界人类健康的公共卫生问题。全球约20亿人被证明有こ肝感染，3. 5亿人为慢性感染者，据世界卫生组织报道，全球前10位疾病死因中，こ肝占第9位。我国属于世界上HBV感染高发区，全国约I. 3亿人是HBV携帯者，慢性肝炎患者 2300万，占全球HBV表面抗原(hepatitis B virus surface antigen, HBsAg)总携带率的近50% ；60%的人受过HBV的感染，在某些人群中甚至高达79% ;8% 10%的人为HBsAg携带者。此外，患慢性肝炎的病人中约有80%以上为慢性こ型肝炎患者，而受HBV慢 性感染的人群摧患原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的相对危险性至少增加300倍。据世界卫生组织1983年报告，全世界的原发性HCC中大约80%都与HBV慢性感染相关。毎年我国在病毒性肝炎的直接治疗方面费用约有500亿元(不包括保健品费用、影响学习、就业和工作等造成的间接损失)。早期诊断HBV相关指标对控制こ肝蔓延、确立正确治疗方案至关重要。こ型肝炎病毒属于嗜肝病毒家族，是已知最小的动物DNA病毒之一。HBV基因组结构独特，由不完全的环状双链DNA组成，其两条链核酸的长短不一。在HBV-DNA的长链上有四个开放读码框架(0RF)，即S区、C区、P区和X区，分别编码HBsAg、HBcAg, HBeAg, DNA多聚酶和X蛋白。こ肝病毒血清标志物(HBV-M)检测是诊断こ型肝炎最常用的指标，目前临床最常用的“两对半”指的是HBSAg、HBeAg、HBCAb、HBSAb、HBeAb，主要反映人体对こ肝病毒(HBV)感染的免疫状态，但不能直接反映HBV在患者体内的复制情况，更不能作为判断患者是否具有传染性的直接证据。由于HBV感染者不同时期可有多种不同的血清学标志模式，对于这些模式的不同临床意义，非传染病专业医师很难准确掌握。由于HBV是DNA病毒，因此HBV DNA的检测是衡量こ肝传染性的最精确的指标，HBV DNA阳性即反映有完整的病毒颗粒的复制，是判断患者具有传染性的最直接和最可靠的指标，同吋，HBV DNA还可作为判定HBV药物疗效的ー个极有意义的临床指标。现在临床上主要采用酶联免疫法对HBV表面的免疫标记物进行检测和定量.但是酶联免疫的特异性不高.且灵敏度相对较低.假阴性率高。九十年代后，PCR技术和生物芯片技术已用在こ肝病毒的检测中，大大的提高了检测的准确度，缩短了分析时阀，实现了对HBV DNA的定量检测，可以准确的判断HBV病毒在体内的复制情況，但是这些检测技术还存在各种缺陷，且成本相对较高，不利于普及。因此，开发快速、敏感和特异的检测HBV DNA的技术是未来HBV病原学检测技术的发展方向。目前常用的HBV DNA定量检测方法有杂交法、PCR (聚合酶链反应)、COBASAmplicor技术和bDNA等技术。使用COBAS Amplicor检测HBV DNA是国际公认的PCR定量方法的金标准，具有良好的准确性和重复性。其主要特点是由于采用了内对照，能有效地监控病毒核酸的抽提、扩增的效率，能够消除反应体系中干扰因素的影响，因此可以比较客观地反映标本初始状态时靶核酸的含量。但由于其配套试剂极其昂贵，很难在临床实验室推广使用。bDNA在HBV DNA定量测定中线性范围的下限较高，因而其临床应用价值也有限。杂交法是基于核酸分子组成的碱基可通过配对互补结合。带有标记物的DNA或RNA片段能与互补的核酸序列特异结合，这种片段称为核酸探针。HBV的核酸探针有DNA探针和RNA探针两种。核酸探针法的主要特点是敏感性、特异性都较强，但检测灵敏度低。PCR法包括有巢式聚合酶链式反应(nested PCR，nPCR)、多重PCR(multiplex PCR，mPCR)、竞争性PCR(competitive PCR, cPCR)等多种方法。nPCR为定性检测方法，不能直接定量，其产物需要通过凝胶电泳来定性判断；mPCR法节省时间和试剂，能为临床提供更多更准确的诊断信息，但需设计多条引物，产物也需要通过进行凝胶电泳来判断；cPCR的优点是能有效地控制不同反应管问扩增效率的差异，并且靶基因浓度的适应范围较大，但该 方法在整个操作过程中需进行凝胶电泳、Southern blot以及标记的同位素探针来进行定量分析，虽然敏感性高，但检测条件不易于标准化。最新出现的实时荧光定量PCR把核酸扩增、杂交、光谱分析和实时检测技术结合在一起，借助于荧光信号检测PCR产物，解决了传统PCR技术不能定量和扩增产物污染的问题，避免了普通定量PCR操作过程中的污染，使其操作简便、快捷，结果准确，已成为基因表达定量的强有力的工具，具有敏感性和特异性高、重复性好及定量范围广等特点。定量检测要求检测方法敏感、特异、准确、精确、重复性好、线性范围广，且在各个基因型之间无差异。而全自动的荧光定量PCR因其更优异的准确性、精确度和可重复性，成为最有前景的定量检测技术。实时突光定量PCR 技术(real-time fluorescent quantitative PCR, FQ-PCR)于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，它是一种在PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的突光探针,该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告突光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；刚开始时，探针结合在DNA任一一条单链上；PCR扩增时，Taq酶的5’端一 3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。该技术不仅实现了对DNA模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能快速、高敏感度的检测血清、血浆HBV DNA的荧光定量PCR检测试剂盒。所述的试剂盒包括荧光定量反应液预混液(PCR Master Mix)、荧光定量反应液、阳性对照样品。本发明采用锁核酸(locked nucleic acid，LNA)技术合成覆盖HBV基因核酸片断的锁核苷酸序列探针，结合荧光定量PCR技术，研制一种快速、高度灵敏的检测HBV基因荧光定量PCR试剂盒。本发明所述的试剂盒包括荧光定量反应液预混液(PCR Master Mix)、荧光定量反应液、阳性对照样品。荧光定量反应液含有正、反引物和荧光标记的HBV - DNA锁核苷酸探针。正向引物(HBV-ForwardPrimer)序列为SEQ ID NO: I (5，-CCTATGGGAGTGGGCCTCA-3，)；反向引物(HBV-ReversePrimer)序列为SEQ ID NO: 2 (5，-CATCCATATAACTGAAAGCCAAACAGT-3，)； 突光探针(HBV-Taqman-Probe)序列为SEQ ID NO: 3 (5’-FAM-CTAGTGCCATTTGTTC-MGB-3’)其 5'端标记 FAM (荧光报告基团)，3^端标记MGB (荧光淬灭基团)。阳性对照样品A :包含所检测HBV基因组片断DNA质粒。HBV脱氧核糖核酸荧光定量PCR检测试剂盒的原理为采用荧光定量PCR方法对HBV进行定量检测。针对HBV基因序列特异设计TaqMan探针及引物一对，当遇到HBV特定基因序列时，TaqMan探针可与之完全结合，PCR扩增时，荧光报告基团因酶解分离而发出荧光，能够实时检测相应荧光信号的积累，从而实现检测HBV含量的目的。本发明采用的TaqMan-MGB探针与传统的TaqMan-TAMRA探针相比较，MGB探针具有提高TM值，使探针的长度缩短，并且提高配对与非配对模板间的TM值差异；提高信噪比，使实验结果更精确，分辨率更高；更简化实验，MGB探针实验优化步骤简单，杂交的稳定性大大提高，重复性大大提高等优势。本发明提供的两端都标有突光发光基团的特异性突光探针，在探针完整时，两基团在空间结构上距离相互靠近，5'端报告基团发出的荧光因为荧光共振能量转移(FRET)而被3'端淬灭基团淬灭，所以体系中没有荧光信号的变化。而一旦它与模板特异性的结合，其结合位点在两条引物之间，随着引物的延伸，Taq DNA聚合酶在链延伸过程中遇到与模板相结合的探针，其5' -3'外切酶活性就会将探针切断，荧光报告基团远离荧光淬灭基团，这样就破坏了两荧光基团之间的FRET，报告基团所释放出来的荧光就可以被内置在定量检测仪内的荧光计检测到。PCR每经过一个循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程，荧光信号的强弱就代表了模板DNA的拷贝数的多少。因此本发明不仅可用于简单的定性检测，亦可用做样本具体含量的定量检测。与免疫学检测HBV病毒的试剂盒相比，以及与常规荧光定量PCR检测HBV — DNA基因的试剂盒相比，本发明所述的试剂盒具有以下优势I.高度灵敏灵敏度达10个基因拷贝数每微升检测样品，10倍优于普通荧光定量PCR 法；2.检测时间短(从标本送检到得出结果可在12个小时以内完成)；3.操作过程简单，并且从PCR反应开始，就是在封闭的体系中完成扩增和实时测定，大大降低了污染的可能性，因此也就降低了结果偏差的几率；4.本技术对标本DNA获取的质量要求较低，无论是血清、血浆、石蜡组织还是新鲜组织，都能取得理想的检测结果；5.检测的样本量大，一次实验最多可检测384例；6.安全整个体系中不包含有毒有害物质，对操作员和环境都无危害。
本发明所述的试剂盒是新一代的HBV DNA荧光定量PCR检测试剂盒，利用目前最先进的锁核苷酸技术，使HBV DNA的定量检测灵敏度较普通的定量PCR提高10 — 100倍，一方面，可以用于乙型肝炎诊断治疗、预后判断、监测肝癌治疗后复发和转移等临床应用；另一方面可以通过动态检测患者体内HBV DNA水平，评价病人体内HBV感染的程度，从而评价病人免疫力变化动态。
图I是采用本发明所述的试剂盒检测浓度为IO4 — IO7拷贝/微升HBV DNA标准品的荧光定量PCR曲线图。图中，从左到右，分别为IO7拷贝/微升、IO6拷贝/微升、IO5拷贝/微升、IO4拷贝/微升的HCV RNA荧光定量PCR扩增曲线。图2是本发明所述的试剂盒检测部分阳性标本的FQ-PCR曲线图。 上述附图均为检测仪器自带软件的原始检测图，图中横坐标英文含义为“PCR循环数”，纵坐标英文含义为“扩增反应的荧光值”。
具体实施例方式实施例I :本发明所述的试剂盒对于标准样品的灵敏度采用本发明所述的荧光定量PCR检测试剂盒检测浓度分别为IO4拷贝/微升、IO5拷贝/微升、IO6拷贝/微升、IO7拷贝/微升的HBV DNA标准品。本实验的标准品为宝生物工程(大连)有限公司合成的质粒DNA。本发明所述的试剂盒含有专门设计的能特异性检测HBV DNA的荧光探针及引物一对正向引物(HBV-ForwardPrimer)5， -CCTATGGGAGTGGGCCTCA-3’反向引物(HBV-ReversePrimer)5， -CATCCATATAACTGAAAGCCAAACAGT-3，突光探针(HBV-Taqman-Probe):5’ -FAM-CTAGTGCCATTTGTTC-MGB-3’然后优化反应体系进行FQ-PCR的检测，荧光定量反应在ABI7900检测仪上进行，反应体系为15μ 1，正、反引物各O. 15μ I (20μ Μ)，探针各0.2μ I (20μΜ)，模板DNA
2.5 μ I (100-300ng/ μ I), 2*Taqman universal PCR Master Mix (购自美国应用生物公司)7· 5μ 1，ddH20 4· 3μ I。PCR扩增反应程序95°C预变性30秒；并按95°C 5秒，60°C 33秒，扩增反应40次循环。结果为从左到右，分别为IO7拷贝/微升、IO6拷贝/微升、IO5拷贝/微升、IO4拷贝/微升的HBV RNA荧光定量PCR扩增曲线。本实验初步确定本发明所述的试剂盒具备较高的敏感性和特异性，假阳性低。实施例2 :本发明所述的试剂盒对于临床样品的灵敏度采用本发明所述的荧光定量PCR检测试剂盒对30例临床标本(来源于中山大学肿瘤医院含有乙肝病毒的患者血清)进行检测。
采用本发明所述的荧光定量PCR检测试剂盒对30例临床标本进行检测。本发明所述的试剂盒含有专门设计的能特异性检测HBV DNA的荧光探针及引物一对正向引物(HBV-ForwardPrimer)5， -CCTATGGGAGTGGGCCTCA-3’反向引物(HBV-ReversePrimer)5， -CATCCATATAACTGAAAGCCAAACAGT-3，荧光探针(HBV-Taqman-Probe)
5’ -FAM-CTAGTGCCATTTGTTC-MGB-3’然后优化反应体系进行FQ-PCR的检测，荧光定量反应在ABI7900检测仪上进行，反应体系为15μ 1，正、反引物各O. 15μ I (20μ Μ)，探针各0.2μ I (20μΜ)，模板DNA
2.5 μ I (100-300ng/ μ I), 2*Taqman universal PCR Master Mix (购自美国应用生物公司)7.5 μ 1，ddH20 4.3 μ I。PCR 反应条件95°C预变性 30 秒；并按 95°C 5 秒，60°C 33 秒，扩增反应40次循环。结果为编号分别为2、7、13、24、25、28的样本对应检测孔有扩增曲线，检测结果为阳性，荧光定量PCR检测结果如图2所示，表明本试剂盒的检测结果具有极高的的特异性和可靠性。综上所述，本发明所述的试剂盒不仅是快速、高效的，而且其结果的判读非常明确、直观，结果可靠、特异的。
权利要求
1.一种乙型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒，包括荧光定量反应液预混液、荧光定量反应液、阳性对照样品，其特征在于 所述荧光定量反应液包括含有检测HBV DNA的正、反引物和锁核苷酸探针的反应体系，其中，正向引物序列为SEQ ID NO: 1，反向引物序列为SEQ ID NO: 2，荧光探针序列为SEQ IDN0:3，其5'端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团； 阳性对照样品A :包含所检测HBV基因组片断DNA质粒。
2.根据权利要求I所述的乙型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于所述荧光探针的5'端标记的荧光报告基团是FAM。
3.根据权利要求I所述的乙型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于所述荧光探针的3'端标记的荧光淬灭基团是MGB。
全文摘要
本发明涉及一种乙型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒。所述的试剂盒包括荧光定量反应液预混液、荧光定量反应液、阳性对照样品。所述荧光定量反应液包括含有检测HBV DNA的正、反引物和锁核苷酸探针的反应体系，其中，正向引物序列为SEQ ID NO:1，反向引物序列为SEQ ID NO:2，荧光探针序列为SEQ ID NO:3，其5′端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团；阳性对照样品A包含所检测HBV基因组片断DNA质粒。本发明提供了一种检测乙型肝炎病毒核酸荧光定量PCR试剂盒，适用于各种组织、细胞、血液及其它体液中的乙型肝炎病毒核酸的定量检测。
文档编号C12Q1/68GK102816872SQ20121033314
公开日2012年12月12日 申请日期2012年9月10日 优先权日2012年9月10日
发明者邵琦 申请人:广州达健生物科技有限公司