分离核酸的方法及装置制造方法
分离核酸的方法及装置制造方法
【专利摘要】一种分离核酸的方法包括：将含有核酸的样品溶液加至石英纤维滤纸的样品接收部；使缓冲溶液沿着石英纤维滤纸长度方向扩散、通过样品接收部，从而把核酸根据其分子量不同而在石英纤维滤纸上进行定位。本发明还涉及相关的分离核酸的装置。
【专利说明】分离核酸的方法及装置
【技术领域】
[0001]本发明涉及分离核酸的方法及装置。
【背景技术】
[0002]核酸应用于医学和生物学等领域。核酸的体外操作和分析之前通常需要将其与其他不需要的杂质分离开来，以避免影响后续体外操作和分析过程。
[0003]不同分子量的核酸提供由于不同的原因而重要的信息。例如，脱氧核糖核酸提供关于基因先天和后天突变/局部重排方面的重要信息。和脱氧核糖核酸相反，核糖核酸则反映细胞的生物学“快照”，因为它们总是跟随周围环境持续变化。 [0004]在某些应用中，如果能够从单个生物样本中将核酸根据分子量的不同而进行分离，对生物样本的收集和后续分析将会得到大幅简化。在生物样本非常小的时候，例如活组织切片检查时，很难将该生物样本进一步分解成对分子量不同的核酸进行各自分离的更小的生物样本，从同一个生物样本同时分离出不同分子量的核酸尤为重要。
[0005]现有各种不同隔离/分离/纯化核酸的技术。例如，国际专利申请公开第2007/104962号介绍了一种将液体样本沿吸水膜流动以使核酸沿着膜的长度分布从而从液体样品中分离的方法。
[0006]美国专利申请公开第2009/0143570号涉及一种分离从基因组脱氧核糖核酸、核糖核酸和蛋白质中选出的至少两种细胞成分的方法，其包括:把包含细胞成分的水溶液施加至第一固体支撑来吸附基因组脱氧核糖核酸；和把包含没有被吸附的核糖核酸和蛋白质的通过物施加至第二固体支撑来吸附核糖核酸。
[0007]对于核酸使用的增加创造了对于快速、简便和可靠的核酸分离方法和装置的需求，因此，有必要开发新的分离核酸的方法及装置。
【发明内容】
[0008]本发明的目的是提供一种新的分离核酸的方法及装置。
[0009]一方面，本发明涉及的分离核酸的方法包括:将含有核酸的样品溶液加至石英纤维滤纸的样品接收部；使缓冲溶液沿着石英纤维滤纸长度方向扩散、通过样品接收部，从而把核酸根据其分子量不同而在石英纤维滤纸上进行定位。
[0010]另一方面，本发明涉及的分离核酸的装置包括:石英纤维滤纸，其包括:样品接收部，其接收含有核酸的样品溶液；以及定位部，其在缓冲溶液沿着石英纤维滤纸长度方向扩散、通过样品接收部之后定位相应分子量的核酸。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]通过结合附图对于本发明的实施例进行描述，可以更好地理解本发明，在附图中:
[0012]图1是根据本发明的第一实施例所提供的装置的示意图。[0013]图2是根据本发明的第二实施例所提供的装置的示意图。
[0014]图3是根据本发明的第三实施例所提供的装置的示意图。
[0015]图4是根据本发明的第四实施例所提供的装置的示意图。
[0016]图5是例I中获得的电泳图像。
[0017]图6为例2中获得的电泳图像。
[0018]图7为例3中获得的电泳图像。
[0019]图8为例4中获得的电泳图像。
[0020]图9为图3所示装置和例5中获得的电泳图像。
[0021]图10为图4所示装置和例6中获得的电泳图像。
【具体实施方式】
[0022]在下文中，将根据【专利附图】
【附图说明】本发明的实施方式，将不会详细描述众所周知的功能和结构，以避免因不必要的细节而使本发明变得令人费解。
[0023]除非另作说明，本文使用的技术术语或者科学术语为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。本发明专利申请说明书以及权利要求书中使用的“第一”、“第二”、“第三”以及类似的词语并不表示任何顺序、数量或者重要性，而只是用来区分不同的组成部分。“包括”、“含有”、或者“包含”等类似的词语意指出现在“包括”、“含有”、或者“包含”前面的元件或者物件涵盖出现在“包括”、“含有”、或者“包含”后面列举的元件或者物件及其等同，并不排除其他元件或者物件。尽管“连接”、“邻接”、或者“相连”等类似的词语常用于描述物理的或者机械的连接，但并非限定于此，而且包括直接的或间接的连接。
[0024]说明书中的近似用语用来修饰数量，表示本发明并不限定于该具体数量，还包括与该数量接近的可接受的而不会导致相关基本功能的改变的修正的部分。相应的，用“大约”、“约”等修饰一个数值，意为本发明不限于该精确数值。在某些例子中，近似用语可能对应于测量数值的仪器的精度。
[0025]在以下的说明书和权利要求中，除非清楚地另外指出，单复数不加以限制。
[0026]本申请所提及的“可”、“可能”和“可为”表示在一定环境下发生的可能性；具有指定的性质，特征或者功能的可能性；和/或通过显示一个或者多个能力、性能而适合于另一种动作，或者与该适合的动作相关的可能性。因此，用于“可”、“可能”和“可为”表示修饰的术语显然适合、能够或者适于所表示的能力，功能，或者用途，同时考虑在一些情况下，所修饰的术语可能有时不适合、不能或者不合适。例如，在一些情况下，事件或者能力可能是所期望的，而在其它情况下，该事件或者能力不能发生。这种区别通过术语“可”、“可能”和“可为”涵盖。
[0027]本发明涉及从生物样本把核酸与不需要的杂质分离及/或从单一生物样本把核酸根据不同分子量互相分离的方法和装置。本发明涉及的方法和装置不需要使用昂贵的离心分尚设备且分尚时间较短。
[0028]本发明中“分离”指的是从样品溶液把核酸与不需要的杂质分离及/或从单一生物样本把核酸根据不同分子量互相分离而进行的隔离或纯化核酸的行为或行动。
[0029]本发明中“核酸”是指脱氧核糖核酸、核糖核酸、或其组合。分离得到的核酸可包括单一类型的核酸或2个以上不同类型的核酸。分离得到的核酸可为单链、双链、线性或环状。分离得到的核酸的分子量也没有限制，其在一些实施例中可在几个碱基对(base pair,bp)到几百万bp的范围内。
[0030]本发明提及的“生物样本”这一术语是广义上的，而且意在涵盖各种包含核酸的生理或临床生物资源。这样的生物资源包括，但不限于，整体组织，包括活检材料和吸出物；体外培养细胞，包括初级细胞和次级细胞、转化细胞系、及组织细胞和血细胞；体液，如尿液、唾液、精液、分泌物、眼睛清洗和吸出物、肺清洗和吸出物；合成脱氧核糖核酸或核糖核酸的介质；化学法或生物法合成的脱氧核糖核酸或核糖核酸的混合物；真菌和植物组织，例如叶、根、茎和菌盖；可存在于生物样本上或里的微生物和病毒；以及其他任何脱氧核糖核酸和/或核糖核酸存在或 可存在的资源。
[0031]样品溶液 可为以溶解、悬浮、混合或其他方式包含脱氧核糖核酸、核糖核酸或其组合，或含有脱氧核糖核酸、核糖核酸或其组合的细胞、细胞成分或细胞提取物的溶液。样品溶液可从生物样本制备而得。
[0032]从生物样本制备含有核酸的样品溶液的一个示例方法包括使用包含离液物(chaotropic substances)及/或其他试剂的溶解试剂对生物样本进行溶解的步骤,实施这个步骤最简单的方法是把生物样本与溶解试剂相接触。溶解试剂中离液物的浓度可为约
0.1摩尔/升至约10摩尔/升，例如约I摩尔/升至约10摩尔/升。
[0033]本发明提及的离液物是指一种能够通过例如改变核酸的二级、三级、四级结构，保留一级结构完整等方式造成核酸无序的物质。离液物的示例包括但不限于，盐酸胍、异硫氰酸胍/硫氰酸胍、硫氰酸钠、高氯酸钠、碘化钠、碘化钾、尿素、和/或这些物质的任何组合。一种典型的离液阴离子系列，按照离液能力递减的顺序排列如下:CC13C00_、CNS—、CF3COO'ClO4-，I- 、CH3COO' Br' Cl' CHO2'
[0034]对于某些生物样本，如细菌，溶解试剂可包含分解酶，或者，对该生物样本在溶解前例如用分解酶进行预处理。
[0035]—些实施例中,溶解试剂包括足量的缓冲液。在溶解试剂中使用的缓冲液示例包括三_(羟甲基)甲胺盐酸盐(三-盐酸)、磷酸钠、醋酸钠、四硼酸钠-硼酸和甘氨酸-氢氧化钠。
[0036]一些实施例中，溶解试剂包括还原剂，该还原剂能够促进离液物对核糖核酸酶的变性和帮助未降解核糖核酸的分离。还原剂示例包括但不限于，2-氨基乙硫醇、三-羧基乙
基磷化氢及巯基乙醇。
[0037]—些实施例中，溶解试剂包括非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、两性表面活性剂、及\或各种表面活性剂的任意组合。非离子表面活性剂的示例包括但不限于聚氧亚乙基辛基苯基醚(Triton? X-100)、(辛基苯氧基)聚乙氧乙醇(IGEPAL?CA-630/NP-40)、三乙烯基乙二醇单月桂醇醚(BRIJ? 30)，山梨醇酐月桂酸酯(SPAN? 20)，或者聚山梨醇酯化合物家族，例如聚山梨醇酯20 (即TWEEN? 20)、TWEEN? 40、TWEEN?60和TWEEN? 80(Sigma-Aldrich公司，美国密苏里州圣路易斯市)。阳离子表面活性剂的示例包括溴化十六烷基三甲基铵、氯化十二烷基三甲基铵、氯化十四烷基三甲基铵和氯化十六烷基吡啶。
[0038]溶解试剂中表面活性剂的浓度随表面活性剂的种类和待溶解生物样本中成分的不同而变化。一些实施例中，表面活性剂的重量浓度可为约0.1%到约20%。[0039]—些实施例中，溶解试剂包含蛋白酶，其为例如丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和金属蛋白酶等中的至少一种。可用不含核酸酶的蛋白酶。包含如金属离子等稳定剂的蛋白酶，也可用。蛋白酶的用量可为添加后每毫升溶解试剂的约0.001IU到约10IU、或者约0.01IU 到约 IIUo
[0040]一些实施例中，溶解试剂含脱氧核糖核酸分解酶抑制剂及/或核糖核酸分解酶抑制剂。
[0041] 一些实施例中，溶解试剂包含消泡剂。消泡剂的示例包括含硅消泡剂(如硅油、二甲基聚硅氧烷、有机硅乳液，改性聚硅氧烷和有机硅化合物)、醇类消泡剂(例如乙炔二醇、庚醇、辛醇，高碳醇和聚氧化亚烷基二醇)、醚类消泡剂(例如，庚基溶纤剂和壬基溶纤剂-3-庚基山梨糖醇)、脂肪和油类消泡剂(如动物油和植物油)、脂肪酸类消泡剂(例如，硬脂酸，油酸和棕榈酸)、金属皂类消泡剂(例如，硬脂酸铝和硬脂酸钙)、脂肪酸酯类消泡剂(例如，天然蜡和磷酸三丁酯)、磷酸盐类消泡剂(例如，辛基磷酸钠)、胺类消泡剂(例如二戊基胺)、酰胺类消泡剂(例如，硬脂酸酰胺)、其他消泡剂(如硫酸铁和钒土 )、和各种消泡剂的任意可能组合。
[0042]一些实施例中，溶解试剂包含醇，其可为伯醇、仲醇及叔醇，如甲醇、乙醇、丙醇及其同分异构体、和丁醇及其同分异构体等。溶解试剂中醇的重量浓度，可为约5%到约90%。
[0043]一些实施例中，溶解试剂为 11 lustra? RNAspin Mini kit (cat#25-0500-71)中的RAl溶解缓冲液，其中加入了 2-β -巯基乙醇(cas#60-24-2)。
[0044]制备含有核酸的样品溶液的方法可以借助例如超声波处理、尖锐突出物处理、或高速搅拌或振荡处理等技术手段。
[0045]请参图1，根据本发明的第一实施例所提供的装置70包括:长条形石英纤维滤纸72，其包括第一尾部74、缓冲溶液载入部76、样品接收部78、和与第一尾部74相反的第二尾部79。缓冲溶液载入部76相对于第二尾部79更靠近第一尾部74。样品接收部78比缓冲溶液载入部76更接近第二尾部79。
[0046]参照图2，根据本发明的第二实施例所提供的装置I包括样品垫2和与样品垫2在长度方向上相连的收集垫3。样品垫2是与图1中石英纤维滤纸72相似的石英纤维滤纸，其包括第一尾部5、样品接收部4、和与第一尾部5相反的第二尾部(未标记)。收集垫3可为石英纤维滤纸或者终止垫，其与样品垫2的第二尾部连接。
[0047]参照图3，根据本发明的第三实施例所提供的装置10包括样品垫12和与样品垫12在长度方向上相连的吸液垫13。样品垫12是与图1中石英纤维滤纸72相似的石英纤维滤纸，其包括第一尾部15、缓冲溶液载入部17、样品接收部14、和与第一尾部15相反的第二尾部16。缓冲溶液载入部17相对于第二尾部16更靠近第一尾部15。样品接收部14比缓冲溶液载入部17更接近第二尾部16。
[0048]参照图4，根据本发明的第四实施例所提供的装置100包括样品垫170、与样品垫170在长度方向上相连的终止垫180、和与终止垫180在长度方向上连接的吸液垫130。样品垫170是与图1中石英纤维滤纸72相似的石英纤维滤纸，其包括第一尾部150、缓冲溶液载入部120、样品接收部140、和与第一尾部150相反的第二尾部160。缓冲溶液载入部120相对于第二尾部160更靠近第一尾部150。样品接收部140比缓冲溶液载入部120更接近第二尾部160。
[0049]石英纤维滤纸72、2、12、170可为任何吸着样品溶液且不抑制核酸的储存或后续分析的多孔吸液石英纤维滤纸。一些实施例中，石英纤维滤纸72、2、12、170由无粘结剂的纯石英纤维制成。一些实施例中，石英纤维滤纸72、2、12、170对颗粒大小不小于2.2微米的粒子阻止通过效率为约98%，基础重量为约85g/m2，厚度范围为约300微米到约600微米。可应用于本发明的石英纤维滤纸的示例，包括但不限于可从美国新泽西州通用电气医疗公司购得的Whatman" grade QM-A石英微纤维滤纸以及可从美国马萨诸塞州Millipore公司购得的AQFA石英纤维滤纸。
[0050]含有核酸的样品溶液施加到石英纤维滤纸72、2、12、170的样品接收部78、4、14、140。样品接收部78、4、14、140可为能接收样品溶液的任何形状或构造。一些实施例中，石英纤维滤纸72、2、12、170的样品接收部78、4、14、140包含溶解试剂，生物样本则可以直接应用于样品接收部78、4、14、140。在这些情况下，生物样本就是含有核酸的样品溶液。
[0051]缓冲溶液可以是核酸的任何溶剂。一些实施例中，缓冲溶液是三(羟甲基)氨基甲烷乙二胺四乙酸(TE)缓冲溶液，和用羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)替换三(羟甲基)氨基甲烷后的磷酸盐缓冲溶液和TE缓冲溶液中的至少一种。
[0052]缓冲溶液沿着石英纤维滤纸72、2、12、170长度方向扩散并通过样品接收部78、4、
14、140。缓冲溶液载入部可为能接收缓冲溶液的任何形状或构造。一些实施例中，缓冲溶液施加至缓冲溶液载入部76、17、120。一些实施例中，第一尾部5被浸于缓冲溶液中，从而缓冲溶液从第一尾部5开始扩散，在此情况下，第一尾部5就是缓冲溶液载入部。
`[0053]终止垫3、180是由不同于石英纤维滤纸的材料所制成的细长条。一些实施例中，终止垫3、180是由纤维素制成，如为Whatman? grade 31ET纸。
[0054]吸液垫13、130由吸液材料制得，如纤维素、二氧化硅微纤维滤纸、和玻璃纤维。一些实施例中，吸液垫13、130是由美国新泽西州的通用电气医疗公司提供的Whatman?grade 470特殊用途滤纸所制得。
[0055]从后述实验示例可以看出，在缓冲溶液沿着石英纤维滤纸72、2、12、170长度方向扩散、通过样品接收部78、4、14、140之后，核酸在石英纤微滤纸72、2、12、170上根据分子量的不同而定位。具体而言，分子量高的核酸与分子量低的核酸相比，其定位于距离样品接收部78、4、14、140更近的地方。
[0056]一些实施例中，大部分具有第一分子量的核酸被定位于样品接收部78、4、14、140附近。在这种情况下，样品接收部78、4、14、140是具有第一分子量的核酸的定位部。一些实施例中，第一分子量是指在至少约5万个碱基对(50kilo base pairs, 50kb)或从约50kb到约150kb的范围内。一些实施例中，约50kb是指50kb±15kb的范围。
[0057]一些实施例中，大部分具有第二分子量的核酸被定位于第二尾部79、6、16、160附近。在这种情况下，第二尾部79、6、16、160是具有第二分子量的核酸的定位部。一些实施例中，第二分子量是在小于约50kb的范围内。
[0058]一些实施例中，终止垫180、3 (当收集垫3为终止垫时)和石英纤维滤纸170、2相邻，在缓冲溶液沿着石英纤维滤纸170、2长度方向扩散、通过样品接收部140、4之后，大部分随缓冲溶液迁移的核酸被定位在样品垫170、2和终止垫180、3之间的界面。
[0059]一些实施例中，核酸定位于样品接收部78、4、14、140和第二尾部79、6、16、160之间，从而这些核酸的定位部位于样品接收部78、4、14、140和第二尾部79、6、16、160之间。
[0060]一些实施例中，在缓冲溶液扩散之前，使清洗液沿着石英纤维滤纸72、2、12、170长度方向扩散、通过样品接收部78、4、14、140。清洗液在没有外力仅靠毛细作用的情况下在石英纤维滤纸上扩散、带走在石英纤维滤纸上吸着能力比核酸低的杂质，以将核酸与样品溶液中不需要的杂质相分离。
[0061]含有核酸的样品溶液、清洗液和缓冲溶液可用管子、移液管、自动注入装置、或任何其他适用的方法或工具添加到石英纤维滤纸上。
[0062]清洗液可包括能分解杂质(例如蛋白质)的酶。此外，它可根据需要包括脱氧核糖核酸酶、核糖核酸酶或类似物。包含脱氧核糖核酸酶的清洗液的使用可有助于核糖核酸的选择性回收。同样，包含核糖核酸酶的清洗液可有助于选择性的回收脱氧核糖核酸。
[0063]清洗液可包括水溶性有机溶剂和/或水溶性盐。清洗液洗出样品溶液中与核酸一起吸着在石英光纤滤纸上的杂质。因此，它可含有将杂质从石英纤维滤纸脱吸的同时让核酸保持吸着的成分。核酸难溶的水溶性有机溶剂，如醇类，适合从石英纤维滤纸解吸核酸以外的其他成分。与此同时，水溶性盐的纳入可增强核酸的吸附，协助对不必要的杂质的选择性解吸。
[0064]清洗液中的水溶性有机溶剂的示例包括甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇、正丁醇和丙酮，其中乙醇较为合适。水溶性有机溶剂在清洗液中的重量浓度可为约20%至100%或约40% 到约 100%。[0065]清洗液中的水溶性盐可为卤化盐或三(羟甲基)氨基甲烷。
[0066]一些实施例中，清洗液为含80%乙醇的TE缓冲溶液。
[0067]清洗液可与含有核酸的样品溶液在石英纤维滤纸的添加位置相同，即都在样品接收部添加，或者与缓冲溶液在石英纤维滤纸的添加位置相同，即都在缓冲溶液载入部添加。清洗液也可从石英纤维滤纸上不同于样品接收部和缓冲溶液载入部的位置添加。
[0068]一些实施例中，清洗液扩散至第二尾部79、6、16、160，把样品溶液中不需要的杂质带至第二尾部79、6、16、160。再在缓冲溶液扩散之前切除第二尾部79、6、16、160。通过这种方式，被定位在残余石英纤维滤纸上的核酸为将不需要的杂质提纯/分离/隔离后的核酸。
[0069]一些实施例中，在清洗液通过样品接收部4、沿着石英纤维滤纸2长度方向、朝向收集垫3 (终止垫、吸液垫或石英纤维滤纸)及装置I的第二尾部6扩散之后，更换收集垫3，从而使缓冲溶液从样品垫2扩散至更换的收集垫3。
[0070]石英纤维滤纸72、1、12、170，收集垫3，吸液垫13、130，终止垫180可由如聚酯(Mylar?)或聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)等塑料材料之类的背衬材料提供支撑。
[0071]一些实施例中，装置70、1、10、100包含塑料壳体(未图示)，其将石英纤维滤纸72、
1、12、170，收集垫3，吸液垫13、130，终止垫180包覆于其内，但用相应开孔将样品接收部78、4、14、140和/或缓冲溶液载入部76、5、17、120暴露，从而使含有核酸的样品溶液、清洗液以及缓冲溶液可以被添加到样品接收部78、4、14、140和/或缓冲溶液载入部76、5、17、120。一些实施例中，样品接收部78、4、14、140和/或缓冲溶液载入部76、5、17、120可位于壳体之外。
[0072]本发明的装置70、1、10、100可为一个简单的核酸纯化、分离设备，也可为整个核酸分析设备/仪器组件的组成部分。
[0073]在缓冲溶液扩散之后，可将定位在石英纤维滤纸上的核酸在低离子强度或用水的条件下进行洗提等后续处理。
[0074]本发明中“吸着”是指样品溶液被吸收、吸附或掺入或掺到样品接收部，使得不容易从样品接收部移除，除非有意或不慎达到从样品接收部移除吸着的组成的条件。
[0075]本发明中“大部分”是指达到总量的至少约15%、至少约50%、或至少约90%。举例而言，“大部分具有第一分子量的核酸被定位在样品接收部附近”是指具有第一分子量并且定位于样品接收部的核酸，可为吸着于样品接收部的样品溶液中具有第一分子量的核酸总量的至少约15%、至少约50%、或至少约90%。类似地，“大部分具有第二分子量的核酸被定位在第二尾部附近”是指具有第二分子量并且定位于第二尾部的核酸，可为吸着于样品接收部的样品溶液中具有第二分子量的核酸总量的至少约15%、至少约50%、或至少约90%。
[0076]石英纤维滤纸的多孔性所固有的毛细作用力作为使清洗液和/或缓冲溶液沿着石英纤维滤纸扩散、通过样品接收部的动力。吸液垫13、130依靠其强大的毛细作用力吸引清洗液和/或缓冲溶液朝向吸附垫13、130扩散。基于杂质与核酸对于多孔石英纤维滤纸的吸着力不同，清洗液和/或缓冲溶液带走杂质，核酸与样品溶液中杂质充分分离，消除了对产生外部动力(如离心力和压力)的仪器和具有特定技能的人才的需求，使在偏远地区的现场分离成为可能。
[0077]缓冲溶液沿着石英纤维滤纸长度方向扩散、通过样品接收部，使核酸在石英纤维滤纸上迁移，分子量越低，核酸从样品接收部迁移的距离越远。当缓冲溶液从石英纤维滤纸扩散到由不同于石英纤维滤纸材料制成的终止垫或吸液垫时，随着缓冲溶液迁移的核酸将停止且定位于石英纤维滤纸和终止垫或吸液垫之间的界面。因此，通过缓冲溶液扩散，将核酸以分子量大小定位在石英纤维滤纸的相应的位置，即可达到分离核酸与杂质及/或不同分子量核酸的目的。`
[0078]实验示例
[0079]下述实验示例为本【技术领域】内的技术人员实施本发明提供进一步的指导。示例并不限定权利要求书中界定的本发明的范围。
[0080]例I脱氧核糖核酸尺寸分析
[0081]小鼠基因组脱氧核糖核酸溶液(5ul，来自中国北京的康为世纪生物科技有限公司)和5ul人类基因组脱氧核糖核酸溶液(来自美国加州的Clontech Laboratories, Inc.)被置于两个分离的含有1%琼脂糖胶的样品槽来进行脉冲场凝胶电泳。
[0082]脉冲场凝胶电泳是由Bio-rad实验室的CHEF Mapper" XA系统在电压为6v/cm且温度为10° C的环境里进行24小时。电泳之后，琼脂糖胶被IxSYBR Green I溶液染色5小时，之后使用美国新泽西州通用电气医疗公司提供的Typhoon? Trio?多模式成像仪显影。
[0083]脉冲场凝胶电泳图像如图5所示。在图5中，泳道1、III表征MidRange 11 PFG标记，泳道II表征5ul小鼠基因组脱氧核糖核酸溶液，泳道IV表征5ul人类基因组脱氧核糖核酸溶液。
[0084]从图5中可以看出，小鼠基因组脱氧核糖核酸的分子量小于约50kb，而人类基因组脱氧核糖核酸至少为约50kb且在约50kb到约150kb的范围内。[0085]例2低分子量(< 50kb)脱氧核糖核酸
[0086]请参照图2，装置I (宽4mm，长5.5cm)包括样品垫2 (宽4mm，长2.5cm)和与样品垫2有5mm重叠长度的收集垫3 (宽4_，长3.5cm)。样品垫2和收集垫3都是从美国新泽西州通用电气医疗公司获得的Whatmanii grade QM-A石英微纤维滤纸。样品垫2的样品接收部4距离样品垫2的第一尾部5有1.5cm。
[0087]小鼠基因组脱氧核糖核酸样品溶液(2.5ul，100ng/ul，分子量< 50kb，同例I中所用)加入一支1.5ml的微离心管中，然后和2.5ul缓冲液(66.87%盐酸胍，4%Triton? X-100)混合。
[0088]在将混合物转移至样品垫2的样品接收部4之前，先将该微离心管摇晃约15秒。
[0089]5秒钟后，样品混合物被吸收，样品垫2的第一尾部5被置于一个96槽板的含有150ul清洗液(含80%乙醇的TE缓冲溶液(IOmM Tris pH8，0.1mMEDTA))的一个槽中来沿着装置长度方向扩散清洗液。
[0090]5分钟后，装置I被取出，样品垫2和收集垫3相分离，并在温度为37° C的烘箱中干燥10分钟。干燥之后，样品垫2按照上述相同方式和一个新的与用过的相同的收集垫3组装在一起。
[0091]第一尾部5置于一个96槽板的含有150ulTE缓冲溶液(IOmM Tris pH8，0.1mMEDTA)的槽中用来沿着装置I来扩散TE缓冲溶液。
[0092]5分钟后，装置I被取出，并在温度为37° C的烘箱中干燥30分钟。
[0093]干燥之后,装置I切成宽4mm、长5mm的小片。每一小片被分别置于含有0.8%琼脂糖胶的样品槽中。
[0094]在电压为120V的条件下电泳45分钟。电泳之后，用IxSYBR Green I染色琼脂糖胶1.5小时,之后使用Typhoon? Trio?多模式成像仪显影。
[0095]电泳图像如在图6中所示，图中第I至12泳道表征根据在装置I中位置所排列的第一尾部5到第二尾部6的小片，具体而言，第I至5泳道表征来自样品垫2的小片，第6至12泳道则表征来自收集垫3的小片，第13泳道是空白的，第14泳道表征脱氧核糖核酸标记(日本Takara DL15000)。该图像显示，在清洗液和TE缓冲溶液扩散之后，大部分小鼠基因组脱氧核糖核酸(分子量< 50kb)定位在装置I的第二尾部6附近(第11，12泳道)。换句话说，第二尾部6是本例中的定位部。
[0096]例3高分子量O 50kb)脱氧核糖核酸
[0097]重复例2的实验，但用人类基因组脱氧核糖核酸(分子量> 50kb，与例I中所用的同)取代例2中的小鼠基因组脱氧核糖核酸。
[0098]电泳图像如在图7中所示，图中第I至12泳道表征根据在装置I中位置所排列的第一尾部5到第二尾部6的小片，第I至5泳道是来自样品垫2的小片，第6至12泳道则为来自收集垫3的小片，第13泳道是表征脱氧核糖核酸标记(日本Takara DL15000)。
[0099]图像显示，在清洗液和TE缓冲溶液扩散之后，大部分人类基因组脱氧核糖核酸仍然保留在样品接收部4 (第3，4泳道)附近。换句话说，大部分人类基因组脱氧核糖核酸定位于样品接收部4，而样品接收部4是本例中的定位部。
[0100]例4闻分子量脱氧核糖核酸和低分子量脱氧核糖核酸
[0101]人类基因组脱氧核糖核酸样品溶液(2.5ul，100ng/ul，同例I中所用)加入一支1.5ml的微离心管中，然后与2.5ul脱氧核糖核酸标记(日本Takara DL15000，包括7个分子量:15kb、10kb、7.5kb、5kb、2.5kb、lkb、250bp)和 5ul 缓冲液(66.87% 盐酸胍，4%Triton?X-100)混合。
[0102]混合物用同例2中的相同的方式处理，但收集垫3是4cm长，且清洗液和TE缓冲溶液都是例2中两倍的量。
[0103]电泳图像如在图8中所示，图中第I泳道表征脱氧核糖核酸标记(日本TakaraDL15000)，第2至14泳道表征装置I从第一尾部5到第二尾部6的小片。
[0104]该图显示，在清洗液和TE缓冲溶液扩散之后，在样品接收部4 (第4泳道)附近仅有人类基因组脱氧核糖核酸，而且，在第二尾部6 (第14泳道)仅有低分子量的脱氧核糖核酸标记。也就是说，对于人类基因组脱氧核糖核酸，定位部是样品接收部4，对于低分子量的脱氧核糖核酸标记，第二尾部6是其定位部，而对于分子量介于定位于样品接收部4的核酸分子量和定位于第二尾部6的核酸分子量之间的核酸，其定位部介于第二尾部6和样品接收部4之间。
[0105]例5脱氧核糖核酸和核糖核酸
[0106]请参照图9，使用图3中的装置10，其包括一个样品垫12 (宽4mm，长6cm的Whatman' grade QM-A石英微纤维滤纸)，一个与样品垫12部分重叠的吸液垫13(Whatman? grade 470特殊用途滤纸)和一个将样品垫12和吸液垫13包覆的壳体(未图示，中国上海的上海杰一生物科技有限公司的A-1O塑料壳体)。
[0107]包含1.2xl06 细胞的融合组织培养物(干细胞培养物)被急速旋转并除去浮层介质。细胞粒与 35ul 的 Illustra? RNAspin Mini kit (cat#25-0500-71)的 RAl 溶解缓冲液和0.35ul的2-β -巯基乙醇(BME, cas#60-24_2)旋转混合。
[0108]通过壳体的一个开口(未图示)把5ul细胞溶解液加到与样品垫12的第一尾部15距离2.7cm的样品接收部14。在干燥之后，Iul的total Jurkat RNA(lug/ul)通过该开口加至样品接收部14。
[0109]不含脱氧核糖核酸酶/核糖核酸酶的TE缓冲溶液(150ul，IOmM Tris pH8，0.1mMEDTA)通过壳体的另一个开口(未图示)加至与样品垫12的第一尾部15距离为Icm的缓冲溶液载入部17，沿着装置10长度方向扩散。
[0110]10分钟之后，样品垫12从壳体取出并置于0.8%的琼脂糖胶。在IlOV的电压进行电泳45分钟。之后，用插入染料对琼脂糖胶染色I小时，再使用Typhoon? Trio?多模式成像仪显影。
[0111]核酸定位的结果显示在图9中，图中所示是按照与样品垫12中相应的位置排列的，但泳道A显示的是NEBlkb ladder,泳道B是与样品接收部14所接收的细胞溶解液和total Jurkat RNA用量完全相同的对照样本的显影，为作比较，此样本电泳前未经TE缓冲溶液扩散处理。
[0112]从图9可以看出，在TE缓冲溶液沿着装置10扩散之后，高分子量的脱氧核糖核酸(DNA)被定位在样品接收部14附近，而核糖核酸(RNA)成分迁移并被定位至第二尾部16。也就是说，样品接收部14是高分子量脱氧核糖核酸的定位部而第二尾部16是核糖核酸成分的定位部。
[0113]例6脱氧核糖核酸和核糖核酸[0114]请参照图10，应用图4中的装置100，其包含一个样品垫170 (宽4mm，长4cm的WhatmanK grade QM-A石英微纤维滤纸),一个与样品垫170部分重叠的终止垫180 (宽4mm,长2.5cm的WhatmanR grade 31ET纸)，一个与终止垫180部分重叠的吸液垫130(W hatnian? grade 470特殊用途滤纸)和一个将前述垫包覆的壳体(未图示，中国上海的上海杰一生物科技有限公司的A-1O塑料壳体)。
[0115]包含1.2x106细胞的融合组织培养物(干细胞培养物)被急速旋转并除去浮层介质。细胞粒与 35ul 的 Illustra? RNAspin Mini kit (cat#25-0500-71)的 RAl 溶解缓冲液和0.35ul的2-β -巯基乙醇(BME, cas#60-24_2)旋转混合。
[0116]通过壳体的一个开口(未图示)把5ul细胞溶解液加到与样品垫170的第一尾部150距离2.7cm的样品接收部140。在干燥之后，Iul的total Jurkat RNA (lug/ul)通过该开口加至样品接收部140。
[0117]150ul不含脱氧核糖核酸酶/核糖核酸酶的TE缓冲溶液(IOmM Tris pH8，0.1mMEDTA)通过壳体的另一个开口(未图示)加至与样品垫170的第一尾部150距离为Icm的缓冲溶液载入部120，沿着装置100长度方向扩散。
[0118]10分钟之后，样品垫170和终止垫180从壳体取出并置于0.8%的琼脂糖胶。在IlOV的电压进行电泳45分钟。之后，用插入染料对琼脂糖胶染色I小时，再使用Typhoon?Trio?多模式成像仪显影。
[0119]核酸定位的结果显示在图10中，图中所示是按照与样品垫170和终止垫180相应的位置排列的，但泳道D显示的是NEBlkb ladder,泳道C是与样品接收部140所接收的细胞溶解液和total Jurkat RNA用量完全相同的对照样本的显影，为作比较，此样本电泳前未经TE缓冲溶液扩散处理。
[0120]从图10可以看出，脱氧核糖核酸(DNA)被定位在样品接收部140附近，而在样品垫170的第二尾部160和终止 垫180之间的界面上核糖核酸(RNA)的集中度非常显著。换句话说，样品接收部140是脱氧核糖核酸的定位部而第二尾部160和终止垫180之间的界面是核糖核酸的定位部。
[0121]尽管在【具体实施方式】中对本发明的部分特征进行了详细的说明和描述，但在不脱离本发明精神的前提下，可以对本发明进行各种改变和替换。同样的，本领域熟练技术人员也可以根据常规实验获得本发明公开的其它改变和等同物。所有这些改变，替换和等同物都在本发明所定义的权利要求的构思和范围之内。
【权利要求】
1.一种分离核酸的方法，其特征在于，包括: 将含有核酸的样品溶液加至石英纤维滤纸的样品接收部； 使缓冲溶液沿着石英纤维滤纸长度方向扩散、通过样品接收部，从而把核酸根据其分子量不同而在石英纤维滤纸上进行定位。
2.如权利要求1所述的分尚核酸的方法，其特征在于，大部分具有第一分子量的核酸被定位在样品接收部附近。
3.如权利要求2所述的分离核酸的方法，其特征在于，第一分子量为至少约5万个碱基对(50kilo base pairs,50kb)o
4.如权利要求2所述的分离核酸的方法，其特征在于，第一分子量为约50kb至约150kb。
5.如权利要求1至4中任一权利要求所述的分离核酸的方法，其特征在于，石英纤维滤纸呈长条形，包括第一尾部、缓冲溶液载入部、样品接收部、和第二尾部，缓冲溶液载入部相对于第二尾部更靠近第一尾部，样品接收部比缓冲溶液载入部更接近第二尾部。
6.如权利要求5所述的分尚核酸的方法，其特征在于，大部分具有第二分子量的核酸被定位在第二尾部附近。
7.如权利要求6所述的分离核酸的方法,其特征在于,第二分子量为低于约50kb。
8.如权利要求5所述的分离核酸的方法，其特征在于，其包括，提供一个与第二尾部相邻的吸液垫。
9.如权利要求8所述的分离核酸的方法，其特征在于，其包括，在使缓冲溶液沿着石英纤维滤纸长度方向扩散、通过样品接收部、至终止垫、第二石英纤维滤纸、或第二吸液垫之前，使清洗溶液沿着石英纤维滤纸长度方向扩散至吸液垫。
10.如权利要求5所述的分离核酸的方法，其特征在于，缓冲溶液载入部为第一尾部，且浸在缓冲溶液中。
11.如权利要求5所述的分离核酸的方法，其特征在于，其包括，提供一个与第二尾部相邻的、由不同于石英纤维滤纸材料所制成的终止垫。
12.如权利要求5所述的分离核酸的方法，其特征在于，其包括，在使缓冲溶液沿着石英纤维滤纸长度方向扩散之前，使清洗液沿着石英纤维滤纸长度方向扩散至第二尾部、并切除第二尾部。
13.如权利要求1所述的分离核酸的方法，其特征在于，核酸为脱氧核糖核酸、核糖核酸、或其组合。
14.如权利要求1所述的分离核酸的方法，其特征在于，缓冲溶液为核酸的溶剂。
15.如权利要求1所述的分离核酸的方法，其特征在于，缓冲溶液为三_(羟甲基)氨基甲烷乙二胺四乙酸(TE)缓冲溶液，和用羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)替换三(羟甲基)氨基甲烷的磷酸盐缓冲溶液和TE缓冲溶液中的至少一种。
16.如权利要求1所述的分离核酸的方法，其特征在于，其包括，用溶解试剂制备样品溶液。
17.如权利要求1所述的分离核酸的方法，其特征在于，样品接收部包含溶解试剂。
18.如权利要求1所述的分离核酸的方法，其特征在于，其包括:在使缓冲溶液沿着石英纤维滤纸长度方向扩散、通过样品接收部、至第二石英纤维滤纸之前，使清洗液沿着石英纤维滤纸长度方向扩散、通过样品接收部、至第三石英纤维滤纸。
19.一种分离核酸的装置，其特征在于，其包括: 石英纤维滤纸，其包括: 样品接收部，其接收含有核酸的样品溶液；以及 定位部，其在缓冲溶液沿着石英纤维滤纸长度方向扩散、通过样品接收部之后定位相应分子量的核酸。
20.如权利要求19所述的分离核酸的装置，其特征在于，样品接收部包含溶解试剂。
21.如权利要求19所述的分离核酸的装置，其特征在于，定位部为样品接收部。
22.如权利要求19所述的分离核酸的装置，其特征在于，其包括，包覆石英纤维滤纸的壳体。
23.如权利要求19至22中任一权利要求所述的分离核酸的装置，其特征在于，石英纤维滤纸呈长条形，包括第一尾部、缓冲溶液载入部、样品接收部、和第二尾部，缓冲溶液载入部相对于第二尾部更靠近第一尾部，样品接收部比缓冲溶液载入部更接近第二尾部。
24.如权利要求23所述的分离核酸的装置，其特征在于，其包括，与第二尾部相邻的、由不同于石英纤维滤纸材料所制成的终止垫。
25.如权利要求23所述的分离核酸的装置，其特征在于，缓冲溶液载入部为第一尾部。
26.如权利要求23所述的分离核酸的装置，其特征在于，其包括，与第二尾部相邻的吸液垫。
27.如权利要求23所述的分离核酸的装置，其特征在于，定位部为第二尾部。
28.如权利要求23所述的分离核酸的装置，其特征在于，定位部位于样品接收部和第二尾部之间。
【文档编号】C12N15/10GK103667253SQ201210347718
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年9月18日 优先权日:2012年9月18日
【发明者】约翰.尼尔森, 帕特里克.斯普纳, 克里斯托弗.普莱奥, 侯嵘, 陈林 申请人:通用电气公司
【专利摘要】一种分离核酸的方法包括：将含有核酸的样品溶液加至石英纤维滤纸的样品接收部；使缓冲溶液沿着石英纤维滤纸长度方向扩散、通过样品接收部，从而把核酸根据其分子量不同而在石英纤维滤纸上进行定位。本发明还涉及相关的分离核酸的装置。
【专利说明】分离核酸的方法及装置
【技术领域】
[0001]本发明涉及分离核酸的方法及装置。
【背景技术】
[0002]核酸应用于医学和生物学等领域。核酸的体外操作和分析之前通常需要将其与其他不需要的杂质分离开来，以避免影响后续体外操作和分析过程。
[0003]不同分子量的核酸提供由于不同的原因而重要的信息。例如，脱氧核糖核酸提供关于基因先天和后天突变/局部重排方面的重要信息。和脱氧核糖核酸相反，核糖核酸则反映细胞的生物学“快照”，因为它们总是跟随周围环境持续变化。 [0004]在某些应用中，如果能够从单个生物样本中将核酸根据分子量的不同而进行分离，对生物样本的收集和后续分析将会得到大幅简化。在生物样本非常小的时候，例如活组织切片检查时，很难将该生物样本进一步分解成对分子量不同的核酸进行各自分离的更小的生物样本，从同一个生物样本同时分离出不同分子量的核酸尤为重要。
[0005]现有各种不同隔离/分离/纯化核酸的技术。例如，国际专利申请公开第2007/104962号介绍了一种将液体样本沿吸水膜流动以使核酸沿着膜的长度分布从而从液体样品中分离的方法。
[0006]美国专利申请公开第2009/0143570号涉及一种分离从基因组脱氧核糖核酸、核糖核酸和蛋白质中选出的至少两种细胞成分的方法，其包括:把包含细胞成分的水溶液施加至第一固体支撑来吸附基因组脱氧核糖核酸；和把包含没有被吸附的核糖核酸和蛋白质的通过物施加至第二固体支撑来吸附核糖核酸。
[0007]对于核酸使用的增加创造了对于快速、简便和可靠的核酸分离方法和装置的需求，因此，有必要开发新的分离核酸的方法及装置。
【发明内容】
[0008]本发明的目的是提供一种新的分离核酸的方法及装置。
[0009]一方面，本发明涉及的分离核酸的方法包括:将含有核酸的样品溶液加至石英纤维滤纸的样品接收部；使缓冲溶液沿着石英纤维滤纸长度方向扩散、通过样品接收部，从而把核酸根据其分子量不同而在石英纤维滤纸上进行定位。
[0010]另一方面，本发明涉及的分离核酸的装置包括:石英纤维滤纸，其包括:样品接收部，其接收含有核酸的样品溶液；以及定位部，其在缓冲溶液沿着石英纤维滤纸长度方向扩散、通过样品接收部之后定位相应分子量的核酸。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]通过结合附图对于本发明的实施例进行描述，可以更好地理解本发明，在附图中:
[0012]图1是根据本发明的第一实施例所提供的装置的示意图。[0013]图2是根据本发明的第二实施例所提供的装置的示意图。
[0014]图3是根据本发明的第三实施例所提供的装置的示意图。
[0015]图4是根据本发明的第四实施例所提供的装置的示意图。
[0016]图5是例I中获得的电泳图像。
[0017]图6为例2中获得的电泳图像。
[0018]图7为例3中获得的电泳图像。
[0019]图8为例4中获得的电泳图像。
[0020]图9为图3所示装置和例5中获得的电泳图像。
[0021]图10为图4所示装置和例6中获得的电泳图像。
【具体实施方式】
[0022]在下文中，将根据【专利附图】
【附图说明】本发明的实施方式，将不会详细描述众所周知的功能和结构，以避免因不必要的细节而使本发明变得令人费解。
[0023]除非另作说明，本文使用的技术术语或者科学术语为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。本发明专利申请说明书以及权利要求书中使用的“第一”、“第二”、“第三”以及类似的词语并不表示任何顺序、数量或者重要性，而只是用来区分不同的组成部分。“包括”、“含有”、或者“包含”等类似的词语意指出现在“包括”、“含有”、或者“包含”前面的元件或者物件涵盖出现在“包括”、“含有”、或者“包含”后面列举的元件或者物件及其等同，并不排除其他元件或者物件。尽管“连接”、“邻接”、或者“相连”等类似的词语常用于描述物理的或者机械的连接，但并非限定于此，而且包括直接的或间接的连接。
[0024]说明书中的近似用语用来修饰数量，表示本发明并不限定于该具体数量，还包括与该数量接近的可接受的而不会导致相关基本功能的改变的修正的部分。相应的，用“大约”、“约”等修饰一个数值，意为本发明不限于该精确数值。在某些例子中，近似用语可能对应于测量数值的仪器的精度。
[0025]在以下的说明书和权利要求中，除非清楚地另外指出，单复数不加以限制。
[0026]本申请所提及的“可”、“可能”和“可为”表示在一定环境下发生的可能性；具有指定的性质，特征或者功能的可能性；和/或通过显示一个或者多个能力、性能而适合于另一种动作，或者与该适合的动作相关的可能性。因此，用于“可”、“可能”和“可为”表示修饰的术语显然适合、能够或者适于所表示的能力，功能，或者用途，同时考虑在一些情况下，所修饰的术语可能有时不适合、不能或者不合适。例如，在一些情况下，事件或者能力可能是所期望的，而在其它情况下，该事件或者能力不能发生。这种区别通过术语“可”、“可能”和“可为”涵盖。
[0027]本发明涉及从生物样本把核酸与不需要的杂质分离及/或从单一生物样本把核酸根据不同分子量互相分离的方法和装置。本发明涉及的方法和装置不需要使用昂贵的离心分尚设备且分尚时间较短。
[0028]本发明中“分离”指的是从样品溶液把核酸与不需要的杂质分离及/或从单一生物样本把核酸根据不同分子量互相分离而进行的隔离或纯化核酸的行为或行动。
[0029]本发明中“核酸”是指脱氧核糖核酸、核糖核酸、或其组合。分离得到的核酸可包括单一类型的核酸或2个以上不同类型的核酸。分离得到的核酸可为单链、双链、线性或环状。分离得到的核酸的分子量也没有限制，其在一些实施例中可在几个碱基对(base pair,bp)到几百万bp的范围内。
[0030]本发明提及的“生物样本”这一术语是广义上的，而且意在涵盖各种包含核酸的生理或临床生物资源。这样的生物资源包括，但不限于，整体组织，包括活检材料和吸出物；体外培养细胞，包括初级细胞和次级细胞、转化细胞系、及组织细胞和血细胞；体液，如尿液、唾液、精液、分泌物、眼睛清洗和吸出物、肺清洗和吸出物；合成脱氧核糖核酸或核糖核酸的介质；化学法或生物法合成的脱氧核糖核酸或核糖核酸的混合物；真菌和植物组织，例如叶、根、茎和菌盖；可存在于生物样本上或里的微生物和病毒；以及其他任何脱氧核糖核酸和/或核糖核酸存在或 可存在的资源。
[0031]样品溶液 可为以溶解、悬浮、混合或其他方式包含脱氧核糖核酸、核糖核酸或其组合，或含有脱氧核糖核酸、核糖核酸或其组合的细胞、细胞成分或细胞提取物的溶液。样品溶液可从生物样本制备而得。
[0032]从生物样本制备含有核酸的样品溶液的一个示例方法包括使用包含离液物(chaotropic substances)及/或其他试剂的溶解试剂对生物样本进行溶解的步骤,实施这个步骤最简单的方法是把生物样本与溶解试剂相接触。溶解试剂中离液物的浓度可为约
0.1摩尔/升至约10摩尔/升，例如约I摩尔/升至约10摩尔/升。
[0033]本发明提及的离液物是指一种能够通过例如改变核酸的二级、三级、四级结构，保留一级结构完整等方式造成核酸无序的物质。离液物的示例包括但不限于，盐酸胍、异硫氰酸胍/硫氰酸胍、硫氰酸钠、高氯酸钠、碘化钠、碘化钾、尿素、和/或这些物质的任何组合。一种典型的离液阴离子系列，按照离液能力递减的顺序排列如下:CC13C00_、CNS—、CF3COO'ClO4-，I- 、CH3COO' Br' Cl' CHO2'
[0034]对于某些生物样本，如细菌，溶解试剂可包含分解酶，或者，对该生物样本在溶解前例如用分解酶进行预处理。
[0035]—些实施例中,溶解试剂包括足量的缓冲液。在溶解试剂中使用的缓冲液示例包括三_(羟甲基)甲胺盐酸盐(三-盐酸)、磷酸钠、醋酸钠、四硼酸钠-硼酸和甘氨酸-氢氧化钠。
[0036]一些实施例中，溶解试剂包括还原剂，该还原剂能够促进离液物对核糖核酸酶的变性和帮助未降解核糖核酸的分离。还原剂示例包括但不限于，2-氨基乙硫醇、三-羧基乙
基磷化氢及巯基乙醇。
[0037]—些实施例中，溶解试剂包括非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、两性表面活性剂、及\或各种表面活性剂的任意组合。非离子表面活性剂的示例包括但不限于聚氧亚乙基辛基苯基醚(Triton? X-100)、(辛基苯氧基)聚乙氧乙醇(IGEPAL?CA-630/NP-40)、三乙烯基乙二醇单月桂醇醚(BRIJ? 30)，山梨醇酐月桂酸酯(SPAN? 20)，或者聚山梨醇酯化合物家族，例如聚山梨醇酯20 (即TWEEN? 20)、TWEEN? 40、TWEEN?60和TWEEN? 80(Sigma-Aldrich公司，美国密苏里州圣路易斯市)。阳离子表面活性剂的示例包括溴化十六烷基三甲基铵、氯化十二烷基三甲基铵、氯化十四烷基三甲基铵和氯化十六烷基吡啶。
[0038]溶解试剂中表面活性剂的浓度随表面活性剂的种类和待溶解生物样本中成分的不同而变化。一些实施例中，表面活性剂的重量浓度可为约0.1%到约20%。[0039]—些实施例中，溶解试剂包含蛋白酶，其为例如丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和金属蛋白酶等中的至少一种。可用不含核酸酶的蛋白酶。包含如金属离子等稳定剂的蛋白酶，也可用。蛋白酶的用量可为添加后每毫升溶解试剂的约0.001IU到约10IU、或者约0.01IU 到约 IIUo
[0040]一些实施例中，溶解试剂含脱氧核糖核酸分解酶抑制剂及/或核糖核酸分解酶抑制剂。
[0041] 一些实施例中，溶解试剂包含消泡剂。消泡剂的示例包括含硅消泡剂(如硅油、二甲基聚硅氧烷、有机硅乳液，改性聚硅氧烷和有机硅化合物)、醇类消泡剂(例如乙炔二醇、庚醇、辛醇，高碳醇和聚氧化亚烷基二醇)、醚类消泡剂(例如，庚基溶纤剂和壬基溶纤剂-3-庚基山梨糖醇)、脂肪和油类消泡剂(如动物油和植物油)、脂肪酸类消泡剂(例如，硬脂酸，油酸和棕榈酸)、金属皂类消泡剂(例如，硬脂酸铝和硬脂酸钙)、脂肪酸酯类消泡剂(例如，天然蜡和磷酸三丁酯)、磷酸盐类消泡剂(例如，辛基磷酸钠)、胺类消泡剂(例如二戊基胺)、酰胺类消泡剂(例如，硬脂酸酰胺)、其他消泡剂(如硫酸铁和钒土 )、和各种消泡剂的任意可能组合。
[0042]一些实施例中，溶解试剂包含醇，其可为伯醇、仲醇及叔醇，如甲醇、乙醇、丙醇及其同分异构体、和丁醇及其同分异构体等。溶解试剂中醇的重量浓度，可为约5%到约90%。
[0043]一些实施例中，溶解试剂为 11 lustra? RNAspin Mini kit (cat#25-0500-71)中的RAl溶解缓冲液，其中加入了 2-β -巯基乙醇(cas#60-24-2)。
[0044]制备含有核酸的样品溶液的方法可以借助例如超声波处理、尖锐突出物处理、或高速搅拌或振荡处理等技术手段。
[0045]请参图1，根据本发明的第一实施例所提供的装置70包括:长条形石英纤维滤纸72，其包括第一尾部74、缓冲溶液载入部76、样品接收部78、和与第一尾部74相反的第二尾部79。缓冲溶液载入部76相对于第二尾部79更靠近第一尾部74。样品接收部78比缓冲溶液载入部76更接近第二尾部79。
[0046]参照图2，根据本发明的第二实施例所提供的装置I包括样品垫2和与样品垫2在长度方向上相连的收集垫3。样品垫2是与图1中石英纤维滤纸72相似的石英纤维滤纸，其包括第一尾部5、样品接收部4、和与第一尾部5相反的第二尾部(未标记)。收集垫3可为石英纤维滤纸或者终止垫，其与样品垫2的第二尾部连接。
[0047]参照图3，根据本发明的第三实施例所提供的装置10包括样品垫12和与样品垫12在长度方向上相连的吸液垫13。样品垫12是与图1中石英纤维滤纸72相似的石英纤维滤纸，其包括第一尾部15、缓冲溶液载入部17、样品接收部14、和与第一尾部15相反的第二尾部16。缓冲溶液载入部17相对于第二尾部16更靠近第一尾部15。样品接收部14比缓冲溶液载入部17更接近第二尾部16。
[0048]参照图4，根据本发明的第四实施例所提供的装置100包括样品垫170、与样品垫170在长度方向上相连的终止垫180、和与终止垫180在长度方向上连接的吸液垫130。样品垫170是与图1中石英纤维滤纸72相似的石英纤维滤纸，其包括第一尾部150、缓冲溶液载入部120、样品接收部140、和与第一尾部150相反的第二尾部160。缓冲溶液载入部120相对于第二尾部160更靠近第一尾部150。样品接收部140比缓冲溶液载入部120更接近第二尾部160。
[0049]石英纤维滤纸72、2、12、170可为任何吸着样品溶液且不抑制核酸的储存或后续分析的多孔吸液石英纤维滤纸。一些实施例中，石英纤维滤纸72、2、12、170由无粘结剂的纯石英纤维制成。一些实施例中，石英纤维滤纸72、2、12、170对颗粒大小不小于2.2微米的粒子阻止通过效率为约98%，基础重量为约85g/m2，厚度范围为约300微米到约600微米。可应用于本发明的石英纤维滤纸的示例，包括但不限于可从美国新泽西州通用电气医疗公司购得的Whatman" grade QM-A石英微纤维滤纸以及可从美国马萨诸塞州Millipore公司购得的AQFA石英纤维滤纸。
[0050]含有核酸的样品溶液施加到石英纤维滤纸72、2、12、170的样品接收部78、4、14、140。样品接收部78、4、14、140可为能接收样品溶液的任何形状或构造。一些实施例中，石英纤维滤纸72、2、12、170的样品接收部78、4、14、140包含溶解试剂，生物样本则可以直接应用于样品接收部78、4、14、140。在这些情况下，生物样本就是含有核酸的样品溶液。
[0051]缓冲溶液可以是核酸的任何溶剂。一些实施例中，缓冲溶液是三(羟甲基)氨基甲烷乙二胺四乙酸(TE)缓冲溶液，和用羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)替换三(羟甲基)氨基甲烷后的磷酸盐缓冲溶液和TE缓冲溶液中的至少一种。
[0052]缓冲溶液沿着石英纤维滤纸72、2、12、170长度方向扩散并通过样品接收部78、4、
14、140。缓冲溶液载入部可为能接收缓冲溶液的任何形状或构造。一些实施例中，缓冲溶液施加至缓冲溶液载入部76、17、120。一些实施例中，第一尾部5被浸于缓冲溶液中，从而缓冲溶液从第一尾部5开始扩散，在此情况下，第一尾部5就是缓冲溶液载入部。
`[0053]终止垫3、180是由不同于石英纤维滤纸的材料所制成的细长条。一些实施例中，终止垫3、180是由纤维素制成，如为Whatman? grade 31ET纸。
[0054]吸液垫13、130由吸液材料制得，如纤维素、二氧化硅微纤维滤纸、和玻璃纤维。一些实施例中，吸液垫13、130是由美国新泽西州的通用电气医疗公司提供的Whatman?grade 470特殊用途滤纸所制得。
[0055]从后述实验示例可以看出，在缓冲溶液沿着石英纤维滤纸72、2、12、170长度方向扩散、通过样品接收部78、4、14、140之后，核酸在石英纤微滤纸72、2、12、170上根据分子量的不同而定位。具体而言，分子量高的核酸与分子量低的核酸相比，其定位于距离样品接收部78、4、14、140更近的地方。
[0056]一些实施例中，大部分具有第一分子量的核酸被定位于样品接收部78、4、14、140附近。在这种情况下，样品接收部78、4、14、140是具有第一分子量的核酸的定位部。一些实施例中，第一分子量是指在至少约5万个碱基对(50kilo base pairs, 50kb)或从约50kb到约150kb的范围内。一些实施例中，约50kb是指50kb±15kb的范围。
[0057]一些实施例中，大部分具有第二分子量的核酸被定位于第二尾部79、6、16、160附近。在这种情况下，第二尾部79、6、16、160是具有第二分子量的核酸的定位部。一些实施例中，第二分子量是在小于约50kb的范围内。
[0058]一些实施例中，终止垫180、3 (当收集垫3为终止垫时)和石英纤维滤纸170、2相邻，在缓冲溶液沿着石英纤维滤纸170、2长度方向扩散、通过样品接收部140、4之后，大部分随缓冲溶液迁移的核酸被定位在样品垫170、2和终止垫180、3之间的界面。
[0059]一些实施例中，核酸定位于样品接收部78、4、14、140和第二尾部79、6、16、160之间，从而这些核酸的定位部位于样品接收部78、4、14、140和第二尾部79、6、16、160之间。
[0060]一些实施例中，在缓冲溶液扩散之前，使清洗液沿着石英纤维滤纸72、2、12、170长度方向扩散、通过样品接收部78、4、14、140。清洗液在没有外力仅靠毛细作用的情况下在石英纤维滤纸上扩散、带走在石英纤维滤纸上吸着能力比核酸低的杂质，以将核酸与样品溶液中不需要的杂质相分离。
[0061]含有核酸的样品溶液、清洗液和缓冲溶液可用管子、移液管、自动注入装置、或任何其他适用的方法或工具添加到石英纤维滤纸上。
[0062]清洗液可包括能分解杂质(例如蛋白质)的酶。此外，它可根据需要包括脱氧核糖核酸酶、核糖核酸酶或类似物。包含脱氧核糖核酸酶的清洗液的使用可有助于核糖核酸的选择性回收。同样，包含核糖核酸酶的清洗液可有助于选择性的回收脱氧核糖核酸。
[0063]清洗液可包括水溶性有机溶剂和/或水溶性盐。清洗液洗出样品溶液中与核酸一起吸着在石英光纤滤纸上的杂质。因此，它可含有将杂质从石英纤维滤纸脱吸的同时让核酸保持吸着的成分。核酸难溶的水溶性有机溶剂，如醇类，适合从石英纤维滤纸解吸核酸以外的其他成分。与此同时，水溶性盐的纳入可增强核酸的吸附，协助对不必要的杂质的选择性解吸。
[0064]清洗液中的水溶性有机溶剂的示例包括甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇、正丁醇和丙酮，其中乙醇较为合适。水溶性有机溶剂在清洗液中的重量浓度可为约20%至100%或约40% 到约 100%。[0065]清洗液中的水溶性盐可为卤化盐或三(羟甲基)氨基甲烷。
[0066]一些实施例中，清洗液为含80%乙醇的TE缓冲溶液。
[0067]清洗液可与含有核酸的样品溶液在石英纤维滤纸的添加位置相同，即都在样品接收部添加，或者与缓冲溶液在石英纤维滤纸的添加位置相同，即都在缓冲溶液载入部添加。清洗液也可从石英纤维滤纸上不同于样品接收部和缓冲溶液载入部的位置添加。
[0068]一些实施例中，清洗液扩散至第二尾部79、6、16、160，把样品溶液中不需要的杂质带至第二尾部79、6、16、160。再在缓冲溶液扩散之前切除第二尾部79、6、16、160。通过这种方式，被定位在残余石英纤维滤纸上的核酸为将不需要的杂质提纯/分离/隔离后的核酸。
[0069]一些实施例中，在清洗液通过样品接收部4、沿着石英纤维滤纸2长度方向、朝向收集垫3 (终止垫、吸液垫或石英纤维滤纸)及装置I的第二尾部6扩散之后，更换收集垫3，从而使缓冲溶液从样品垫2扩散至更换的收集垫3。
[0070]石英纤维滤纸72、1、12、170，收集垫3，吸液垫13、130，终止垫180可由如聚酯(Mylar?)或聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)等塑料材料之类的背衬材料提供支撑。
[0071]一些实施例中，装置70、1、10、100包含塑料壳体(未图示)，其将石英纤维滤纸72、
1、12、170，收集垫3，吸液垫13、130，终止垫180包覆于其内，但用相应开孔将样品接收部78、4、14、140和/或缓冲溶液载入部76、5、17、120暴露，从而使含有核酸的样品溶液、清洗液以及缓冲溶液可以被添加到样品接收部78、4、14、140和/或缓冲溶液载入部76、5、17、120。一些实施例中，样品接收部78、4、14、140和/或缓冲溶液载入部76、5、17、120可位于壳体之外。
[0072]本发明的装置70、1、10、100可为一个简单的核酸纯化、分离设备，也可为整个核酸分析设备/仪器组件的组成部分。
[0073]在缓冲溶液扩散之后，可将定位在石英纤维滤纸上的核酸在低离子强度或用水的条件下进行洗提等后续处理。
[0074]本发明中“吸着”是指样品溶液被吸收、吸附或掺入或掺到样品接收部，使得不容易从样品接收部移除，除非有意或不慎达到从样品接收部移除吸着的组成的条件。
[0075]本发明中“大部分”是指达到总量的至少约15%、至少约50%、或至少约90%。举例而言，“大部分具有第一分子量的核酸被定位在样品接收部附近”是指具有第一分子量并且定位于样品接收部的核酸，可为吸着于样品接收部的样品溶液中具有第一分子量的核酸总量的至少约15%、至少约50%、或至少约90%。类似地，“大部分具有第二分子量的核酸被定位在第二尾部附近”是指具有第二分子量并且定位于第二尾部的核酸，可为吸着于样品接收部的样品溶液中具有第二分子量的核酸总量的至少约15%、至少约50%、或至少约90%。
[0076]石英纤维滤纸的多孔性所固有的毛细作用力作为使清洗液和/或缓冲溶液沿着石英纤维滤纸扩散、通过样品接收部的动力。吸液垫13、130依靠其强大的毛细作用力吸引清洗液和/或缓冲溶液朝向吸附垫13、130扩散。基于杂质与核酸对于多孔石英纤维滤纸的吸着力不同，清洗液和/或缓冲溶液带走杂质，核酸与样品溶液中杂质充分分离，消除了对产生外部动力(如离心力和压力)的仪器和具有特定技能的人才的需求，使在偏远地区的现场分离成为可能。
[0077]缓冲溶液沿着石英纤维滤纸长度方向扩散、通过样品接收部，使核酸在石英纤维滤纸上迁移，分子量越低，核酸从样品接收部迁移的距离越远。当缓冲溶液从石英纤维滤纸扩散到由不同于石英纤维滤纸材料制成的终止垫或吸液垫时，随着缓冲溶液迁移的核酸将停止且定位于石英纤维滤纸和终止垫或吸液垫之间的界面。因此，通过缓冲溶液扩散，将核酸以分子量大小定位在石英纤维滤纸的相应的位置，即可达到分离核酸与杂质及/或不同分子量核酸的目的。`
[0078]实验示例
[0079]下述实验示例为本【技术领域】内的技术人员实施本发明提供进一步的指导。示例并不限定权利要求书中界定的本发明的范围。
[0080]例I脱氧核糖核酸尺寸分析
[0081]小鼠基因组脱氧核糖核酸溶液(5ul，来自中国北京的康为世纪生物科技有限公司)和5ul人类基因组脱氧核糖核酸溶液(来自美国加州的Clontech Laboratories, Inc.)被置于两个分离的含有1%琼脂糖胶的样品槽来进行脉冲场凝胶电泳。
[0082]脉冲场凝胶电泳是由Bio-rad实验室的CHEF Mapper" XA系统在电压为6v/cm且温度为10° C的环境里进行24小时。电泳之后，琼脂糖胶被IxSYBR Green I溶液染色5小时，之后使用美国新泽西州通用电气医疗公司提供的Typhoon? Trio?多模式成像仪显影。
[0083]脉冲场凝胶电泳图像如图5所示。在图5中，泳道1、III表征MidRange 11 PFG标记，泳道II表征5ul小鼠基因组脱氧核糖核酸溶液，泳道IV表征5ul人类基因组脱氧核糖核酸溶液。
[0084]从图5中可以看出，小鼠基因组脱氧核糖核酸的分子量小于约50kb，而人类基因组脱氧核糖核酸至少为约50kb且在约50kb到约150kb的范围内。[0085]例2低分子量(< 50kb)脱氧核糖核酸
[0086]请参照图2，装置I (宽4mm，长5.5cm)包括样品垫2 (宽4mm，长2.5cm)和与样品垫2有5mm重叠长度的收集垫3 (宽4_，长3.5cm)。样品垫2和收集垫3都是从美国新泽西州通用电气医疗公司获得的Whatmanii grade QM-A石英微纤维滤纸。样品垫2的样品接收部4距离样品垫2的第一尾部5有1.5cm。
[0087]小鼠基因组脱氧核糖核酸样品溶液(2.5ul，100ng/ul，分子量< 50kb，同例I中所用)加入一支1.5ml的微离心管中，然后和2.5ul缓冲液(66.87%盐酸胍，4%Triton? X-100)混合。
[0088]在将混合物转移至样品垫2的样品接收部4之前，先将该微离心管摇晃约15秒。
[0089]5秒钟后，样品混合物被吸收，样品垫2的第一尾部5被置于一个96槽板的含有150ul清洗液(含80%乙醇的TE缓冲溶液(IOmM Tris pH8，0.1mMEDTA))的一个槽中来沿着装置长度方向扩散清洗液。
[0090]5分钟后，装置I被取出，样品垫2和收集垫3相分离，并在温度为37° C的烘箱中干燥10分钟。干燥之后，样品垫2按照上述相同方式和一个新的与用过的相同的收集垫3组装在一起。
[0091]第一尾部5置于一个96槽板的含有150ulTE缓冲溶液(IOmM Tris pH8，0.1mMEDTA)的槽中用来沿着装置I来扩散TE缓冲溶液。
[0092]5分钟后，装置I被取出，并在温度为37° C的烘箱中干燥30分钟。
[0093]干燥之后,装置I切成宽4mm、长5mm的小片。每一小片被分别置于含有0.8%琼脂糖胶的样品槽中。
[0094]在电压为120V的条件下电泳45分钟。电泳之后，用IxSYBR Green I染色琼脂糖胶1.5小时,之后使用Typhoon? Trio?多模式成像仪显影。
[0095]电泳图像如在图6中所示，图中第I至12泳道表征根据在装置I中位置所排列的第一尾部5到第二尾部6的小片，具体而言，第I至5泳道表征来自样品垫2的小片，第6至12泳道则表征来自收集垫3的小片，第13泳道是空白的，第14泳道表征脱氧核糖核酸标记(日本Takara DL15000)。该图像显示，在清洗液和TE缓冲溶液扩散之后，大部分小鼠基因组脱氧核糖核酸(分子量< 50kb)定位在装置I的第二尾部6附近(第11，12泳道)。换句话说，第二尾部6是本例中的定位部。
[0096]例3高分子量O 50kb)脱氧核糖核酸
[0097]重复例2的实验，但用人类基因组脱氧核糖核酸(分子量> 50kb，与例I中所用的同)取代例2中的小鼠基因组脱氧核糖核酸。
[0098]电泳图像如在图7中所示，图中第I至12泳道表征根据在装置I中位置所排列的第一尾部5到第二尾部6的小片，第I至5泳道是来自样品垫2的小片，第6至12泳道则为来自收集垫3的小片，第13泳道是表征脱氧核糖核酸标记(日本Takara DL15000)。
[0099]图像显示，在清洗液和TE缓冲溶液扩散之后，大部分人类基因组脱氧核糖核酸仍然保留在样品接收部4 (第3，4泳道)附近。换句话说，大部分人类基因组脱氧核糖核酸定位于样品接收部4，而样品接收部4是本例中的定位部。
[0100]例4闻分子量脱氧核糖核酸和低分子量脱氧核糖核酸
[0101]人类基因组脱氧核糖核酸样品溶液(2.5ul，100ng/ul，同例I中所用)加入一支1.5ml的微离心管中，然后与2.5ul脱氧核糖核酸标记(日本Takara DL15000，包括7个分子量:15kb、10kb、7.5kb、5kb、2.5kb、lkb、250bp)和 5ul 缓冲液(66.87% 盐酸胍，4%Triton?X-100)混合。
[0102]混合物用同例2中的相同的方式处理，但收集垫3是4cm长，且清洗液和TE缓冲溶液都是例2中两倍的量。
[0103]电泳图像如在图8中所示，图中第I泳道表征脱氧核糖核酸标记(日本TakaraDL15000)，第2至14泳道表征装置I从第一尾部5到第二尾部6的小片。
[0104]该图显示，在清洗液和TE缓冲溶液扩散之后，在样品接收部4 (第4泳道)附近仅有人类基因组脱氧核糖核酸，而且，在第二尾部6 (第14泳道)仅有低分子量的脱氧核糖核酸标记。也就是说，对于人类基因组脱氧核糖核酸，定位部是样品接收部4，对于低分子量的脱氧核糖核酸标记，第二尾部6是其定位部，而对于分子量介于定位于样品接收部4的核酸分子量和定位于第二尾部6的核酸分子量之间的核酸，其定位部介于第二尾部6和样品接收部4之间。
[0105]例5脱氧核糖核酸和核糖核酸
[0106]请参照图9，使用图3中的装置10，其包括一个样品垫12 (宽4mm，长6cm的Whatman' grade QM-A石英微纤维滤纸)，一个与样品垫12部分重叠的吸液垫13(Whatman? grade 470特殊用途滤纸)和一个将样品垫12和吸液垫13包覆的壳体(未图示，中国上海的上海杰一生物科技有限公司的A-1O塑料壳体)。
[0107]包含1.2xl06 细胞的融合组织培养物(干细胞培养物)被急速旋转并除去浮层介质。细胞粒与 35ul 的 Illustra? RNAspin Mini kit (cat#25-0500-71)的 RAl 溶解缓冲液和0.35ul的2-β -巯基乙醇(BME, cas#60-24_2)旋转混合。
[0108]通过壳体的一个开口(未图示)把5ul细胞溶解液加到与样品垫12的第一尾部15距离2.7cm的样品接收部14。在干燥之后，Iul的total Jurkat RNA(lug/ul)通过该开口加至样品接收部14。
[0109]不含脱氧核糖核酸酶/核糖核酸酶的TE缓冲溶液(150ul，IOmM Tris pH8，0.1mMEDTA)通过壳体的另一个开口(未图示)加至与样品垫12的第一尾部15距离为Icm的缓冲溶液载入部17，沿着装置10长度方向扩散。
[0110]10分钟之后，样品垫12从壳体取出并置于0.8%的琼脂糖胶。在IlOV的电压进行电泳45分钟。之后，用插入染料对琼脂糖胶染色I小时，再使用Typhoon? Trio?多模式成像仪显影。
[0111]核酸定位的结果显示在图9中，图中所示是按照与样品垫12中相应的位置排列的，但泳道A显示的是NEBlkb ladder,泳道B是与样品接收部14所接收的细胞溶解液和total Jurkat RNA用量完全相同的对照样本的显影，为作比较，此样本电泳前未经TE缓冲溶液扩散处理。
[0112]从图9可以看出，在TE缓冲溶液沿着装置10扩散之后，高分子量的脱氧核糖核酸(DNA)被定位在样品接收部14附近，而核糖核酸(RNA)成分迁移并被定位至第二尾部16。也就是说，样品接收部14是高分子量脱氧核糖核酸的定位部而第二尾部16是核糖核酸成分的定位部。
[0113]例6脱氧核糖核酸和核糖核酸[0114]请参照图10，应用图4中的装置100，其包含一个样品垫170 (宽4mm，长4cm的WhatmanK grade QM-A石英微纤维滤纸),一个与样品垫170部分重叠的终止垫180 (宽4mm,长2.5cm的WhatmanR grade 31ET纸)，一个与终止垫180部分重叠的吸液垫130(W hatnian? grade 470特殊用途滤纸)和一个将前述垫包覆的壳体(未图示，中国上海的上海杰一生物科技有限公司的A-1O塑料壳体)。
[0115]包含1.2x106细胞的融合组织培养物(干细胞培养物)被急速旋转并除去浮层介质。细胞粒与 35ul 的 Illustra? RNAspin Mini kit (cat#25-0500-71)的 RAl 溶解缓冲液和0.35ul的2-β -巯基乙醇(BME, cas#60-24_2)旋转混合。
[0116]通过壳体的一个开口(未图示)把5ul细胞溶解液加到与样品垫170的第一尾部150距离2.7cm的样品接收部140。在干燥之后，Iul的total Jurkat RNA (lug/ul)通过该开口加至样品接收部140。
[0117]150ul不含脱氧核糖核酸酶/核糖核酸酶的TE缓冲溶液(IOmM Tris pH8，0.1mMEDTA)通过壳体的另一个开口(未图示)加至与样品垫170的第一尾部150距离为Icm的缓冲溶液载入部120，沿着装置100长度方向扩散。
[0118]10分钟之后，样品垫170和终止垫180从壳体取出并置于0.8%的琼脂糖胶。在IlOV的电压进行电泳45分钟。之后，用插入染料对琼脂糖胶染色I小时，再使用Typhoon?Trio?多模式成像仪显影。
[0119]核酸定位的结果显示在图10中，图中所示是按照与样品垫170和终止垫180相应的位置排列的，但泳道D显示的是NEBlkb ladder,泳道C是与样品接收部140所接收的细胞溶解液和total Jurkat RNA用量完全相同的对照样本的显影，为作比较，此样本电泳前未经TE缓冲溶液扩散处理。
[0120]从图10可以看出，脱氧核糖核酸(DNA)被定位在样品接收部140附近，而在样品垫170的第二尾部160和终止 垫180之间的界面上核糖核酸(RNA)的集中度非常显著。换句话说，样品接收部140是脱氧核糖核酸的定位部而第二尾部160和终止垫180之间的界面是核糖核酸的定位部。
[0121]尽管在【具体实施方式】中对本发明的部分特征进行了详细的说明和描述，但在不脱离本发明精神的前提下，可以对本发明进行各种改变和替换。同样的，本领域熟练技术人员也可以根据常规实验获得本发明公开的其它改变和等同物。所有这些改变，替换和等同物都在本发明所定义的权利要求的构思和范围之内。
【权利要求】
1.一种分离核酸的方法，其特征在于，包括: 将含有核酸的样品溶液加至石英纤维滤纸的样品接收部； 使缓冲溶液沿着石英纤维滤纸长度方向扩散、通过样品接收部，从而把核酸根据其分子量不同而在石英纤维滤纸上进行定位。
2.如权利要求1所述的分尚核酸的方法，其特征在于，大部分具有第一分子量的核酸被定位在样品接收部附近。
3.如权利要求2所述的分离核酸的方法，其特征在于，第一分子量为至少约5万个碱基对(50kilo base pairs,50kb)o
4.如权利要求2所述的分离核酸的方法，其特征在于，第一分子量为约50kb至约150kb。
5.如权利要求1至4中任一权利要求所述的分离核酸的方法，其特征在于，石英纤维滤纸呈长条形，包括第一尾部、缓冲溶液载入部、样品接收部、和第二尾部，缓冲溶液载入部相对于第二尾部更靠近第一尾部，样品接收部比缓冲溶液载入部更接近第二尾部。
6.如权利要求5所述的分尚核酸的方法，其特征在于，大部分具有第二分子量的核酸被定位在第二尾部附近。
7.如权利要求6所述的分离核酸的方法,其特征在于,第二分子量为低于约50kb。
8.如权利要求5所述的分离核酸的方法，其特征在于，其包括，提供一个与第二尾部相邻的吸液垫。
9.如权利要求8所述的分离核酸的方法，其特征在于，其包括，在使缓冲溶液沿着石英纤维滤纸长度方向扩散、通过样品接收部、至终止垫、第二石英纤维滤纸、或第二吸液垫之前，使清洗溶液沿着石英纤维滤纸长度方向扩散至吸液垫。
10.如权利要求5所述的分离核酸的方法，其特征在于，缓冲溶液载入部为第一尾部，且浸在缓冲溶液中。
11.如权利要求5所述的分离核酸的方法，其特征在于，其包括，提供一个与第二尾部相邻的、由不同于石英纤维滤纸材料所制成的终止垫。
12.如权利要求5所述的分离核酸的方法，其特征在于，其包括，在使缓冲溶液沿着石英纤维滤纸长度方向扩散之前，使清洗液沿着石英纤维滤纸长度方向扩散至第二尾部、并切除第二尾部。
13.如权利要求1所述的分离核酸的方法，其特征在于，核酸为脱氧核糖核酸、核糖核酸、或其组合。
14.如权利要求1所述的分离核酸的方法，其特征在于，缓冲溶液为核酸的溶剂。
15.如权利要求1所述的分离核酸的方法，其特征在于，缓冲溶液为三_(羟甲基)氨基甲烷乙二胺四乙酸(TE)缓冲溶液，和用羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)替换三(羟甲基)氨基甲烷的磷酸盐缓冲溶液和TE缓冲溶液中的至少一种。
16.如权利要求1所述的分离核酸的方法，其特征在于，其包括，用溶解试剂制备样品溶液。
17.如权利要求1所述的分离核酸的方法，其特征在于，样品接收部包含溶解试剂。
18.如权利要求1所述的分离核酸的方法，其特征在于，其包括:在使缓冲溶液沿着石英纤维滤纸长度方向扩散、通过样品接收部、至第二石英纤维滤纸之前，使清洗液沿着石英纤维滤纸长度方向扩散、通过样品接收部、至第三石英纤维滤纸。
19.一种分离核酸的装置，其特征在于，其包括: 石英纤维滤纸，其包括: 样品接收部，其接收含有核酸的样品溶液；以及 定位部，其在缓冲溶液沿着石英纤维滤纸长度方向扩散、通过样品接收部之后定位相应分子量的核酸。
20.如权利要求19所述的分离核酸的装置，其特征在于，样品接收部包含溶解试剂。
21.如权利要求19所述的分离核酸的装置，其特征在于，定位部为样品接收部。
22.如权利要求19所述的分离核酸的装置，其特征在于，其包括，包覆石英纤维滤纸的壳体。
23.如权利要求19至22中任一权利要求所述的分离核酸的装置，其特征在于，石英纤维滤纸呈长条形，包括第一尾部、缓冲溶液载入部、样品接收部、和第二尾部，缓冲溶液载入部相对于第二尾部更靠近第一尾部，样品接收部比缓冲溶液载入部更接近第二尾部。
24.如权利要求23所述的分离核酸的装置，其特征在于，其包括，与第二尾部相邻的、由不同于石英纤维滤纸材料所制成的终止垫。
25.如权利要求23所述的分离核酸的装置，其特征在于，缓冲溶液载入部为第一尾部。
26.如权利要求23所述的分离核酸的装置，其特征在于，其包括，与第二尾部相邻的吸液垫。
27.如权利要求23所述的分离核酸的装置，其特征在于，定位部为第二尾部。
28.如权利要求23所述的分离核酸的装置，其特征在于，定位部位于样品接收部和第二尾部之间。
【文档编号】C12N15/10GK103667253SQ201210347718
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年9月18日 优先权日:2012年9月18日
【发明者】约翰.尼尔森, 帕特里克.斯普纳, 克里斯托弗.普莱奥, 侯嵘, 陈林 申请人:通用电气公司
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