专利名称：：一种结核/hiv抗原肽双特异性tcr、其重组逆转录病毒载体与应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物工程领域，具体涉及一种结核/HIV抗原肽双特异性T细胞受体(TCR)，以及利用该TCR制备得到的一种用于结核/HIV共感染基因治疗的逆转录病毒载体，逆转录病毒载体转染得到的CD8+T细胞及其在制备抗结核/HIV共感染疾病药物中的应用。
背景技术：
：结核(Tuberculosis,TB)是全球最致命的慢性感染疾病之一。近十年来，由于全球流动人口增加，结核病防治工作受到忽视，多药耐药结核菌广泛流行，免疫抑制剂大量使用，尤其是HIV与结核分枝杆菌并发感染，致使结核病重新蔓延，全球疫情再度恶化。结核潜伏感染者一旦感染HIV，机体免疫系统会被加速破坏，减弱甚至丧失对结核分枝杆菌的抑制效应，患者更容易发展成活动性结核；同时，结核分枝杆菌通过刺激单核细胞和巨噬细胞大量分泌单核细胞趋化蛋白-I(MCP-I)促进HIV的转录，加速病毒增殖，促使病情恶化。2010年全球新增结核病人880万，其中110万共感染HIV;全球结核死亡人数140万，其中1/4为合并感染HIV致死。目前，TB/HIV双重感染者的治疗主要是抗TB与抗逆转录病毒治疗的结合，其疗程长，多种药物相互作用，药物重叠的毒副作用大，易产生耐药性，病人服药依从性差，对这两种疾病同时有效的药物稀缺，整合抗TB与抗逆转录病毒治疗存在时间和药物选择的巨大挑战，以及出现免疫重建炎症综合症等问题。因此，亟需开发针对TB/HIV共感染行之有效的治疗方法。抗TB与抗HIV感染的免疫机制都是以T细胞介导的细胞免疫为主。已有大量实验证据表明，抗原特异性⑶8+T细胞在控制TB和HIV感染中发挥着至关重要的作用。效应CD8+T细胞通过以下三种途径来发挥作用1)发挥细胞毒作用，通过穿孔素和颗粒酶B(granzymeB)途径直接杀伤感染靶细胞；2)释放Thl型细胞因子，如干扰素-Y(interferon-Y,IFN-Y)、肿瘤坏死因子-a(tumornecrosisfactor-α,TNF-α),抑制病原体复制，促进巨噬细胞清除胞内病原体；3)介导Fas/FasL杀伤机制，直接杀伤靶细胞。而在TB/HIV共感染者体内，效应⑶8+CTL数量和反应水平均很低。因此，通过过继转移大量效应⑶8+T细胞至TB/HIV共感染者体内，可增强其抗TB/HIV感染的能力。过继细胞免疫治疗已在抗TB和HIV感染中显示了巨大潜力。利用灭活的结核菌体外致敏PBL，将其回输给多药耐药肺结核患者，取得良好疗效。将患者自体HIV特异性CD8+CTL过继回输治疗6例HIV感染者，最初2周所有患者⑶4计数增加，5名患者血浆病毒血症减少。24周后，2名患者的HIV病毒负载继续减少，另I名患者⑶4计数增加超过2倍。尽管过继细胞免疫治疗展现出光明的前景，但这种方法的普遍应用却存在许多障碍。我们很难从处于疾病进展期的患者体内分离出效应T细胞，因为此时CTL反应是不断消耗的，接受长期治疗的个体也是如此，因为随着病原体负载减少，针对病原体的CTL反应也减少。另夕卜，从患者体内分离出的T细胞往往是已最终分化的，很难扩增。即使可以扩增，回输患者体内后其存活时间也很短。而通过抗原特异T细胞受体基因修饰初始T细胞，人为赋予普通T细胞识别特异抗原的能力，短期内获得大量效应T细胞，则可有效解决这一问题。T细胞抗原受体(Tcellreceptor,TCR)是所有T细胞表面的特征性标志，在T细胞抗原识别中起关键作用。TCR是由α、β两条肽链构成的异二聚体，每条肽链又可分为可变区(V区)，恒定区(C区)，跨膜区和胞质区等几部分；其胞质区很短，信号传递主要通过与其以非共价键结合的CD3分子进行。TCR分子属于免疫球蛋白超家族，其抗原特异性存在于V区；V区(Va、νβ)又各有三个高变区⑶R1、⑶R2、⑶R3，其中以⑶R3变异最大，直接决定了TCR的抗原结合特异性。在TCR识别MHC-抗原肽复合体时，⑶R1XDR2识别和结合MHC分子抗原结合槽的侧壁，而CDR3直接与抗原肽相结合。根据TCRνα、νβ基因的同源性，可将80多个TCRVa基因分为32个家族、60多个TCRνβ基因分为24个家族。利用每个T细胞克隆均有其独特CDR3序列的特点，采用CDR3谱型分析技术，可测定各TCR家族各CDR3出现的频率，由此反映T细胞的克隆性。未接受抗原刺激的T细胞中，针对各种抗原的T细胞克隆分布均匀，表现为多家族和多克隆性，具体地，表现为各家族均出现呈高斯分布的约8个CDR3峰；抗原刺激则引起识别该抗原的某一个或几个特异TCR家族T细胞反应性增生，表现为该家族CDR3成员出现少于4个峰的寡克隆或单克隆分布，其中具有单克隆CDR3分布(表现为单峰)的TCR家族即是抗原特异单克隆增生的TCR家族。对该家族PCR产物进行测序，可获得抗原特异TCRCDR3序列。
发明内容本发明的目的在于筛选出结核肽Ag85B199_2Q7(KLVANNTRL)和HIV肽Eiw12ch128(KLTPLCVTL)双特异的TCR，利用逆转录病毒载体将其转染到CD8+T细胞中，获得表达结核肽Ag85B199_207(KLVANNTRL)和HIV肽Env120^128(KLTPLCVTL)双特异TCR的CD8+T细胞，以及该经过TCR基因修饰的CD8+T细胞在制备抗结核/HIV共感染疾病药物中的应用。本发明所采用的技术方案是一种结核/HIV抗原肽双特异性T细胞受体(TCR)，包括α链和β链，其中，α链的⑶R3区含有SEQIDNO:3所述的序列；β链的⑶R3区含有SEQIDNO:4所示的序列。所述TCR的α链是由SEQIDNO:10所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰后所得到的能特异与外源性β链装配成TCR蛋白分子的氨基酸序列；β链是由SEQIDNO:6所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰后所得到的能特异与外源性α链装配成TCR蛋白分子的氨基酸序列。优选的，所述TCR的α链氨基酸序列如SEQIDNO:12所示，β链氨基酸序列如SEQIDNO:8所示。编码上述结核/HIV抗原肽双特异性TCR的基因。一种结核/HIV抗原肽双特异性TCR的融合基因，其序列如SEQIDNO:13所示。一种重组逆转录病毒载体，含有编码结核/HIV抗原肽双特异性TCR的基因。所述逆转录病毒载体的出发载体为pMX-IRES-GFP、pMCs-IRES-GFP或pMYx-IRES-GFP。上述重组逆转录病毒载体经包装后得到的逆转录病毒。上述逆转录病毒转染的⑶8+T细胞。结核/HIV抗原肽双特异性TCR、编码该TCR的基因，含有该基因的重组逆转录病毒载体、逆转录病毒、该逆转录病毒转染的CD8+T细胞在制备抗结核病、艾滋、艾滋/结核共感染疾病药物中的应用。具体步骤流程如下I、筛选出结核肽Ag85B199_2Q7(KLVANNTRL)和HIV肽Env12(l_128(KLTPLCVTL)双特异的TCR①淋巴细胞分离液分离HLA-A*0201型健康志愿者外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell,PBMC)；②贴壁法获取树突状细胞(dendriticcells，DC)，IL-4和GM-CSF诱导DC成熟；③磁珠分选出⑶8+T细胞；④结核肽Ag85B199_2Q7(KLVANNTRL)和HIV肽Env12Q_128(KLTPLCVTL)分别负载DCs对⑶8+T细胞进行三轮刺激，诱导抗原特异⑶8+T细胞发生克隆扩增；⑤提取⑶8+T细胞mRNA，逆转录为cDNA；⑥利用基因扫描(GeneScan)监测刺激前后CDR3谱型变化，找出刺激后单克隆扩增的抗原特异的⑶8+T细胞TCR基因家族。2、构建重组逆转录病毒载体①根据GeneBank报道的人α、β基因家族可变区(variableregion,V)和恒定区(constantregion,C)基因序列，设计α、β链基因全长序列引物,扩增特异性TCRα、β全长基因；②采用本实验室已经构建好的最小鼠源化C区(minimummurinizedCregion,简称为mC。包括mCa和mCβ，其中共9个氨基酸被鼠C区相应位点的氨基酸替换)分别替换α、β全长基因C区(参照文献Luoff,ZhangXB,HuangYT,HaoPP,JiangZM,WenQjZhouMQjJinQjMaLDevelopmentofgeneticallyengineeredCD4+andCD8+T-cellsexpressingTCRsspecificfora38kDaM.tuberculosisantigen.JMolMed.2011,89(9):903-13)。鼠源化突变的目的在于减少内外源性TCRα、β基因的错配，因为⑶8+T细胞存在内源性TCRα、β基因的表达，通过突变可以促使外源性α与β基因表达的蛋白正确装配成TCR蛋白分子并稳定表达在CD8+T细胞表面，同时利于其竞争结合CD8+T细胞表面的CD3分子，增强信号传导功能，提高修饰后CD8+T细胞的抗结核活性。当然，此处还可以釆取其他策略来减少内外源性TCRα、β基因的错配，如以CD3(链替换α、β全长基因部分C区(Sebestyen，Z.etaL(2008)HumanTCRthatincorporateCD3{zeta}inducehighlypreferredpairingbetweenTCR{alpha}and{beta}chainsfollowinggenetransfer.J.Immunol.180，7736-7746);在外源性α、β基因C区引入二硫键(Boulter，J.M.etaL(2003)Stable,solubleT-cellreceptormoleculesforcrystallizationandtherapeutics.ProteinEng.16，707-711);突变夕卜源性α、β基因C区关键氨基酸以改变α、β链之间的静电荷(Voss，R.H.etaL(2008)MoleculardesignoftheCabinterfacefavorsspecificpairingofintroducedTCRabinhumanTcells.J.Immunol.180，391-401);将外源性ct、β基因V区合并为一条单链TCR并与CD3ζ链融合(Willemsen，R.A.etaL(2000)GraftingprimaryhumanTlymphocyteswithcancer-specificchimericsinglechainandtwochainTCR.GeneThen7，1369-1377);利用2A连接外源性α、β基因实现平衡表达(LeisegangMjEngelsB，MeyerhuberP，KiebackEjSommermeyerDjXueSAjReussS，StaussH，UckertW.EnhancedfunctionalityofTcellreceptor-redirectedTcellsisdefinedbythetransgenecassette.JMolMed.2008，86:573-583.)等。③利用重组PCR技术，将已经最小突变TCRα、β基因通过自剪切多肽2Α连接，并克隆至pGEM-T载体测序鉴定。④将测序正确的α、β全长基因插入逆转录病毒载体pMX-IRES-GFP，酶切鉴定；⑤采用磷酸钙转染法，包装逆转录病毒，低温差速离心法浓缩病毒；⑥重组逆转录病毒转染NIH-3T3细胞，利用流式细胞术测定病毒感染NIH3T3细胞GFP的表达量，计算重组逆转录病毒滴度。计算公式病毒感染滴度(IU/ml)=NIH3T3细胞总数XGFP阳性率/病毒浓缩液量(ml)。3、鉴定重组逆转录病毒转染的⑶8+T细胞的抗结核和抗HIV活性①采用Ficoll密度梯度离心法，分离HLA-A*0201型健康志愿者外周血PBMC；②磁珠分选CD8+T细胞；③IL-2和抗-⑶3单抗活化分选出的⑶8+T细胞；④按感染复数(multiplicityofinfection,MOI)=13将重组逆转录病毒ρΜΧ-β15-2Α-a17-IRES-GFP感染CD8+T细胞；⑤使用IL-2和抗⑶3单抗刺激感染后的⑶8+T细胞；⑥流式细胞术检测病毒感染后阳性细胞的百分比；⑦测定病毒转染的CD8+T细胞的抗TB活性实验设置以下8组①TCR基因修饰⑶8+T细胞+不负载抗原肽的DC;②未转染CD8.T细胞+负载Ag85B199_207的DC;③未转染CD8+T细胞+负载Eiw12ch128的DC;④空载体转染CD8+T细胞+负载Ag85B199_2Q7的DC;⑤空载体转染CD8+T细胞+负载Eiw12ch128的DC;⑥TCR基因修饰⑶8+T细胞+负载CMVpp65495_503的DC;⑦TCR基因修饰⑶8+T细胞+负载Ag85B199_207的DC;⑧TCR基因修饰CD8+T细胞+负载Eiw12ch128的DC。用酶联免疫吸附分析法(enzyme-1inkedimmunosorbentassay,ELISA)检测上述各组细胞培养上清中IFN-Y、TNF-α的分泌水平；用时间分辨荧光免疫分析技术(time-resolvedfluoroimmuno-assay,TRFIA)检测CD8+T细胞对分别负载结核妝Ag85B199_207(KLVANNTRL)和HIV肽Env12Q_128(KLTPLCVTL)的DC的杀伤活性。其中，CD8+T细胞是人体内的一种细胞亚群，可由人外周血中分离获得，并进行体外扩增培养，分离和培养的实验设备要求低，技术成熟。逆转录病毒载体是由某种逆转录病毒序列构建的基因运载工具，能够携带外源基因或DNA进入宿主细胞，并整合到染色体基因组上，目前已成为商业化产品，容易购买和获得。重组逆转录病毒载体的构建方法为本领域常用的分子克隆技术，重组逆转录病毒转染方法是目前常用的生物技术手段，除本发明中使用的磷酸钙法外，还可以使用其它化学转染法，包括=DEAE-葡聚糖法、人工脂质体法；以及物理方法，包括显微注射、电穿孔、基因枪等。本发明的有益效果在于本发明成功筛选出结核肽Ag85B199_2Q7(KLVANNTRL)和HIV肽Env12(l_128(KLTPLCVTL)双特异的TCR，携带该TCR基因的逆转录病毒转染的CD8+T细胞可成功表达外源性TCR基因，特异性识别结核肽Ag85B199_2(l7(KLVANNTRL)和HIV肽Env12(l_128(KLTPLCVTL)并介导IFN-Y,TNF-α细胞因子分泌和细胞毒活性，这种双特异性使得即使其中一种病原体发生突变产生免疫逃逸时，仍可对另一种病原体产生反应。该方法制备的逆转录病毒载体具有结核/HIV共感染疾病基因治疗的应用价值，可为结核/HIV共感染的过继细胞免疫治疗开辟新径。图I结核肽Ag85B199_2Q7(KLVANNTRL)和HIV肽Env12(l_128(KLTPLCVTL)刺激前后⑶8+T细胞TCRα和β链⑶R3谱型分析；图2重组逆转录病毒载体pMX-hVβ15mCβ_P2A_hVα17mCα-IRES-GFP构建示意图；图3pMX-hVβ15mCβ_P2A_hVa17mCa-IRES-GFP的酶切鉴定(M.DL15000marker；1.pMX-hVβ15mCβ_P2A_hVa17mCa-IRES-GFP；2.pMX-hVβ15mCβ_P2A_hVa17mCa-IRES-GFP的BamHI酶切产物；3.pMX-hVβ15mCβ_P2A_hVα17mCa-IRES-GFP的BamHI+XhoI双酶切产物);图4荧光显微镜观察重组病毒转染后ΝΙΗ3Τ3细胞GFP的表达(X10。a.明场；b.荧光；c.置加图)；图5流式细胞术检测重组病毒转染后NIH3T3细胞GFP的表达(a.未转染；b.pMX-IRES-GFP；c.pMX-hVβ15mCβ_P2A_hVα17mCα-IRES-GFP)；图6荧光显微镜观察重组病毒转染后⑶8+T细胞GFP的表达(Χ20α.pMX-IRES-GFP；b.pMX-hVβ15mCβ_P2A_hVα17mCα-IRES-GFP)；图7流式细胞术检测⑶8+T细胞的GFP表达阳性率(a.未转染；b.pMX-IRES-GFP；c.pMX-hVβ15mCβ_P2A_hVα17mCα-IRES-GFP)；图8ELISA检测⑶8+T细胞IFN-Y的分泌水平；图9ELISA检测⑶8+T细胞TNF-α的分泌水平；图10ELISA检测⑶8+T细胞GrB的分泌水平；图11TRFIA检测CD8+T细胞的杀伤活性。具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。以下实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件操作，例如Sambrook等编著的《分子克隆实验指南》(第三版)(SambrookJ,RussellDW,JanssenK,ArgentineJ.黄培堂等译，2002，北京科学出版社)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。以下实施例中，所有计量资料结果用土s表示，采用单因素方差分析(One-Way八勵￥4)比较各组间细胞因子正^￥、了即-0分泌水平的差异，方差不齐时用Welch校正，采用LSD法进行各组间两两比较，方差不齐时采用Dunnett’sT3法校正。检验水准α=0.05，双侧检验。采用SPSS17.Oforwindows统计软件包进行数据分析。实施例I.筛选结核肽Ag85B199_2Q7(KLVANNTRL)和HIV肽Env12(l_128(KLTPLCVTL)双特异的TCRI.I密度梯度离心法分离纯化PBMC(1)在15ml刻度无菌离心管加入适量Ficoll淋巴细胞分离液；(2)取肝素抗凝的外周静脉血与等量RPMI1640液充分混匀稀释，用巴斯德滴管吸取2倍体积的抗凝血沿管壁缓慢叠加于淋巴细胞分离液上，注意保持界面完整。If20°C，1800"2000rpm/min水平离心2030min；(3)离心后管内液体分为四层，上层为血浆和稀释液，管底主要为红细胞和粒细胞层。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的灰白色云雾层；(4)用吸管插到灰白色层，吸取单个核细胞，置于另一离心管内，加入5倍以上体积的RPMI1640液，1820°C，1500rpm/min离心lOmin，洗涤细胞两次去除大部分混杂的血小板后为PBMC；(5)细胞计数及细胞活力检测PBMC悬液与1/10体积的O.4%台酚蓝染液混合，于血球计数板上计数板上角上四个大方格总细胞数，总细胞数的四分之一数乘以IO4即为每毫升浓度；死细胞可着色台盼蓝，活的不着色，计数200个淋巴细胞，计算活细胞百分率[活细胞率％=(活细胞数/总细胞数)X100%]。1.2制备Ag85B199_2Q7(KLVANNTRL)和HIV肽Env12(l_128(KLTPLCVTL)双特异T细胞克隆(1)计数PBMC,调整PBMC数目为IXIO6/孔，分别加入含结核肽Ag85B199_207(KLVANNTRL)、HIV肽Env12(l_12850ng/ml的10%FBS-1640培养基2ml；(2)37。C、5%CO2条件下培养2h后，加入IL-225U/ml；(3)第3天补加IL-2至50U/ml，第5天加入IL-2100U/ml，之后以此浓度继续培养11天。I.3免疫磁珠(德国美天旎生物公司)分选⑶8+T细胞。I.4总RNA提取试剂盒(OMEGA)提取上述收集到的细胞沉淀的总RNA。I.5逆转录(RT)试剂盒(Fermentas)合成cDNA。I.6PCR扩增34个TCRVa基因家族CDR3片段利用34个TCRVa家族特异性上游引物和共用下游Cα外、内侧引物(参照文献XIN-SHENG等，2006,AnalysisoftheCDR3regionofalpha/betaT-cellreceptors(TCRs)andTCRBDgenedouble-strandedrecombinationsignalsequencebreaksendinperipheralbloodmononuclearcellsofT-Iineageacutelymphoblasticleukemia.Clinical&LaboratoryHaematology.Clinical&LaboratoryHaematology,28:405-415.doi:10.1111/j.1365-2257.2006.00827.x)做半巢式PCR:第一轮PCR:每样本做34个PCR反应管，第I34管分别加入TCRVαI至Vα34家族上游引物，每管加下游共用Ca外侧引物IμI,各引物浓度均为10μΜ。每PCR反应管体积为25μ1，含cDNA模板I.0μ1，10mmol/LdNTP0.5μI,IOXBuffer2.5μl,25mmol/LMgCl2I.5μI,TaqDNA聚合酶O.625U。PCR反应条件95°C预变性3min;95°C30s,60°C30s，72。Clmin，35个循环；72。C延伸lOmin。第二轮PCR:反应总体积为25μ1，含第一轮PCR产物2μl，10mmol/LdNTPO.5μI,10XBuffer2·5μI，25mmol/LMgCl2I.5μI,TaqDNA聚合酶O.625U,TCRVα34个家族上游引物1μ1，下游FAM标记内侧Ca引物Iμ1，各引物浓度均为10μM。PCR反应条件95。C2min；60°C2min，72。C10min，4个循环。I.7PCR扩增24个TCRνβ基因家族CDR3片段(参照文献XIN_SHENG等，2006，Clinical&LaboratoryHaematology,28:405-415.doi:10.1111/j.1365-2257.2006.00827.x)每样本做24个PCR反应管，每管加入TCRCβ-FAM下游引物0.8μ1，第I至第24管分别加入TCRVM至TCRVβ24上游引物0.8μ1，各引物浓度均为10μM。PCR反应体积为25μ1，含cDNA模板Iμ1，10mmol/LdNTP0.5μI,IOXBuffer2.5μl,25mmol/LMgCl2I.5μI,TaqDNA聚合酶O.625U1CR反应条件94°C变性3min;94°Clmin，55°Clmin,72。Clmin，35个循环；72。C延伸lOmin。1.8琼脂糖凝胶电泳取34个TCRVa和24个TCRνβ基因家族PCR产物各8μ1，2%琼脂糖凝胶电泳，100V，20min,采用凝胶成像系统照相。剩余PCR产物-20°C保存备用。I.9CDR3谱型分析取34个Va、24个νβ基因家族FAM荧光标记PCR产物2μ1，在373DNA序列分析仪(ABI,PerkinElmer)上进行6%聚丙烯酰胺凝胶电泳,收集电泳过程中不同时间出现的不同强度的荧光信号，GeneScan672软件自动分析收集的数据，转换为不同位置、高度和形态的峰，代表各TCR家族CDR3成员出现的频率，由此反映各TCR家族的克隆性。其中，具有单峰分布的TCR家族即是抗原特异性单克隆增生的TCR家族。CDR3谱型分析结果显示，结核肽Ag85B199_2(l7(KLVANNTRL)或HIV肽Eiw12ch128(KLTPLCVTL)刺激CD8+T细胞后，部分TCR基因家族谱型发生改变，由原来的8个或多于8个峰型的高斯分布变为少于8个峰的单寡峰分布，表明这些家族是由于Ag85B199_2(l7或Env120^128持续刺激引起的寡克隆或单克隆增生。比较刺激前后CDR3谱型的变化，找出两种肽刺激前为多克隆，刺激后均呈单克隆扩增的Va17、Vβ15基因家族(见图I)。测序结果显示，TCRα17、β15基因⑶R3区的核苷酸序列分别如SEQIDNO:I和SEQIDNO:2所示，这两条CDR3序列编码的氨基酸序列分别如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示。2.构建重组逆转录病毒载体(构建示意图见图2)2.I合成引物依据GeneBank报道的Va17、Vβ15基因家族V区序列特点，设计全长基因上、下游引物，依据9个关键氨基酸突变后的C区序列(即mCa与mCi3)分别设计上、下游引物，依据P2A肽连接序列设计引物,全部引物由Invitrogen上海英骏生物技术有限公司合成，引物名称和序列(5，to3’)如下权利要求1.一种结核/Hiv抗原肽双特异性T细胞受体(TCR)，包括α链和β链，其中，α链的⑶R3区含有SEQIDNO:3所述的序列；β链的⑶R3区含有SEQIDNO:4所示的序列。2.根据权利要求I所述的结核/HIV抗原肽双特异性TCR，其特征在于，所述TCR的α链是由SEQIDNO:10所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰后所得到的能特异与外源性β链装配成TCR蛋白分子的氨基酸序列；β链是由SEQIDNO:6所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰后所得到的能特异与外源性α链装配成TCR蛋白分子的氨基酸序列。3.根据权利要求2所述的结核/HIV抗原肽双特异性TCR，其特征在于，所述α链的氨基酸序列如SEQIDNO:12所示，β链的氨基酸序列如SEQIDNO:8所示。4.编码权利要求f3任一项所述TCR的基因。5.一种结核/HIV抗原肽双特异性TCR的融合基因，其序列如SEQIDNO:13所示。6.一种重组逆转录病毒载体，含有权利要求4或5所述的基因。7.根据权利要求6所述的重组逆转录病毒载体，其特征在于，出发载体包括pMX-IRES-GFP、pMCs-IRES-GFP或pMYx-IRES-GFP。8.权利要求6或7所述的重组逆转录病毒载体经包装后得到的逆转录病毒。9.权利要求8或9所述的逆转录病毒转染的CD8+T细胞。10.权利要求Γ3任一项所述的结核/HIV抗原肽双特异性TCR、权利要求4或5所述的基因，权利要求6或7所述的重组逆转录病毒载体、权利要求8或9所述的逆转录病毒、权利要求10所述的逆转录病毒转染的CD8+T细胞在制备抗结核病、艾滋、艾滋/结核共感染疾病药物中的应用。全文摘要本发明公开了一种结核/HIV抗原肽双特异性TCR、其重组逆转录病毒载体与应用。本发明筛选出结核肽Ag85B199-207(KLVANNTRL)和HIV肽Env120-128(KLTPLCVTL)双特异的TCR，利用逆转录病毒载体将其转染到CD8+T细胞中，获得表达结核肽Ag85B199-207(KLVANNTRL)和HIV肽Env120-128(KLTPLCVTL)双特异TCR的CD8+T细胞。CD8+T细胞可成功表达外源性TCR基因，特异性识别结核肽Ag85B199-207(KLVANNTRL)和HIV肽Env120-128(KLTPLCVTL)并介导IFN-γ、TNF-α、GrB细胞因子分泌和细胞毒活性，这种双特异性使得即使其中一种病原体发生突变产生免疫逃逸时，仍可对另一种病原体产生反应。该方法制备的逆转录病毒载体具有结核/HIV共感染疾病基因治疗的应用价值，可为结核/HIV共感染的过继细胞免疫治疗开辟新径。文档编号C12N5/10GK102911267SQ20121035067公开日2013年2月6日申请日期2012年9月19日优先权日2012年9月19日发明者马骊,周超颖,温茜,罗微申请人:南方医科大学