专利名称：一种霍乱弧菌流行株分子鉴定方法及其issr-pcr引物及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基于简单序列重复区间聚合酶链反应(inter simple sequencerepeat-polymerase chain reaction, ISSR-PCR)技术的食源致病菌分子鉴定方法。具体涉及区分霍乱弧菌流行株与非流行株的ISSR - PCR快速分子鉴定方法；还涉及所述方法中使用的对于霍乱弧菌流行株基因组具有特征性分子分型作用的引物。
背景技术：
霍乱(Cholera)是一个古老的烈性肠道传染病，被称为“摧毁地球最可怕的瘟疫之一”。其临床表现为急性腹泻、呕吐，泻吐频繁、量大，为米泔水样，从而导致脱水、电解质紊乱及周围循环衰竭，严重者可致休克、酸中毒，如不及时抢救，病死率甚高。轻症患者有时类似肠炎，易于漏诊或误诊，其危害性同样不可忽视。由于该病有来势迅猛，传播迅速等特点， 易引起世界大流行，被确定为国际检疫传染病。我国在传染病防治法中规定霍乱属于甲类传染病，必须重点监测和检疫。革兰氏阴性菌-霍乱弧菌(Vibrio Cholerae，VC)是引起霍乱的病原菌。目前已有200多种霍乱弧菌O抗原血清群被鉴定，但只有01群和0139群霍乱弧菌能导致霍乱，并引发世界性大流行。霍乱弧菌可区分为两类菌株，即流行株(Epidemigenic strain)和非流行株(Non-Epidemigenic strain)。这两类菌株在致病力、分子遗传学特征和引起疾病的流行病学特点方面均有显著不同。流行株的致病力强，具有引起流行和大流行的潜力；非流行株存在于自然水体中，一般不致病或仅引起散发的腹泻病例。流行株具有特征性的染色体DNA酶切图谱，与非流行株的酶谱截然不同。CT基因检测也证明，流行株与非流行株存在有与没有CT基因的根本区别。近10年间WHO每年统计的霍乱全球报告病例数均在10-30万例以上，由于漏报和不报等因素的存在，实际病例数要远高于这个数字，而2006-2010年近5年的数据显示霍乱病例呈大幅增加的趋势，疫情又趋严峻，一些发展中国家霍乱流行尤为严重。目前全球最新的流行病学统计数据是世界卫生组织(WHO)于2011年7月29日在WeeklyEpidemiologicalRecord[2011, 86, 325 - 340]上发布的2010年全球霍乱概况[网页地址http://www. who.int/cholera/statistics/en/index, html]。数据显不2010年全球报告给WHO的霍乱病例数显著增加并达到了 2000年来的最高点，总计有317，534例，与2009年相比增加43%，与2000年相比增加了 130% ;而2010年的死亡人数也达到7543例，与2009年相比增加了 52%，病死率达到了 2. 38%。大幅增长的病例数据同时也警示我们，由于国际旅行人员流动的增加可能会促使霍乱的进一步跨地区传播，甚至引起世界范围的大流行。我们知道，由于人员流动的国际化趋势，霍乱等重大传染病能迅速地跨地区传播，已成为当前传染病预防控制面临的重点和难点问题。因此，建立简易、快速、准确的霍乱弧菌分子分型方法对于指导疾病控制部门和国境口岸卫生检疫部门开展霍乱弧菌的监测和大流行的防控具有重要意义。
目前，针对霍乱弧菌流行株的鉴定，经典的方法有免疫血清学诊断结合PCR检测、染色体DNA酶切图谱分析、脉冲场凝胶电泳技术(pulsed field gelelectrophoresis, PFGE)技术和随机扩增多态性 DNA (Randomly Amplified PolymorphicDNA, RAPD)技术等。血清学诊断比较粗糙，只能分出O抗原的不同血清群，试剂成本较高，稳定性也较差；而PCR则用来检测CT基因是否存在。染色体DNA酶切图谱分析操作繁琐，图谱的区别鉴定难度较大。PFGE是分子分型技术，稳定性较好，但是操作复杂，对设备和技术条件要求甚高，并且也较难特异性的区分出流行株和非流行株。RAPD也属分子分型技术，虽然操作简便，但分型能力不够高，容易错误鉴定。简单序列重复(simple sequence repeats, SSR),又称微卫星DNA,即为一至多个核苷酸的3次以上串联重复，如CACACACA，是原核生物中广泛存在的一种遗传标记，部分SSRs表现出长度和位置的高度多态性。简单序列重复区间聚合酶链反应(inter simplesequence repeat-polymerase chain reaction, ISSR-PCR)是Zietkewiecz 于 1994年发明的，利用SSR序列多态性，建立在PCR基础上的一种新型、简易的分子指纹分析鉴定技术，它 不需要复杂的技术设计及昂贵的试剂和仪器设备，克服了以往分子分型技术的不足，更为简便高效，分辨力强，图谱稳定，并且针对某些遗传背景的菌株能够产生特异性的PCR扩增片段，提高了分子鉴定的能力和准确性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种基于ISSR-PCR技术的对霍乱弧菌流行株基因组具有特异性分子鉴定作用的引物及试剂盒；本发明还提供了一种利用上述引物基于ISSR-PCR技术对霍乱弧菌流行株和非流行株进行分子鉴定的方法。本发明一种霍乱弧菌流行株与非流行株分子鉴定用引物所采用的技术方案是，一种霍乱弧菌流行株分子鉴定用ISSR-PCR引物，所述引物的碱基序列表示如下引物pGA5 5，-ACGAGAGAGAGA-3，。一种霍乱弧菌流行株分子鉴定用试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的引物pGA5。所述试剂盒还包括2 X ISSR-PCR反应液和Taq DNA聚合酶，所述2 X ISSR-PCR反应液包括如下组分20mM 的 ρΗ8· 3 的 Tris-HCl，IOOmM 的 KC1，4mM 的 MgCl2,0. 6mM 的 dNTP，2.4“] 的引物？6八5。试剂盒反应体系总体积为25 μ L，含有2 X ISSR-PCR反应液12. 5 μ L，待检测基因组DNAlOOng 500ng，Taq DNA聚合酶I. 5U，其余为灭菌超纯水。一种霍乱弧菌流行株分子鉴定方法，其特征在于包括如下步骤(I)提取待测试样品DNA ；(2)采用如上任一所述的试剂盒对待测试样品DNA进行ISSR-PCR扩增和电泳；(3)分析电泳图谱，判定检测结果。所述鉴定方法还包括3个参比对照DNA :分别为01群霍乱弧菌非流行株、01群霍乱弧菌流行株及0139群霍乱弧菌流行株。所述鉴定方法的ISSR-PCR反应条件是95°C预变性3min，然后在94°C 40sec,45°C 60sec,72°C 120sec条件下进行3步PCR循环扩增，循环次数为30次，最后在72°C保温 IOmin。本发明的有益效果是本发明通过提供对霍乱弧菌流行株具有特异性分子鉴定作用的I条ISSR-PCR引物，及包含上述引物的试剂盒及检测方法，来检测某一分离获得的霍乱弧菌菌株基因组DNA，进而确定该霍乱弧菌菌株是否为流行株。本发明所述分子鉴定方法具有以下优点①操作简便只需通过常规的PCR扩增和电泳分析就能得到检测结果；②成本低廉=ISSR-PCR检测所需试剂成本很低，单次检测不超过50元；③特异性强通过精心设计并结合大量样本筛查优化选择出的I条ISSR-PCR引物能产生一条约350bp的特异性扩增片段，能准确的区分霍乱弧菌流行株和非流行株。④重复性好不同时间、不同操作者的数次实验所获得的指纹图谱稳定。
图I是实施例四中，采用本发明的ISSR-PCR方法对25份霍乱弧菌进行分析，结果显示，其中，I VC01 ；2 VC02 ；3 VC03 ；4 VC04 ；5 VC05 ；6 VC06 ；7 VC07 ；8 VC08 ；9 VC09 ；10 VC10 ；11 VC11 ；12 VC12 ；13 VC13 ；14 VC14 ；15 VC15 ；16 VC16 ；17 VC17 ；18 VC18 ；19 VC19 ；20 VC20 ；21 VC21 ；22 VC22 ；23 VC23 ；24 VC24 ；25 VC25 ；M IOObp DNAMarker0
具体实施例方式下面通过具体的霍乱弧菌流行株ISSR-PCR分子鉴定方法的研究过程来对本发明进行说明。实施例一 ISSR — PCR引物的设计首先从美国NCBI的基因库下载霍乱弧菌的全基因组DNA序列，然后根据霍乱弧菌流行株和非流行株之间基因组DNA序列多态性位点存在显著差异的普遍性，系统分析霍乱弧菌全基因组DNA中简单序列重复(SSR)这一遗传标记的序列特征和分布数量，设计一组ISSR-PCR引物，然后选择100份不同类型的霍乱弧菌菌株(包括01群VC非流行株、01群VC流行株、0139群VC流行株，以上菌株部分分离自水产品，部分分离自海水，部分分离自霍乱病人)进行ISSR-PCR实验进行筛选，最后本发明优选出如下I条引物引物pGA5:5’ -ACGAGAGAGAGA-3’，序列编号为 SEQ ID NO. I ；为保证引物的质量，委托大连宝生物工程有限公司以HPLC的纯度标准进行合成。实施例二 霍乱弧菌ISSR-PCR分子鉴定方法的试剂组成针对ISSR-PCR反应体系一些重要的影响因素进行条件的优化。I.方法首先确定ISSR-PCR反应体系中Mg2+浓度、dNTP的浓度及引物的浓度最佳值。(I) Mg2+浓度的确定按照表I的反应体系配制2X ISSR-PCR反应液，其中分别添加并调节Mg2+的终浓度至5. 0mM、4. OmM,3. OmM,2. OmMU. 0mM、0. 5mM,以霍乱弧菌基因组DNA为模板进行ISSR-PCR扩增。实验结束后比较不同Mg2+浓度对扩增效率和指纹图谱的影响。表I
权利要求
1.ー种霍乱弧菌流行株分子鉴定用ISSR-PCR引物，其特征在于所述引物的碱基序列表示如下引物 pGA5 :5’ -ACGAGAGAGAGA-3’。
2.ー种霍乱弧菌流行株分子鉴定用试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括如权利要求I所述的引物PGA5。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括2X ISSR-PCR反应液和Taq DNA聚合酶，所述2 X ISSR-PCR反应液包括如下组分20mM 的 ρΗ8· 3 的 Tris-HCl，IOOmM 的 KCl, 4mM 的 MgCl2,0. 6mM 的 dNTP, 2. 4 μ M 的引物pGA5。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于试剂盒反应体系总体积为25μ L，含有2 X ISSR-PCR反应液12. 5 μ L，待检测基因组DNA IOOng 500ng，Taq DNA聚合酶为1.5U，其余为灭菌超纯水。
5.ー种霍乱弧菌流行株分子鉴定方法，其特征在于包括如下步骤 (1)提取待测试样品DNA; (2)采用如权利要求2 4任一所述的试剂盒对待测试样品DNA进行ISSR-PCR扩增和电泳； (3)分析电泳图谱，判定检测結果。
6.根据权利要求5所述的鉴定方法，其特征在于所述鉴定方法还包括3个參比对照DNA 分别为Ol群霍乱弧菌非流行株、01群霍乱弧菌流行株及0139群霍乱弧菌流行株。
7.根据权利要求5所述的鉴定方法，其特征在于所述鉴定方法的ISSR-PCR反应条件是 95°C预变性 3min，然后在 94°C 40sec，45°C 60sec，72°C 120sec 条件下进行 3 步 PCR 循环扩增，循环次数为30次，最后在72°C保温lOmin。
全文摘要
本发明公开了一种霍乱弧菌流行株分子鉴定方法及其ISSR-PCR引物及试剂盒，该ISSR-PCR引物的碱基序列表示如下5’-ACGAGAGAGAGA-3’。本发明通过提供对霍乱弧菌流行株具有特异性分子鉴定作用的1条ISSR-PCR引物，及包含上述引物的试剂盒及检测方法，来检测某一分离获得的霍乱弧菌菌株基因组DNA，进而确定该霍乱弧菌菌株是否为流行株。本发明所述分子鉴定方法具有以下优点①操作简便；②成本低廉；③特异性强，能准确的区分霍乱弧菌流行株和非流行株；④重复性好。
文档编号C12N15/11GK102839219SQ201210356579
公开日2012年12月26日 申请日期2012年9月21日 优先权日2012年9月21日
发明者莫秋华, 林继洪, 梁玉英, 杨泽, 杜田, 赵俊华, 史咏梅, 王琪 申请人:珠海国际旅行卫生保健中心