专利名称：三七快速鉴定方法
技术领域：
本发明术语中药材来源品种鉴定技术领域，具体涉及用特异的SNP鉴定三七的方法。
背景技术：
三七(Panax notoginseng (Burk. ) F. H. Chen)是人参属多年生植物,是我国传统中药材，含有多种生物活性成分。三七是名贵中药材，具有散瘀止血，消肿定痛之功效。可治疗各种出血症,人参“补气第一”，三七“补血第一”，味同而功亦。三七与人参(Panax ginsengC. A. Mey)、西洋参(Panax quinquefolium L.)、竹节参(Panax japonicus C. A. Mey.)及其变种狭叶竹节参(Panax japonicus C. A. Mey. var. angustifius (Burk) Cheng et Chu)、珠子参(Panax japonicus C. A. Mey. var. major (Burk) C. Y. Wu et Κ. M. Feng)、姜状三七(Panax zingiberensis C. Y. Wu et K.)、屏边三七(Panax stipuleanatus Tsai et Feng)和假人参(Panax pseudoginseng Wall.)均作为药物使用，它们来源于同科、同属，为亲缘关系相近的植物，这几种药物在药性和功效方面有很大区别，尤其是三七归为活血、止血类药物而非滋补性药物，在中医临床上也区别使用。三七药材价格昂贵，市场上常出现其混伪品。由于三七与其近缘种、混伪品外形类似，传统的性状鉴别对三七与其近缘种的鉴定有一定困难，尤其对于药材市场存在的三七切片、粉末、种子和种苗的鉴别具有更大障碍。这就需要寻找到一种稳定可靠的方法将三七药材、饮片、粉末加以鉴定区分。
发明内容
本发明第一个目的在于提供三七鉴定用SNP标记。本发明第二个目的在于提供三七鉴定用SNP标记在三七鉴定中的应用。本发明第三个目的在于提供三七快速鉴定方法本发明提供的三七鉴定用SNP标记，其核苷酸序列如SEQ ID No. I所示，其中，SEQID No. I所示序列的5’端起第140位三七为T，其他物种为A或缺失；第207位三七为T，其他物种为C或A。本发明提供的SNP可用于鉴定三七，如果自SEQ ID No. I所示序列的5’端起第140位为T或第207位为T，则鉴定为三七，如果自SEQ ID No. I所示序列的5’端起第140位和第207位不为T，则待鉴定样品不是三七。本发明提供的三七鉴定方法，其包括如下步骤I)以待测样品DNA为模板，扩增含有SEQ ID No. I所示序列的片段；2)对扩增产物进行测序，拼接后去除序列两端5. 8S和26S基因区，获得完整ITS2基因间隔区，通过分析SEQ ID No. I所示的序列，确定自SEQ ID No. I所示序列的5’端起第140位或第207位的碱基。其中，如果自SEQ ID No. I所示序列的5’端起第140位为T或第207位为T，则鉴定为三七，否则不是三七。
本发明扩增时使用的弓丨物序列为ITS2F 5' -ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3'ITS3R 5' -GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3'上述引物用于扩增三七的ITS2序列。本发明还提供含有上述弓I物的试剂盒。本发明提供了上述试剂盒在三七鉴定中的应用。本发明方法适用性更广，能检测所有能提取出DNA的三七任何样品。因此，能够实现三七原植物与近缘种、药材、生饮片、粉末与混淆品的快速、准确鉴定。
图I所示为ITS2序列的扩增结果，其中1-11分别代表SN01-SN11的扩增结果，CK为阴性对照。图2所示为三七(P. notoginseng)的三个种内变异类型。图3所示为三七(P. notoginseng)和其他物种ITS2序列的比对结果，其中图3a为ITS2基因间隔区，5’端起第140位，三七为T，其他物种为A或缺失；图3b为在第207位，三七为T，其他物种为C或A。图4所示为三七与混伪品构建NJ树结果。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例I三七药材原料的鉴定方法I)从不同药材商店和道地产地(云南)收集的24份三七样品，分别取20mg药材，在MM400球磨仪(德国Retsch)上进行研磨，用天根生化科技(北京)有限公司的植物基因组DNA试剂盒提取总DNA。表I三七样品信息表l-f'J-编 O_§#_购买商I,tT_
1soi三七《报)北京好得快药房农大路(I)^
2SQ02三七(根)北京好得快药房农大路(2)
3SQ03三七(根)北京宏生堂农大路店
4SQ04三七(根)北京济安堂五道口店
5SQ05三七(根)北京同仁堂百tt店(1)
6SQ06三七(根)北京同仁堂北新挢店7SQ07三七(根)北京同仁堂西苑店 8SQ08三七(拫)北京同芝堂东单店
9SQC)9三七(根)北京中卫神州大药房
10SQlO三七(拫)北京永安堂百萆药店王府弁店
11SQll三七(根)云南(道地药tt)
12SQ12三七(根)云南(道地药材)
13SQ13三七(根)云南(道地药材)
14SQ14三七(根)北京同仁堂冒旺店(2)
15SQ15三七(根)北京同仁堂北京站店
16SQ16三七(根)北京同仁堂崇文门店
17SQ17三七《极)北京同仁堂王.府井店
18SQiX三七(根)北京京隆堂崇文门店
19SQ19三七(振)云南(遁地药紂)20SQ20三七(根)云南(遒地药材)
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22SQ22三七《拫)云南(道地药材)
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24_SQ24_三七(根)云南(遒地药翁)_2) PCR 扩增引物序列为ITS2F ATGCGATACTTGGTGTGAAT ； ITS3R GACGCTTCTCCAGACTACAAT,由生工生物工程公司有限公司(北京)合成。引物用无菌去离子溶解并稀释至2 μ mol/μ L。25 μ L 反应体系PCR Buffer (IOX) 2· 5 μ L, Mg2+ 2 μ L(25mmol/L)，dNTPs 混合物2μ L (2. 5mmol/L)，引物各 I. O μ L (2· 5 μ mol/L)，模板 DNA I μ L (-约 30ng)，Taq DNA 聚合酶I. OU,加灭菌双蒸水至25 μ L，进行PCR扩增。PCR反应程序在PCR仪上按照以下程序进行扩增反应
94°C, 5 min 940C, 30 s ^
56eC, 30 s 40 >
72。。, 45 s-
72 eC, 10 miiie分别取5 μ L的PCR扩增产物上样，用1%的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳后在凝胶成像仪上检测结果。(图I)
3)测序PCR产物直接送中国农业科学院重大工程实验室测序。测序引物同本发明的ITS2F和ITS3R的PCR引物。为确保DNA条形码序列的可靠性，需要进行正反向测序或重复测序，然后将正反向测序结果进行拼接获得DNA条形码序列。
4)序列拼接本实施例米用应用软件CodonCode Aligner 3.7.1 (CodonCode Co. , Germany)进行序列拼接及校对。首先，进行测序质量评估及预处理，即去除测序结果两端的低质量部分，并对剩余部分进行质量评估，如果满足质量要求，方可用于序列拼接，具体方法是以20bp的窗口分别从序列5’端和3’端进行滑动,如果窗口内有多于2个碱基的Q值小于20,则删除一个碱基，窗口继续滑动，如果窗口内碱基Q值小于20的数目小于或等于2个，窗口停止滑动。测序结果的剩余部分需大于150bp，且平均Q值大于等于30。最后进行序列拼接，根据Hidden Markov Model (HMM)模型，去除序列两端5. 8S和26S基因区，获得完整的三七ITS2基因间隔区序列。从GenBank中下载药典规定的五种人参属药用植物及三七混伪品的ITS/ITS2序列，同样根据Hidden Markov Model (HMM)模型，去除序列两端5. 8S和26S基因区，获得完整的ITS2基因间隔区序列。5)序列比对用MEGA 5软件对测序并拼接后的各个样品以及GenBank中人参属植物的ITS2基因间隔区序列进行比对，共获得2个SNP位点，所有三七样品的ITS2基因间隔区序列(SEQID No. I)的第140位为T，第207位为T，而其他物种(姜状三七、羽叶三七、竹节参、狭叶竹节参、西洋参、假人参)的ITS2基因间隔基因区序列的第140位为A或缺失，第207位为C或A，表明这两个SNP位点可特异性地用于三七的鉴定。这两个SNP位点存在于所有实验数据及GenBank数据中，由于数据较多，图3a和图3b仅显示了部分序列比对结果。三七存在较小种内变异(包括所有实验数据及GenBank数据)，图2列出了三七的三个种内变异类型，种内变异位点不影响三七两个特异的SNP位点的鉴定。6)构建系统发育树(NJ树)由于三七的伪品莪术和高良姜的ITS2序列与三七的相差较大，可直接构建NJ树将其区分。将完整的三七及莪术(Curcuma phaeocaulis)、高良姜(Alpinia officinarum)的ITS2序列导入MEGA5软件中进行比对，用比对结果构建以K2P为模型的NJ树，结果如图4所示。实施例2三七饮片的鉴定基本同实施例1，所不同的是以三七饮片为样品，提取DNA，进行鉴定，结果也能特异性地检测到上述的2个SNP位点。并且序列对比发现，三七饮片DNA的ITS2基因间隔区序列(SEQ ID No. I)的第140位为T，第207位为T。实施例3三七粉末的鉴定基本同实施例1，所不同的是以三七粉末为样品，提取DNA，进行鉴定，结果也能特异性地检测到上述的两个SNP位点，并且序列对比发现，三七粉末DNA的ITS2基因间隔区序列(SEQ ID No. I)的第140位为T，第207位为T。本发明序列表中SEQ ID No. I为三七(P. notoginseng)的一致序列(consensussequence)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.一种三七鉴定用SNP标记，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No. I所示，其中，SEQ ID No. I所示序列的5’端起第140位为T或第207位为T。
2.权利要求I所述的SNP标记在鉴定三七中的应用，其特征在于，如果自SEQID No. I所示序列的5’端起第140位为T或第207位为T,则鉴定为三七。
3.—种三七快速鉴定方法，其包括如下步骤 O以待测样品DNA为模板，扩增含有SEQ ID No. I所示序列的片段； 2)对扩增产物进行测序，拼接后去除序列两端5. 8S和26S基因区，获得完整ITS2基因间隔区，通过分析SEQ ID No. I所示的序列，确定自SEQ ID No. I所示序列的5’端起第140位或第207位的碱基。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，如果自SEQID No.l所示序列的5’端起第140位为T或第207位为T，则鉴定为三七，如果自SEQ ID No. I所示序列的5’端起第140位和第207位不为T，则待鉴定样品不是三七。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，用于扩增含有SEQID No. I所示序列的片段的引物为正向 ITS2F 5' -ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3' 反向 ITS3R 5' -GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3'。
6.一种试剂盒，其特征在于，含有以下引物正向 ITS2F 5' -ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3' 反向 ITS3R 5' -GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3'。
7.权利要求6所述的试剂盒在鉴定三七中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种三七快速鉴定方法，其包括如下步骤1)以待测样品DNA为模板，扩增含有SEQ ID No.1所示序列的片段；2)对扩增产物进行测序，分析SEQ ID No.1所示的序列，如果自SEQ ID No.1所示序列的5’端起第140位为T或207位为T，则鉴定为三七，如果自SEQ ID No.1所示序列的5’端起第140位和第207位不是T，则待鉴定样品不是三七。本发明能够实现三七原植物及其近缘种、药材、生饮片、粉未和混淆品的快速、准确鉴定。
文档编号C12N15/11GK102888456SQ201210357278
公开日2013年1月23日 申请日期2012年9月21日 优先权日2012年9月21日
发明者廖保生, 韩建萍, 陈晓辰, 陈士林 申请人:中国医学科学院药用植物研究所