专利名称：一种海洋过氧化氢酶产酶菌及其定向筛选方法
技术领域：
本发明属于海洋生物工程技术领域，具体涉及ー种海洋过氧化氢酶高产菌及采用自创的半固体培养基定向筛选过氧化氢酶高产菌株的方法。
背景技术：
纺织エ业是我国传统产业和支柱产业，在国内生产总值和外贸出口总值中占据重要地位。当前纺织业产生污染严重，尤其是在印染加工过程中，传统エ艺耗费大量的水和化学品，不仅耗费资源，同时还造成环境污染，破坏生态平衡。改变纺织行业高耗能、高污染的传统粗放经济增长方式，须以绿色生物技木工业替代、改造纺织エ业过程，促进纺织エ业产业升级，从源头上解决纺织エ业过程的资源短缺与环境污染等问题。采用高效生物催化剂參与的酶处理工艺替代传统化学处理工艺具有良好的经济 效益和环保效益。以过氧化氢酶为技术关键的氧漂生物净化工艺及漂染ー浴エ艺是其中的技术热点之一。织物氧漂后添加过氧化氢酶取代传统的化学还原剂及水洗处理，达到去除残余H2O2的同时可直接进行后续染色。利用过氧化氢酶分解漂浴中剰余的过氧化氢，是至今为止发现的最为高效的生物酶催化反应之一，其主要优点有在冷水中作用可节约大量能源；水解产物为水和氧气，对环境零污染；缩短漂白和染色之间的冲洗时间；织物漂白后一次酶洗就能达到三次水洗的脱氧效果。除了纺织行业外，制浆和造纸エ业中采用过氧化氢进行漂白已十分普遍，如无氯漂白(ECF)和全无氯漂白(TCF)エ艺，后续除氧エ艺中需过氧化氢酶为代表的除氧剂參与。近年来过氧化氢还被用于エ业废水的处理的中，全球每年的过氧化氢用量正以8 10%的速度递增，大量高浓过氧化氢废水破坏了水处理过程中的活性污泥，给水处理带来极大压力，因此过氧化氢酶在废水预处理中也具有较大应用前景。此外，过氧化氢酶还可用于其它需要安全、快速地清除过氧化氢场合，例如食品和医疗领域等。采用微生物发酵获取过氧化氢酶的方法与其它方法相比具有一定优势。以往过氧化氢酶主要从动物肝脏中提取，粗产物经巴氏消毒和硅藻土助滤方法处理，酶液和样品损失大，对动物自身携帯的病毒往往束手无策，对下游酶制剂使用人员健康存在一定隐患。此夕卜，传统方法受原材料限制，对日益増加的酶需求量也不堪重负。采用微生物发酵获取过氧化氢酶，能利用秸杆、淀粉、琼脂等廉价底物，酶产量大、可变废为宝，对环境影响极小。微生物发酵规模化生产过氧化氢酶在环境和经济方面均具有一定优势。过氧化氢酶广泛存在于需氧微生物中，目前国外已采用不同种属的菌株发酵生产过氧化氢酶，部分已经商品化。据美国专利报告，以发酵方式所获得的过氧化氢酶产量较低。国内发酵法生产过氧化氢酶所涉及的菌株较少。目前产业界所使用的过氧化氢酶，不论是在来源及制备方法方面都有较大的改良空间。
发明内容
本发明的ー个目的是提供一种能生产过氧化氢酶的高产量菌株。
本发明的菌株是一株采用半固体培养基筛选方法筛选获得的过氧化氢酶产酶菌，分类命名为中华动性杆菌(Planomicrobium chinense),分离自海洋海水样品,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 6043,保藏地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所(100101 )，保藏日期为2012年4月24曰。经形态鉴定及生物学特性研究，保藏号为CGMCC No. 6043的菌株具有以下特征(I)菌落形态菌落呈圆形，表面光滑，边缘平整，微凸起，黄色；(2)细胞形态革兰氏阳性菌，细胞显微镜下(Olympus，BX40)呈现运动性，形态为球状居多(0. 8X1. Oiim)；(3)生理生化特征好氧生长；水解明胶，不水解淀粉、酪素、吐温80和七叶树素；能利用葡萄糖产酸，不能利用蔗糖、棉子糖、木聚糖、乳糖、阿拉伯糖、纤维ニ糖、木糖、鼠李 糖、密ニ糖、甘露糖或甘露醇产酸。对保藏号为CGMCC No. 6043菌株的16S rRNA基因进行PCR扩增与序列測定，发现16S rRNA基因部分片段长度为569bp (Seq ID No. I)，与已知的中华动性杆菌标准菌株(P. chinense)的16S rRNA基因序列相似性为99%。CGMCC No. 6043菌株的16S rRNA序列具体可见序列表。因此，參照《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology》第二版的内容,根据菌株限制因子特点、形态特征和生理生化指标，结合16S rRNA基因序列相似性，鉴定菌株CGMCC No. 6043为中华动性杆菌(P. chinense)。菌株CGMCC No. 6043与中华动性杆菌标准菌株P. Chinense CGMCC I. 3454T相比，前者具有氧化酶(oxidase)活力，后者氧化酶反应阴性，且后者过氧化氢酶活力不及前者1/100。本发明的另一目的是提供了ー种利用所述的CGMCC No. 6043菌株生产过氧化氢酶的方法。采用P. chinense CGMCC No. 6043生产过氧化氢酶，以CGMCC No. 6043菌株为出发菌种，经种子培养和液体发酵得到过氧化氢酶，包括以下步骤(I MfCGMCC No. 6043菌株接种至天然海水液体培养基，培养后加入过氧化氢进行刺激培养作为种子液；(2)将种子液转接至发酵培养基中进行发酵培养，然后加入过氧化氢刺激培养，即可得到具有过氧化氢酶活力的发酵液。上述方法步骤(I)中，所述的天然海水培养基的配方包括0. 1-0.5%蛋白胨，0. 1-0. 5%Casamino acid，0. 005-0. 05%酵母提取物，其余为天然海水，调节pH为6. 8-7. 5。一个优选的实施例中，天然海水液体培养基包括0. 25%蛋白胨，0. 25%Casamino acid，0. 01%酵母提取物，其余为天然海水，调节pH为7. 2。步骤(I)中细菌培养时间为8-40小时，优选20-30小时；培养温度为20_40°C，优选28-35°C。培养结束后加入I-IOmM的过氧化氢刺激培养1_10小时，优选加入2_5mM的过氧化氢刺激培养2-5小时上述方法步骤(2)中，所述的发酵培养基配方包括l_10g/L酵母抽提物，0. 5-5g/L蛋白胨，其余为天然海水，pH为6. 5-8. 0 ;优选的配方包括3-6g/L酵母抽提物，l_3g/L蛋白胨，其余为天然海水，PH为7. 0-7. 5 ;培养时间为8-40小时，优选20-30小时；培养温度为20-40°C，优选28-35°C。培养结束后加入I-IOmM的过氧化氢刺激培养1_10小时，优选加入2-5mM的过氧化氢刺激培养2-5小吋。根据上述方法可获得过氧化氢酶活力为100-1000U/mL的发酵液，在一个优选的实施例中酶活力为754U/mL。根据需要，可任选对具有酶活力的发酵液进行处理，从中分离纯化出过氧化氢酶，优选的分离纯化条件如离子交换层析、反相层析、疏水层析、分子筛层析或其组合。
本发明的另一目的是提供一种采用自创半固体培养基定向筛选过氧化氢酶高产菌株的方法。该方法是将过氧化氢包含在下层半固体琼脂中，任其缓慢渗透到上层液体培养基的方法。该方法持续而稳定地给于上层液体培养基中微生物一定的氧化压力，从而达到定向富集过氧化氢酶高产菌株的目的。本发明所述的定向筛选过氧化氢酶高产菌株的方法包括如下步骤(I)、将海水样品在无菌条件下加入半固体培养基中，并加入预先过滤除菌的碳和
氮源，震摇富集培养；(2)、对富集培养液进行无菌稀释涂布，挑选单克隆进行斜面保存；(3)、将分离获得的菌株转接至天然海水液体培养基进行摇瓶发酵，采用分光光度法进行过氧化氢酶活性复筛，最終筛选出过氧化氢酶活相对较高的菌株。上述方法步骤(I)中，所述的半固体培养基通过如下方法制备将天然海水采用NaOH或HCl微调pH至6. 8-7. 5，加入质量百分数为0. 5-1%的琼脂湿热灭菌，待温度降低至40-60°C左右在无菌条件下加入过滤除菌的0. 5-10mM过氧化氢，混匀后冷却凝固制成半固体培养基。—个优选的实施例中，所述的半固体培养基通过如下方法制备将4. 5mL天然海水采用NaOH或HCl微调pH至7. 2，加入质量百分数为0. 75%的琼脂121°C湿热灭菌20分钟，待温度降低至50°C左右在无菌条件下加入过滤除菌的30%过氧化氢4 y L，混匀后冷却凝固制成半固体培养基。步骤(I)中，将来自海洋的海水样品在无菌条件下加入半固体培养基中，并加入预先过滤除菌的碳和氮源，其终浓度为0. 1-0. 5%蛋白胨，0. 1-0. 5%Casaminoac i d，0. 005-0. 05%酵母提取物。在一个优选的实施例中，其终浓度为0. 25%蛋白胨，0. 25%Casamino acid，0. 01%酵母提取物。25_37°C (优选28°C )震摇富集培养2-5天左右(优选4天左右)。对富集培养液进行无菌稀释涂布，挑选单克隆进行斜面保存。上述方法步骤(3)中，将分离获得的菌株转接至天然海水液体培养基进行摇瓶发酵，采用分光光度法进行过氧化氢酶活性复筛。其中天然海水液体培养基包括0. 1-0.5%蛋白胨，0. 1-0. 5%Casamino acid，0. 005-0. 05%酵母提取物，其余为天然海水，调节pH为
6.8-7. 5。一个优选的实施例中，天然海水液体培养基包括0. 25%蛋白胨，0. 25%Casaminoacid，0. 01%酵母提取物，其余为天然海水，调节pH为7. 2。分光光度法是依据过氧化氢在240nm下吸光值大小与其浓度呈线性关系而测定酶浓度。方法如下(I)将细胞液进行破胞处理得到粗酶液；(2)反应体系为300 u L，包括粗酶液5 u L，磷酸缓冲液195 u L，IOmM H2O2溶液100 u L，以水替代H2O2溶液作为空白对照；以H2O2溶液的加入起动酶促反应；(3)測定条件为Icm比色杯，30°C，以240nm下吸光度的下降来衡量过氧化氢的酶促降解速度；(4)每隔5s读取一次吸光度值，Imin后停止測定；(6)吸光值的下降率作为依据计算粗酶液的酶活大小。一个标准酶活单位(IU)定义为在30°C下，姆分钟降解lymol H2O2 (I ii mol/min)所需的酶量。酶活计算(A OD24tl/A t) X 1000 X稀释倍数X反应体系体积/ (43. 6 X酶液体积)，43. GM-1CnT1为H2O2在240nm下的摩尔消光系数。对复筛获得的菌株进行过氧化氢刺激，提高酶活和酶量。菌株接入天然海水液体培养基进行摇瓶发酵，28°C培养24h至对数生长末期。加入终浓度为4mM的过氧化氢刺激振摇I小时后，采用分光光度法測定其酶活大小。综合考虑酶活和产酶能力提升幅度，最終筛选获得一株过氧化氢酶活相对较高的菌株，例如发酵液酶活力达到100U/mL可定义为活性相对较高的菌株，优选酶活力达到500U/mL以上者。CGMCC No. 6043菌株即通过上述步骤筛选得到，发酵液中酶活力可达到754U/mL。本发明提供了一种自创半固体培养基定向筛选过氧化氢酶高产菌株的方法以及采用该方法获得ー种海洋过氧化氢酶高产菌CGMCC No. 6043菌株。本发明的菌种筛选方 法与其他常规筛选方法相比较，具有高选择性和高效率的特点。本发明发现的P. chinenseCGMCC No. 6043过氧化氢酶高产菌生长周期短，酶活性高，成本低廉，适合广泛运用于食品エ业和エ业废水处理等方面。因此本发明的方法和发酵产酶菌株有广泛的エ业使用价值和显著的经济效益前景。
具体实施例方式实施例I常规方法、液体培养基筛选方法和半固体培养基筛选方法采集海水样品，取150 梯度稀释后涂布于天然海水寡营养培养基平板，28°C培养7天左右观察結果，挑取单菌落进行斜面保存。利用3%过氧化氢鼓泡法初步筛选过氧化氢酶活性菌株。天然海水寡营养培养基为0. 5g/L酵母抽提物，0. lg/L蛋白胨，pH为7. 2，其余为天然海水。取4. 5mL海水样品加入4. 5mL无菌陈海水中，在无菌条件下依次加入过滤除菌的30%过氧化氢4 ii L和预先过滤除菌的碳、氮源(终浓度为0. 25%蛋白胨，0. 25%Casaminoacid和0. 01%酵母提取物)。28°C震荡富集培养4天左右，对富集液进行无菌稀释适当倍数，涂布平板，挑选单克隆进行斜面保存。取4. 5mL海水样品在无菌条件下加入半固体培养基中，并加入预先过滤除菌的碳、氮源，终浓度为0. 25%蛋白胨，0. 25%Casamino acid和0. 01%酵母提取物。28°C震荡富集培养4天左右，对富集液进行无菌稀释适当倍数，涂布平板，挑选单克隆进行斜面保存。采用上述三种方法筛选获得的菌株转接至天然海水液体培养基进行摇瓶发酵，采用分光光度法进行过氧化氢酶活性复筛。采用半固体培养基提供持续氧化压カ的定向筛选方法效率最高。复筛获得若干过氧化氢酶高活性菌株，均为半固体培养基定向筛选方法获得。采用液体培养基提供直接氧化压カ的筛选方法效率次之，采用普通分菌和过氧化氢初筛相结合的方法效率极低。实施例2中华动性杆菌(P. chinense) CGMCC No. 6043的分离筛选采集海水样品，无菌条件下半固体培养基中加入4. 5mL海水样品，以及预先过滤除菌的碳、氮源，终浓度为0. 25%蛋白胨，0. 25%Casamino acid和0. 01%酵母提取物。28°C震荡富集培养4天左右，对富集液进行无菌稀释适当倍数，涂布平板，挑选单克隆进行斜面保存。上述方法分离得到的菌株转接至天然海水液体培养基进行摇瓶发酵，采用分光光度法进行过氧化氢酶活性复筛。天然海水培养基为无菌陈海水，终浓度为0. 25%蛋白胨，0. 25%Casamino acid 和 0. 01% 酵母提取物，pH 7. 2。对分离得到的高过氧化氢酶活性菌株进行过氧化氢刺激法优化。菌株接种至天然海水液体培养基进行摇瓶发酵，28°C培养24h至对数生长末期。加入终浓度为4mM的过氧化氢，刺激振摇Ih之后，用分光光度法測定其酶活比的大小。最終筛选得到ー株过氧化氢酶活力相对较高的菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为 CGMCC No. 6043。 实施例3中华动性杆菌(P. chinense) CGMCC No. 6043的形态鉴定及生物学特性中华动性杆菌(P. chinense)CGMCC No. 6043接种于天然海水液体培养基中。制备固体培养基可再加入15g/L的琼脂。121°C湿热灭菌20分钟。接种培养后，经鉴定，该菌具有以下特征(I)菌落形态菌落呈圆形，表面光滑，边缘平整，微凸起，黄色。(2)细胞形态革兰氏阳性菌，细胞显微镜下(Olympus，BX40)呈现运动性，形态为球状居多(0. 8 X I. 0um)o
(3)生理生化特征好氧生长；水解明胶，不水解淀粉、酪素、土温80和七叶树素；能利用葡萄糖产酸，不能利用蔗糖、棉子糖、木聚糖、乳糖、阿拉伯糖、纤维ニ糖、木糖、鼠李糖、密ニ糖、甘露糖或甘露醇产酸。实施例4中华动性杆菌(P. chinense)CGMCC No. 6043的16S rRNA基因的PCR扩增与序列測定中华动性杆菌(P. chinense) CGMCC No. 6043接种于天然海水固体培养基中，从斜面中直接挑取ー环菌体，加入400 y L无菌水混匀，100°C水浴5分钟，12000rpm离心2分钟，上清直接用于PCR。扩增16S rRNA基因的ー对通用引物如下正向引物5’ -AGAGITTGATCCTGGCTCAG-3’ ；反向引物5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’；上述引物分别对应大肠杆菌的16S rRNA基因的8 — 27和1510 — 1492位碱基。PCR 反应体系(50 ii L)为10 X buffer 5 u L, IOmM dNTPsl y L，4mM 引物各 I y L，无菌纯水42ii L，Taq 酶 0. L，模板 DNAO. し PCR 反应条件为94°C变性 45s ;55°C退火 45s ；72°C延伸90s，30个循环后72°C延伸lOmin。PCR产物纯化与序列测定由北京诺赛基因组研究中心有限公司完成。完成测定的16S rRNA基因部分片断长度为569bp，与菌株P. chinenseJCM 124661 的 16S rRNA 基因序列相似性为 99%。菌株 P. chinense CGMCC No. 6043 的 16SrRNA序列具体可见序列表。因此，參照《Bergey’sManual of Systematic Bacteriology》第二版内容,根据菌株的限制因子特点、形态特征和生理生化指标，结合16S rRNA基因序列相似性，鉴定CGMCCNo. 6043为中华动性杆菌(P. chinense)。菌株CGMCC No. 6043与中华动性杆菌标准菌株P. Chinense CGMCC I. 34541相比，前者具有氧化酶(oxidase)活力，后者氧化酶反应阴性，后者过氧化氢酶活力不及前者1/100。实施例5发酵过程中采用过氧化氢刺激增加过氧化氢酶表达量
将中华动性杆菌(P. chinense) CGMCC No. 6043接种至天然海水液体培养基，培养条件为28°C培养24h作为种子液，分别转接入含有0、0. 25、0. 5、I. 0和2. 0过氧化氢的天然海水液体培养基中进行培养，确定菌株能够生长的最高过氧化氢浓度为ImM。将ImM过氧化氢浓度下生长的P. Chinense CGMCC No. 6043菌液转接至装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶进行发酵培养，培养时间24h至对数生长末期，培养温度28°C，摇瓶转速200r/min。培养结束后分别加入无菌纯水和4mM的过氧化氢刺激培养Ih后进行过氧化氢酶活性的測定。未经过氧化氢刺激的发酵液酶活为596U/mL(936U/mg)，经过氧化氢刺激得到的发酵液酶活达754U/mL( 1185U/mg)。利用过氧化氢刺激以提高菌株过氧化氢酶活性的方法作用较显著，酶活力提高幅度达到26. 5% (249U/mg)。发酵培养基配方如下5g/L酵母抽提物，lg/L蛋白胨，其余为天然陈海水，pH为
7.2。实施例6发酵培养基与时间优化中华动性杆菌(P. chinense) CGMCC No. 6043接种至天然海水液体培养基，28°C培养24h达到对数生长末期。加入4mM的过氧化氢刺激培养2h作为种子液。转接至装50mL发酵培养基的250mL三角瓶进行发酵培养。培养条件为pH 7. 2，培养时间为12、24和48h，培养温度28°C，摇瓶转速200r/min。加入4mM的过氧化氢刺激培养lh。发酵培养基有三种(I) HS发酵培养基5g/L酵母抽提物，lg/L蛋白胨，其余为天然陈海水，pH 7.2。(2)NDJ培养基:0. 5%牛肉膏，1%蛋白胨，0. 5%酵母浸膏，2. 3%氯化钠，pH 7. 2。(3)GP培养基2%干酪素，4%葡萄糖，0. 1%磷酸ニ氢钾，0. 01%硫酸镁，2. 3%氯化钠，pH 7. 2。通过三种不同发酵培养基和时间培养获得的菌体，经破胞后測定过氧化氢酶酶活力，具体结果见表I。表I发酵培养基和发酵时间优化后测定的过氧化氢酶活力
权利要求
1.一种过氧化氢酶产酶菌，分类命名为中华动性杆菌(Planomicrobium chinense),保藏编号为 CGMCC No. 6043。
2.根据权利要求I所述的过氧化氢酶产酶菌，其特征在于所述菌株具有以下特征 (O菌落形态菌落呈圆形，表面光滑，边缘平整，微凸起，黄色； (2)细胞形态革兰氏阳性菌，细胞显微镜下呈现运动性，形态为球状居多(O. 8X I. O μ m)； (3)生理生化特征好氧生长；水解明胶，不水解淀粉、酪素、吐温80和七叶树素；能利用葡萄糖产酸，不能利用蔗糖、棉子糖、木聚糖、乳糖、阿拉伯糖、纤维二糖、木糖、鼠李糖、密二糖、甘露糖或甘露醇产酸。
3.根据权利要求I所述的过氧化氢酶产酶菌，其特征在于所述菌株的16SrRNA基因包含如Seq ID No. I所示的核苷酸序列。
4.一种利用权利要求I所述的菌株生产过氧化氢酶的方法，包括以下步骤 (IMfCGMCC No. 6043菌株接种至天然海水液体培养基，培养后加入过氧化氢进行刺激培养作为种子液； (2)将种子液转接至发酵培养基中进行发酵培养，然后加入过氧化氢刺激培养，即可得到具有过氧化氢酶活力的发酵液。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述方法步骤(I)中的天然海水培养基的配方包括O. 1-0. 5%蛋白胨，O. 1-0. 5%Casamino acid, O. 005-0. 05%酵母提取物，其余为天然海水，调节pH为6. 8-7.5。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述方法步骤(2)中的发酵培养基配方包括l-10g/L酵母抽提物，O. 5-5g/L蛋白胨，其余为天然海水，pH为6. 5-8. O。
7.根据权利要求4-6任一项所述的方法，其特征在于根据需要，可任选对具有酶活力的发酵液进行处理，从中分离纯化出过氧化氢酶的产物。
8.一种定向筛选过氧化氢酶高产菌株的方法，包括如下步骤 (I)、将海水样品在无菌条件下加入半固体培养基中，并加入预先过滤除菌的碳和氮源，震摇富集培养； (2 )、对富集培养液进行无菌稀释涂布，挑选单克隆进行斜面保存； (3)、将分离获得的菌株转接至天然海水液体培养基进行摇瓶发酵，采用分光光度法进行过氧化氢酶活性复筛，最终筛选出过氧化氢酶活相对较高的菌株。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述方法步骤(I)中半固体培养基通过如下方法制备将天然海水采用NaOH或HCl微调pH至6. 8-7. 5，加入质量百分数为O. 5-1%的琼脂湿热灭菌，待温度降低至40-60°C左右在无菌条件下加入过滤除菌的O. 5-10mM过氧化氢，混匀后冷却凝固制成半固体培养基。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述方法步骤(3)中，天然海水液体培养基包括O. 1-0. 5%蛋白胨，O. 1-0. 5%Casamino acid, O. 005-0. 05%酵母提取物，其余为天然海水，调节pH为6. 8-7.5。
全文摘要
本发明涉及一种采用自创的半固体培养基定向筛选过氧化氢酶高产菌株的方法，以及采用该方法获得的一株海洋过氧化氢酶高产菌。该方法将过氧化氢包含在下层半固体琼脂中，缓慢渗透到上层液体培养基中，持续而稳定地给予上层液体培养基中微生物一定的氧化压力，从而达到定向富集过氧化氢酶高产菌株目的，具有高选择性和高效率特点。从海洋水体中采用半固体培养基定向富集筛选而得一株动性杆菌CGMCC No.6043，该菌具有生长周期短、酶活性高和发酵产酶成本低廉的特点，适合广泛运用于纺织工业、食品工业和废水处理等方面。因此本发明方法和产酶菌株具有广泛的工业使用价值和显著的经济效益前景。
文档编号C12N9/08GK102864106SQ20121035826
公开日2013年1月9日 申请日期2012年9月24日 优先权日2012年9月24日
发明者吴月红, 许学伟, 王春生, 吴敏, 张心齐, 潘杰 申请人:国家海洋局第二海洋研究所