专利名称：抑制绵羊成纤维细胞生长因子5表达的试剂及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，尤其涉及一种抑制绵羊成纤维细胞生长因子5 (FGF5)表达的试剂及其应用。
背景技术：
羊毛长度是细毛羊的主要经济性状之一。羊毛长度遗传力约为O. 56，表明羊毛长度主要决定于遗传因素，即主要受与毛囊生长发育相关基因的调控。成纤维细胞因子5 (FGF5)基因表达的抑制或突变失活，能延长毛囊的生长期，显著增加毛发的长度。根据国内外研究报道，目前在狗、猫上都发现了与毛发长度相关的突变基因型。除突变基因型外，可以通过基因敲除或干扰抑制FGF5表达使毛囊生长期延长，增加毛发长度的研究已经成为FGF5研究的热点。RNA干扰技术是最近两年来发展起来的阻断基因表达的新技术，其抑 制基因表达的功能得到了充分的证明，并被广泛应用。针对FGF5的基因结构，设计合成能够有效抑制FGF5基因表达的干扰RNA分子，对深入研究羊毛生长发育的分子调控机制和培育促进羊毛生长的转基因羊生物新品种具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是获得一种能够有效抑制FGF5基因表达试剂，其具有高特异性。为了实现本发明的目的，拟采用如下技术方案本发明一方面涉及一种抑制FGF5基因表达试剂，其包括表达载体，所述的载体上包含SEQ ID NO. 1#、2#或3#的shRNA正向和反向序列。在本发明的一个优选实施方式中，所述的shRNA序列通过人工合成获得，退火形成双链后与XhoI和HpaI双酶切线性化的pLL3. 7载体连接形成表达载体。在本发明的一个优选实施方式中，所述的shRNA序列为SEQ ID NO. 2，所述的试剂是特异性的。本发明另一方面还涉及上述试剂的应用，所述的试剂用于抑制FGF5基因的表达，所述的抑制对象包括绵羊或者绵羊细胞。本发明另一方面还涉及上述试剂在提高羊毛长度中的应用。在本发明的一个实施方式中，所述的提高羊毛长度是通过抑制绵羊成纤维细胞生长因子5来实现的。
图I不同Lv-shRNA-FGF5干扰分子对pLEX_FGF5表达的抑制效果的WesternBlotting 分析。(图例说明 I 为 Lv-shRNA-FGF5-l# 与 pLex_FGF5 共转染，2 为Lv-shRNA-FGF5-2# 与 pLex_FGF5 共转染，3 为 Lv_shRNA-FGF5_3# 与 pLex_FGF5 共转染，4 为Lv-shRNA-Luc if erase与pLex_FGF5共转染。其中,A所用一抗为鼠抗HA标签蛋白抗体,二抗为抗鼠的荧光标记抗体出所用一抗为鼠抗β-actin蛋白抗体,二抗为抗鼠的荧光标记抗体)。图2Lv-shRNA-FGF5_2#干扰分子抑制FGF5表达的特异性验证(Rescue)。(图例说明1 为 pLex-FGF5，2 为 pLex_FGF5m 突变体，3 为 Lv_shRNA-FGF5_2# 与 pLex_FGF5 共转染，4为Lv-shRNA-FGF5-2#与pLex_FGF5m共转染，5为未转染细胞。其中，A所用一抗为鼠抗HA标签蛋白抗体，二抗为抗鼠的荧光标记抗体出所用一抗为鼠抗β-actin蛋白抗体，二抗为抗鼠的荧光标记抗体)。
具体实施例方式I抑制FGF5某闵转录shRNA干扰分子的设计以NCBI数据库(登录号JQ941956)公布的绵羊FGF5基因序列，选择其中相应的革G序列，利用网上在线软件siDESIGN设计针对该基因的干扰序列3个(http://www.dharmcon. com),以及一个针对Luciferase基因的干扰序列作为对照。序列为1# 正向序列5’ -T AGATCTACCCGGATGGCAA TTCAAGAGA TTGCCATCCGGGTAGATCT TTTTTT C-3’反向序列5,-TCGAG AAMAA AGATCTACCCGGATGGCAA TCTCTTGAA TTGCCATCCGGGTAGATCT A-3，2# 正向序列5’ -T GGAAATATTTGCTGTGTCT TTCAAGAGA AGACACAGCAAATATTTCC TTTTTTC-3’反向序列5’-TCGAG AAMAA GGAAATATTTGCTGTGTCT TCTCTTGAA AGACACAGCAAATATTTCC A-3’3# 正向序列5’ -T CATGCAAGTGCCAAATTTA TTCAAGAGA TAAATTTGGCACTTGCATG TTTTTTC-3’反向序列5’-TCGAG AAMAA CATGCAAGTGCCAAATTTA TCTCTTGAA TAAATTTGGCACTTGCATG A-3’Luciferase 正向序列5’ -T CGGTATGATTGATGAGAAT TTCAAGAGA ATTCTCATCAATCATACCG TTTTTT C-3’反向序列5’ -TCGAG AAAAAA CGGTATGATTGATGAGAAT TCTCTTGAA ATTCTCATCA ATCATACCGA-3’2干扰分子的合成及表达载体的构建
将以上设计的序列送交上海生物工程公司合成。每个干扰分子合成后的正链和反向互补链分别用双蒸水溶解，各取IOul IOuM的两条shRNA寡核苷酸，加入8 μ IIOXannealing buffer和12 μ I灭菌超纯水混合,煮沸10分钟后自然冷却至室温。同时，PLL3. 7质粒载体经XhoI和HpaI双酶切后回收线性化载体，与上述shRNA寡核苷酸退火产物4°C过夜连接。连接产物转化DH5a感受态细胞，LB平板氨苄青霉素(100ug/ul)筛选。用载体检测引物及shRNA寡核苷酸引物筛选阳性克隆并送上海生工测序鉴定序列正确后，提取纯化重组质粒用于转染(其中干扰分子shRNAl#，2#和3#序列对应的表达载体分别为Lv-shRNA-FGF5-l#, Lv_shRNA-FGF5_2# 和 Lv_shRNA-FGF5_3#)。3细胞水平评价shRNA干扰分子对FGF5基因转录表达的抑制效果3. I绵羊FGF5表达载体的构建取细毛羊体侧皮肤组织IOOmg于液氮中研磨，用Trizol(Invitrogen)法提起总RNA，采用I %的琼脂糖凝胶电泳验证RNA的完整性，-70°C保存备用。根据反转录试剂盒(TaKaRa)说明，以Oligo dT Primer为引物合成cDNA，以该cDNA为模板，以引物FGF5-S为上游，FGF5-as (见表I)为下游进行RT-PCR。扩增产物和pLEX_MCS质粒分别用Not I和Xho I酶切，经胶回收纯化后T4连接酶连接过夜。连接产物转化入100 μ L大肠杆菌DH5 α 感受态细胞，提取质粒、酶切、PCR扩增、测序鉴定正确后，纯化重组质粒用于转染。3. 2shRNA表达载体与FGF5表达质粒共转染293Τ细胞转染前一天按每孔4Χ 105个/mL的密度将293T细胞接种于六孔板，用2ml含有10%胎牛血清的DMEM培养液培养细胞。24h后细胞达到70% 80%汇合度时，将I μ g的shRNA干扰载体(包括无关基因对照质粒)与I μ g FGF5表达质粒加入到O. 3ml预热的Opti-MEM培养基后，轻轻混匀，同时将6ul的脂质体加入到O. 3ml opti-MEM培养基，室温放置5min后，将上述稀释好的DNA与脂质体混合，置于室温孵育20分钟；在此期间，用Opti-MEM培养基清洗待转染细胞一次，将脂质体和DNA复合物加入细胞；将细胞培养板放回37°C培养箱中孵育；2-4小时后，移去脂质体和DNA复合物，在更换为含有10%胎牛血清的DMEM完全培养液。培养48小时后收获细胞，提取蛋白。3. 3利用Western blot观察shRNA的抑制效果上述转染细胞的提取蛋白，变性后12% SDS-PAGE进行蛋白电泳，转膜、封闭，而后分别加一抗，即鼠抗HA(1 2000)、鼠抗β-actind 1000)抗体，于4°C孵育过夜。次日，洗漆后加抗鼠的突光标记抗体二抗(I : 10000),室温孵育40分钟；洗漆后,通过Odyssey红外荧光扫描成像系统成像，灰度值扫描分析，得出蛋白量的相对值。通过与对照样比较，PLL-FGF5-2#能够有效抑制82% FGF5蛋白的翻译，Lv_shRNA-FGF5_2#能够有效抑制82%FGF5蛋白的表达，见图I。4shRNA干扰分子抑制FGF5基因转录的特异件评价4. I绵羊FGF5突变体表达载体pLEX_FGF5m的构建在FGF5全长CDS序列中找到Lv-shRNA-FGF5_2#干扰分子的靶序列，并按FGF5开放阅读框在祀序列的Seeding region引入4个无义突变位点,保证其编码的氨基酸不变。shRNA-FGF5-2# 干扰分子的靶序列...G GAAATA TTT GCT GTG TCT…突变后序列...G GAAATA TTC · GCA GTCTCA…。按突变后的FGF5序列设计一对引物FGF5m_s和FGF5m_as (见表I)，上游引物FGF5m-s包含突变位点，下游引物FGF5m-as设计为上游的反向互补序列，利用重叠延伸PCR法获得无义突变FGF5。反应I以引物FGF5-S为上游，FGF5m_as为下游扩增FGF5m的Y端；反应2以引物FGF5m_s为上游，FGF5_as为下游扩增FGF5m的3^端；反应3以引物FGF5-S为上游，FGF5-as为下游，含重叠DNA片段的反应I和反应2的产物等比例混合作为模板以扩增全长FGF5m。PCR反应体系(50 μ L) :10Xbuffer5 μ L，引物 O. 5 μ L (lOpmol/ μ L)，各 I μ L，dNTP (IOmmoI/L) 2 μ L，，pfu 酶 O. 4 μ L，反转录产物 2 μ L,ddH20 补至 50 μ L。PCR 反应程序94°C 3min ；94°C 30sec ；60°C 30sec ；72°C lmin, 35 个循环；72°C 5min ;4°C保存。PCR产物用2%的琼脂糖凝胶进行检测。扩增产物和pLex质粒分别用Not I和Xho I酶切，经胶回收纯化后T4连接酶连接过夜。连接产物转化入100 μ L大肠杆菌DH5a感受态细胞，提取质粒、酶切、PCR扩增、测序鉴定正确后，提取纯化重组质粒用于转染。4. 2shRNA表达载体与FGF5m表达质粒共转染293T细胞具体方法同3. 2.4. 3Lv-shRNA-FGF5-2#干扰分子的特异性验证上述转染细胞的蛋白提取后,通过western blot对FGF5基因表达进行分析,评价对Lv-shRNA-FGF5-2#干扰分子的特异性。 干扰分子shRNA-FGF5-2# 分别和重组 pLEX_FGF5、pLEX_FGF5m 共转染 293T，转染48小时后收集细胞Western鉴定(图2)。从第4泳道能看出Lv-shRNA-FGF5-2#几乎没有干扰突变后的pLEX-FGF5m表达。而第3泳道的结果表明Lv-shRNA-FGF5_2#对重组pLEX_FGF5有极明显的干扰作用，证实干扰分子Lv-shRNA-FGF5-2#的特异性良好。表I实验引物
权利要求
1.一种抑制FGF5基因表达试剂，其包括表达载体，所述的载体上包含SEQ ID NO. 1#、2#或3#的shRNA正向和反向序列。
2.根据权利要求I所述的试剂，所述的shRNA序列系人工合成获得，退火形成双链后与XhoI和HpaI双酶切线性化的pLL3. 7载体连接形成表达载体。
3.根据权利要求I所述的试剂，所述的shRNA序列为SEQID NO. 2，优选的，所述的试剂是特异性的。
4.权利要求I至3任意一项所述的试剂的应用，所述的试剂用于抑制FGF5基因的表达，所述的抑制对象包括绵羊或者绵羊细胞。
5.权利要求I至3任意一项所述的试剂在提高羊毛长度中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，所述的提高羊毛长度是通过抑制绵羊成纤维细胞生长因子5基因的表达来实现的。
7.根据权利要求4-6任意一项所述的应用，所述的应用是非治疗和非诊断目的的。
全文摘要
本发明公开了抑制绵羊成纤维细胞生长因子5(FGF5)表达的试剂及其应用，所述的试剂包括能够有效抑制绵羊成纤维细胞生长因子5(FGF5)表达的shRNA分子，且具有高度特异性。该试剂能够用于增加绵羊的毛发长度，具有显著的应用价值。
文档编号C12N15/113GK102876698SQ20121035933
公开日2013年1月16日 申请日期2012年9月25日 优先权日2012年9月25日
发明者刘明军, 贺三刚, 李文蓉, 张雪梅, 张宁, 刘晨曦, 刘国松, 玛依拉 申请人:新疆维吾尔自治区畜牧科学院中国-澳大利亚绵羊育种研究中心