玉米芯生物催化米根霉液体发酵玉米淀粉高效制备葡萄糖的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种生物催化米根霉液体发酵玉米淀粉高效制备葡萄糖的方法，该方法通过在米根霉(Rhizopus?oryzae)液体发酵体系中添加由玉米芯制备的生物催化剂实现葡萄糖产量提高1-1.6倍，生成时间缩短2-4倍(以不加玉米芯生物催化剂为对照)。本发明包括以下内容：玉米芯生物催化剂的制备，采用米根霉液体发酵体系实现玉米淀粉高效制备葡萄糖。
【专利说明】玉米芯生物催化米根霉液体发酵玉米淀粉高效制备葡萄糖
一、【技术领域】
[0001]本发明涉及一种通过添加玉米芯生物催化剂在米根霉液体发酵体系中实现由玉米淀粉高效制备葡萄糖的方法，属于微生物生物【技术领域】。
二、【背景技术】
[0002]葡萄糖是淀粉最重要的下游产品之一，同时也是玉米的重要深加工产品。在美国，以玉米为原料生产的淀粉糖已全面代替蔗糖，广泛进入了工业加工及家庭食用等各个领域。我国的玉米资源非常丰富，在1999年已达1.2亿吨，居世界第二。玉米便于运输和贮藏，可周年生产，淀粉含量高，葡萄糖产量高，已逐渐成了我国制造淀粉的主要原料。玉米淀粉的产量接近我国淀粉总产量的90%，已成为制造葡萄糖的理想原料。因此，深入研究玉米淀粉转化为葡萄糖的机理，以期提高葡萄糖的转化率，同时缩短生产周期，对于促进农业经济发展，具有重要意义。
[0003]现代淀粉加工工业中葡萄糖的生产工艺为将淀粉经高温连续蒸煮糖化后，加入淀粉酶和糖化酶使淀粉液化糖化生成葡萄糖，此过程存在能耗大，淀粉酶和糖化酶需要外源制备以及酶制剂利用效率低等问题。本发明模拟霉菌的降解淀粉的自然过程，采用能够合成和分泌各种淀粉降解酶类的米根霉为发酵菌种，玉米淀粉转化为葡萄糖过程中所需淀粉降解酶的种类、数量和活性完全由米根霉自身的代谢调控系统控制所以能够实现不需添加外源酶制剂和发酵过程经济高效低能耗。
三、
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种通过添加玉米芯生物催化剂在米根霉液体发酵体系中实现玉米淀粉高效制备葡萄糖的方法，该方法能够使葡萄糖产量提高1-1.6倍，葡萄糖生成时间缩短2-4倍。`
[0005]本发明包括下列步骤:
[0006]1、玉米芯生物催化剂的制备:
[0007]将玉米芯粉碎为40目后，按照1: 40的比例加蒸馏水，煮沸20-30分钟，4层纱布过滤。过滤液冷却后，定容为原体积。在4°C下，8000-14400KD的透析袋中透析，透析液为中性缓冲液，每隔4-6小时换一次透析液，24小时后，取出透析袋中液体，浓缩至原体积。此液体即为玉米芯催化剂。
[0008]2、米根霉液体发酵体系实现玉米淀粉高效转化为葡萄糖
[0009]米根霉液体发酵体系由以下部分组成:
[0010]发酵菌种为米根霉(Rhizopus oryzae),其形态和rDNA ITS序列见附图1,2和核苷酸序列表。图1为米根霉在PDA培养基上生长的图片，菌落大小:遍布整个培养皿；菌丝颜色:白；匍匐菌丝:致密，平整；菌落质地:呈蛛丝网状；气生菌丝:接触到平皿盖，丰盈，呈顶端分支；孢子:生长在顶端分支顶上；孢子囊颜色:菌丝接种到平板上后第二天长出孢子囊为白色，三天后为黑色。图2为米根霉菌丝、孢子囊、孢囊梗和孢囊孢子的显微镜图片(xlO)，菌丝:发达，无横隔有分支，显微镜下显示灰白色；孢子囊:球型，直径80-175 μ m;孢囊梗:直立或稍弯曲长500-1000 μ m,褐色，壁粗糙，直径5-15 μ m,幼期短，成熟后长。囊轴:呈半球型或卵圆型，淡褐色，壁光滑，直径35-96 μ m ;孢囊孢子:球型，卵形或椭圆形大小不一，直径1.8-7.2 μ m ;褐色或淡褐色，有线纹；假根:根状或手指状分支，部分与孢囊梗对生，褐色；匍匐菌丝:呈爬行扩散形生长，呈灰褐色。核苷酸序列表为米根霉rDNA ITS序列。
[0011]发酵方式为液体摇瓶发酵。发酵培养基配方:玉米淀粉与玉米芯催化剂的比例为I: 50。发酵条件:接种量为I %米根霉液体孢子液，孢子数约为IO6个/毫升。温度为250C，转速为 120-180r/min，培养 5-7 天。
[0012]有益效果
[0013]1、由于玉米淀粉颗粒大，结构致密而且支链淀粉含量高，所以较其它淀粉难于液化糖化，本发明通过加入玉米芯生物催化剂能够大幅提高玉米淀粉转化为葡萄糖的效率(葡萄糖产量提高1-1.6倍，生成时间缩短2~4倍)，具有广阔的应用前景。[0014]2、现代淀粉加工工业中葡萄糖的生产工艺为将淀粉经高温连续蒸煮糖化后，加入淀粉酶和糖化酶使淀粉液化糖化生成葡萄糖，而淀粉酶和糖化酶需由霉菌另行制备。本发明直接利用霉菌液体发酵制备葡萄糖，玉米淀粉转化为葡萄糖过程中所需淀粉降解酶的种类、数量和活性完全由霉菌自身的代谢调控系统控制所以不需添加外源酶制剂，能够实现发酵全程经济高效，适合规模化工业生产。
[0015]3、本发明采用玉米芯制备生物催化剂，其来源广泛，价格低廉能够大幅降低生产成本。
四、【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1米根霉在PDA培养基上生长的图片
[0017]图2米根霉菌丝、孢子囊、孢囊梗和孢囊孢子的显微镜图片(XlO)
[0018]图3处理组和对照组在发酵20天中葡萄糖的生成量核苷酸序列表米根霉rDNA-1TS 序列
五、【具体实施方式】
[0019]下面的实施例可以更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
[0020]实施例
[0021]1、实验仪器与试剂
[0022]I)实验仪器
[0023]HYG-A全温摇瓶柜，太仓实验设备厂
[0024]LRH-150生化培养箱，上海益恒实验设备有限公司
[0025]Sff-CJ-1FD洁净工作台，苏净集团安泰公司
[0026]U-1800 分光光度计，HITACHI
[0027]电热手提式压力蒸汽消毒器，上海医用核子仪器厂
[0028]生物显微镜，尼康H600L
[0029]2)实验试剂
[0030]玉米淀粉(≥99%，联合利华有限公司)[0031]葡萄糖测定试剂盒(上海荣盛生物药业有限公司)
[0032]2、实验设计
[0033]在本实施例中，设两个实验组，分别为处理组和对照组，每组3个平行。处理组为加玉米芯生物催化剂的米根霉液体摇瓶发酵体系，对照组为不加玉米芯生物催化剂的米根霉液体摇瓶发酵体系，处理组和对照组含有相同量的玉米淀粉，在发酵第1，5，10和20天，每天取样测定两组发酵液中的葡萄糖含量。
[0034]3、实验方法
[0035]I)马铃薯葡萄糖(PDA)斜面培养基:
[0036]马铃薯块200_300g、葡萄糖20g、酵母膏5g、琼脂20g、水1000ml。马铃薯洗净去皮，切成小块，将马铃薯块放入水中，煮沸15分钟，用纱布过滤，榨出所有液体，补足1000ml水量，加入葡萄糖，酵母膏，琼脂，加热至琼脂完全溶解后，分装于试管中，121°C，20分钟高压灭菌后，取出试管，倾斜放置，使试管内培养基呈斜面，静置至凝固。
[0037]2)米根霉孢子液制备:
[0038]取4°C保藏于PDA斜面培养基的米根霉菌种，在无菌超净台中，用接种环勾取菌丝，在(PDA)斜面培养基上划蛇形，25°C，培养3-4天，直到可见长满黑点点霉菌孢子囊。取I个试管斜面(长满黑点点霉菌孢子囊)加5毫升无菌水，用接种环刮洗到无菌小三角瓶(加玻璃珠)中，震荡后镜检计数，用无菌水稀释至孢子数约为106个/毫升。
[0039]3)玉米芯生物催化剂的制备
[0040]取新鲜玉米芯粉·碎为40目，称取30g，加1.2L蒸馏水，煮沸20_30分钟，4层纱布过滤。过滤液冷却后，定容为1.2L，装入经50%乙醇煮沸I小时并冲洗过的8000-14400KD的透析袋，封口。将透析袋浸入12L的透析液中，透析液为中性缓冲液。在4°C下，每隔4小时换一次透析液，24小时后，取出透析袋中液体，浓缩至1.2L，此液体即为玉米芯催化剂。
[0041]4)米根霉液体发酵玉米淀粉制备葡萄糖
[0042]处理组:称取24g玉米淀粉，加入1.2L玉米芯生物催化剂，电炉上糊化后，分装于12个250mL摇瓶中，硅胶塞封口，外面包一层牛皮纸，在高压灭菌锅中，121 °C，灭菌20分钟，冷却后，无菌超净台中，每个摇瓶接入ImL米根霉液体孢子液。置25°C恒温培养，摇床转速为150r/min，培养20天。在第1，5，10和20天，取3个摇瓶，将摇瓶中发酵液过滤后，测定
葡萄糖含量。
[0043]对照组:称取24g玉米淀粉，加入1.2L蒸馏水，电炉上糊化后，分装于12个250mL摇瓶中，硅胶塞封口，外面包一层牛皮纸，在高压灭菌锅中，121°C，灭菌20分钟，冷却后，无菌超净台中，每个摇瓶接入ImL米根霉液体孢子液。置25°C恒温培养，摇床转速为150r/min,培养20天。在第1，5，10和20天，取3个摇瓶，将摇瓶中发酵液过滤后，测定葡萄糖含量。
[0044]5)发酵液中葡萄糖含量的测定
[0045]采用葡萄糖氧化酶-过氧化物法，将发酵液过滤后，取30 μ 1，与3mL工作液(含有等量的Rl和R2试剂)混匀，此管为样本管；同时取30 μ I校准液，与3mL工作液(含有等量的Rl和R2试剂)混匀，此管为校准管，将样本管和校准管同时37°C加热15min，0D505nm测定吸光值。葡萄糖含量(mmol/L)=样本管吸光度㈧X校准液浓度(5.5mmol/L)/校准管吸光度。[0046]4、实验结果
[0047]如图3，在含有相同玉米淀粉的米根霉液体发酵体系中，处理组发酵液中葡萄糖含量在第5天时已达到最大值为92.3mmol/L,而对照组直到第20天才达到最大值为58.lmmol/L.由此可知，处理组的葡萄糖生成量比对照组提高了 1.59倍，转化时间缩短了4倍。
【权利要求】
1.本发明的特征为在米根霉液体发酵体系中添加玉米芯生物催化剂实现玉米淀粉高效转化为葡萄糖。
2.权利要求1所述的玉米芯生物催化剂的制备步骤为: 将玉米芯粉碎为40目后，按照1: 40的比例加蒸馏水，煮沸20-30分钟，4层纱布过滤。过滤液冷却后，定容为原体积。在4°C下，8000-14400KD的透析袋中透析，透析液为中性缓冲液，每隔4-6小时换一次透析液，24小时后，取出透析袋中液体，浓缩至原体积。此液体即为玉米芯催化剂。
3.权利要求1所述的玉米淀粉高效转化为葡萄糖的过程是由米根霉液体发酵体系实现的。 米根霉液体发酵体系由以下部分组成:发酵微生物为米根霉(Rhizopus oryzae)其形态和rDNA ITS序列见附图1、2和核苷酸序列表。发酵方式为液体摇瓶发酵。发酵培养基配方:玉米淀粉与玉米芯催化剂的比例为1: 50。发酵条件:接种量为I %米根霉液体孢子液，孢子数约为1O6个/毫升。温度为25°C，转速为120-180r/min，培养5-7天。
【文档编号】C12P19/02GK103710407SQ201210369734
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2012年9月29日 优先权日:2012年9月29日
【发明者】崔莉, 李大婧, 郁萌, 刘春泉, 高小女 申请人:江苏省农业科学院