制备胰腺干细胞的方法及其专用培养基组合的制作方法
【专利摘要】本发明涉及制备胰腺干细胞的方法及其专用培养基组合。具体而言，本发明公开了一种诱导人间充质干细胞获得胰腺干细胞的方法及其配套的培养基组合。本发明所述的方法经过两步诱导法可在体外一次获得限定性内胚层细胞及胰腺干细胞，各阶段细胞可表达相应的特异性基因，并且最后获得的胰腺干细胞能够分化成为有功能的胰腺内分泌细胞及胰腺外分泌细胞。本发明获得的胰腺干细胞可以用于治疗糖尿病等疾病导致的胰腺损伤，为胰腺损伤疾病的细胞治疗提供实验依据和临床研究证据，为细胞移植治疗提供了新的途径。
【专利说明】制备胰腺干细胞的方法及其专用培养基组合
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种制备胰腺干细胞的方法及其专用培养基组合。更具体而言，本发明涉及一种利用专用培养基组合将间充质干细胞诱导为胰腺干细胞的方法及该专用培养基组合。
【背景技术】
[0002]糖尿病已成为全球多发且难治的代谢性疾病，是一种血液中的葡萄糖容易堆积过多的疾病。国外给它的别名叫〃沉默的杀手〃(Silent Killer)。特别是〃成人型糖尿病〃，四十岁以上的中年人染患率特别高。在日本，四十岁以上的人口中10%含有该病，即十人当中就有一位〃糖尿病〃患者。一旦患上〃糖尿病〃，将减少寿命十年之多，且可能发生的并发症遍及全身。
[0003]多年来，医学界一直致力于对糖尿病的研究。这是因为一旦患上“糖尿病”，人体的麻烦将接踵而至，由于免疫功能减弱，人体容易感染由感冒病毒、肺炎球菌、肺结核杆菌等所引起的各种感染性疾病，而且不易治愈。这些疾病并且选择性地破坏细胞、吞噬细胞。抗癌细胞的防御机能会大大减弱，致使癌细胞活跃、聚集。难怪有这样的说法，一旦得了“糖尿病”，寿命减去十多年。因此许多人对糖尿病谈之而色变，千方百计的进行治疗。
[0004]糖尿病(Diabetes)分I型糖尿病、2型糖尿病、妊娠糖尿病及其他特殊类型的糖尿病。其发病涉及到遗传因素、环境因素等多种因素，并以胰岛素分泌不足及胰岛素抵抗为主要表现。
[0005]胰岛素是人体胰腺B细胞分泌的身体内唯一的降血糖激素。胰岛素是由胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成。外源性胰岛素主要用于糖尿病治疗，糖尿病患者早期使用胰岛素和超强抗氧化剂(如注射用硫辛酸、口服虾青素等)有望出现较长时间的蜜月期，胰岛素注射不会有成瘾和依赖性。
[0006]胰腺干细胞是组织特异性干细胞，其能够分化为所有类型的胰腺细胞，从而可作为胰腺疾病损伤细胞替代治疗的潜在供者细胞。然而，胰腺干细胞很难从胰腺组织中获得并在体外扩增。以间充质干细胞作为种子细胞获得胰腺干细胞将不受细胞来源的限制。
[0007]干细胞是一种具有自我更新能力和多系分化潜能的原始细胞，是细胞移植的理想细胞。在个体发育过程中，存在各种形式的干细胞，如胚胎干细胞、多能干细胞以及各种组织中的定向干细胞，如造血干细胞、神经干细胞等，但在实际应用上却面临伦理的挑战或取材的限制。间充质干细胞(MSC)是存在于人体组织中具有多系分化潜能的一种亚全能干细胞群，因其在特定环境下可诱导分化为多种组织细胞，且具有免疫原性低、移植后能形成稳定嵌合等特点，故可作为一种理想的供异基因移植的细胞。因为MSC亚全能干细胞可获得向内胚层组织分化的潜在能力、容易取材、来源更为丰富且不受伦理限制及没有成瘤危险，因此使用间充质干细胞体外诱导获得胰腺干细胞在临床上具有更高的应用价值。
[0008]本发明拟开发一种培养基组合和一套方法以将间充质干细胞在体外定向地诱导为胰腺干细胞，从而为糖尿病及其并发症的治疗提供一种新的选择。
【发明内容】
[0009]因此，本发明的技术目的在于探寻一种能将间充质干细胞在体外定向诱导为有活性的胰腺干细胞的方法和相应的培养基组合。
[0010]因此，本发明的第一方面涉及一种培养基C，其由动物细胞基础培养基和溶质组成；所述溶质及其在动物细胞基础培养基中的浓度如下:0.50X10_5mOl/L-2.0X10_5mOl/L 维甲酸、10ng/ml_30ng/ml EGF、10ng/ml-100ng/ml bFGF、20ng/ml-200ng/ml Dkkl>
0.2mmOl/L-10mmOl/L谷氨酰胺、体积比为0.2%_5%的非必需氨基酸以及可选的体积比为
0.5%-5% 的 B27 ;优选地，0.95X l(T5mol/L-l.05X l(T5mol/L维甲酸、19ng/ml_21ng/ml EGF、32ng/ml-64ng/ml bFGF>80ng/ml-120ng/ml Dkkl> 1.9mmol/L-2.lmmol/L 谷氨酸胺、体积比为0.95%-l.05%的非必需氨基酸以及可选的体积比为1.9%-2.1%的B27 ;并且其中所述动物细胞基础培养基为高糖DMEM培养基或DMEM/F12培养基。
[0011]优选地，所述的培养基C由DMEM/F12培养基和溶质组成；所述溶质及其在培养基B 中的浓度如下:10 5mol/L 维甲酸、20ng/ml EGF、60ng/ml bFGF、100ng/ml Dkkl、2mmol/L谷氨酰胺、体积比为1%的非必需氨基酸以及可选的体积比为2%的B27。
[0012]本发明的第二方面涉及一种将间充质干细胞诱导为胰腺干细胞的试剂盒，其由培养基A、培养基B和培养基C组成，其中
[0013]所述培养基A由动物细胞基础培养基和溶质组成；所述溶质及其在动物细胞基础培养基中的浓度如下:1.00ml/L-20.00ml/L 胎牛血清、1.0Ong/mL-15.00ng/mL activinA 和 10-200ng/mL wnt3a ;优选地，4.75ml/L_5.25ml/L 胎牛血清、4.75ng/mL_5.25ng/mLactivin A 和 40_60ng/mL wnt3a ；
[0014]所述培养基B由动物细胞基础培养基和溶质组成；所述溶质及其在动物细胞基础培养基中的浓度如下:1.00ml/L-20.00ml/L 胎牛血清和 1.0Ong/mL-15.00ng/mL activinA ;优选地,4.75ml/L-5.25ml/L 胎牛血清和 4.75ng/mL_5.25ng/mL activin A
[0015]所述培养基C如上述第一方面所述；
[0016]并且其中所述动物细胞基础培养基为高糖DMEM培养基或DMEM/F12培养基。
[0017]优选地，所述培养基A由高糖DMEM培养基和溶质组成；所述溶质及其在培养基A中的浓度如下:5ml/L胎牛血清、5ng/mL activinA和5ng/mL wnt3a ；
[0018]所述培养基B由高糖DMEM培养基和溶质组成；所述溶质及其在培养基A中的浓度如下:5ml/L胎牛血清和5ng/mL activin A ；
[0019]所述培养基C如上述第一方面所述。
[0020]优选地，所述的将间充质干细胞诱导为胰腺干细胞的试剂盒还包括培养基D或E，其中:
[0021]培养基D由高糖DMEM培养基和溶质组成；所述溶质及其在培养基D中的浓度如下:5ml/L 胎牛血清、20ng/ml exendin-4、10ng/ml activin A、lOmmol/L 尼克酸胺、体积比为2%的B27和体积比为1%的N2 ；
[0022]培养基E由高糖DMEM培养基和溶质组成；所述溶质及其在培养基E中的浓度如下:5ml/L 胎牛血清、20ng/ml exendin-4、15ng/ml FGF7、10mmol/L 尼克酰胺、体积比为 2%的B27和体积比为1%的N2。
[0023]优选地，所述间充质干细胞为脂肪间充质干细胞，优选地，所述间充质干细胞为第3代间充质干细胞。
[0024]本发明的第三方面涉及一种将间充质干细胞诱导为胰腺干细胞的方法，其包括步骤:将间充质干细胞依次用权利要求3或4所述的试剂盒中的培养基A、培养基B和权利要求I或2中所述的培养基C进行培养，得到胰腺干细胞，其中所述间充质干细胞采用常规方法获得。
[0025]优选地，所述方法包括如下步骤:
[0026]1)将常规方法获得的间充质干细胞接种于所述培养基A中，培养Id ；
[0027]2)将完成步骤I)的细胞转接于所述培养基B中，培养4-5d ；
[0028]3)将完成步骤2)的细胞转接于所述培养基C中，培养4-6d，得到胰腺干细胞。
[0029]优选地，所述步骤(1)中，所述间充质干细胞在所述培养基A中的初始浓度为2X IO5个/ml-1 X IO6个/ml ;所述方法中，整个培养过程的培养条件为:在37°C、50ml/LCO2、空气相对湿度为95%的培养箱中培养。
[0030]优选地，所述方法还包括下述步骤:
[0031]将得到的胰腺干细胞分别加入培养基D或培养基E，每孔2000μ L，在37°C、50ml/L CO2、空气相对湿度为95%的培养箱中培养8d，每2d吸弃上清并加入2000 μ L新的培养
基D或Ε。
[0032]本发明的第四方面涉及一种根据上述的将间充质干细胞诱导为胰腺干细胞的方法获得的胰腺干细胞。
[0033]换言之，本发明的目的在于提供一种利用间充质干细胞制备胰腺干细胞的方法及
其专用培养基组合。
[0034]本发明的诱导培养方法适用于各种组织来源的各代次的间充质干细胞。该诱导培养方法无病毒导入、易操作、效率高。本发明的诱导培养方法首先利用常规方法获得某种组织来源(如脂肪组织或骨髓组织)的间充质干细胞，然后利用培养基A和B培养上述获得的间充质干细胞，得到限定性内胚层细胞，该限定性内胚层细胞表达限定性内胚层标志Foxa2、Soxl7,获得效率能够达到95%以上；随后利用培养基C培养得到胰腺干细胞，所述胰腺干细胞表达胰腺干细胞标志Pdxl，获得效率能够达到90%以上，Pdxl阳性的胰腺干细胞不仅能够体外分化为有功能的胰腺内分泌细胞，而且能够体外分化为有功能的胰腺外分泌细胞，该标志也是判定本发明所获得的细胞是胰腺干细胞的质量标准。其中培养基A组成为高糖 DMEM 培养基、4.75ml/L-5.25ml/L 胎牛血清、4.75ng/mL-5.25ng/mL activin A和40-60ng/mL wnt3a ;培养基B组成为高糖DMEM培养基、4.75ml/L_5.25ml/L胎牛血清、
4.75ng/mL-5.25ng/mL activin A ;培养基 C 的组成为 DMEM/F12 培养基、0.95X l(T5mol/L-1.05 X 10 5mol/L 维甲酸、19ng/ml_21ng/ml EGF、32ng/ml_64ng/ml FGF2 (bFGF)、80ng/ml-120ng/mL Dkkl> 1.9mmol/L-2.lmmol/L 谷氨酰胺、体积比为 0.95%-1.05% 的非必需氨基酸和可选的体积比为1.9%-2.1%的B27。本领域技术人员理解，在本申请实施例已经具体例证了上述高低两个浓度的培养基组成均能很好地实现本发明的情况下，所述培养基的浓度范围可以向更低的浓度和更高的浓度进行适当的扩展后仍能实现本发明所述的技术目的。这样更低或更高浓度组成的培养基的技术效果可能优于、等于或劣于本申请实施例所表明的实验结果，但只要能实现将所述间充质干细胞诱导为胰腺干细胞的技术目的，则这样的配比的培养基仍然落入本发明要求保护的范围。
[0035]由间充质干细胞获得胰腺干细胞的步骤可简述为:将吸脂术获得的脂肪组织洗净并常规消化后获得分离的细胞，将上述获得的细胞以适当密度接种在装有扩增培养液的细胞培养瓶中，依次获得第1、2、3代间充质干细胞，将获得的第3代间充质干细胞依次顺序地置于培养基A培养Id、培养基B培养4-6d、培养基C培养4-6d，最终获得胰腺干细胞。本领域技术人员熟知，本发明所列出的上述培养和诱导的方法步骤仅是例证的目的，可能并非实现本发明所述方法的最佳方案，本领域技术人员可以对上述方法步骤做出适当的改变而仍能实现本发明的目的，这样的改动也落入本发明要求保护的范围。当然，本发明所述方法所使用的间充质干细胞并不限于第3代间充质干细胞，其他代次的间充质干细胞也可以使用。所谓第3代间充质干细胞是指第3代脂肪来源的间充质干细胞，所述间充质干细胞可以为脂肪来源的间充质干细胞也可以是其他来源的间充质干细胞。所述扩增培养液并不限于本发明具体使用的扩增培养液，其他间充质干细胞适用的扩增培养液均可以使用。
[0036]因此，间充质干细胞经过两步诱导法可在体外一次获得限定性内胚层细胞、胰腺干细胞，各阶段细胞可表达相应的特异性基因，并且获得的胰腺干细胞具有分化成为有功能的胰腺内分泌细胞和胰腺外分泌细胞的功能。
[0037]本发明方法得到的胰腺干细胞可应用于治疗糖尿病等疾病导致的胰腺损伤，为胰腺损伤疾病的细胞治疗提供实验依据和临床研究证据，为细胞移植治疗提供了新的途径。
【专利附图】
【附图说明】
[0038]图1:为人间充质干细胞(胰腺干细胞的种子细胞)的形态。
[0039]图2:为人间充质干细胞(胰腺干细胞的种子细胞)的免疫表型检测结果。各附图的上部表明了对应的免疫表型类型。
·[0040]图3:为人间充质干细胞体外分化得到的限定性内胚层细胞的形态。
[0041]图4:为人间充质干细胞体外分化得到的限定性内胚层细胞的免疫细胞荧光染色检测结果。A为采用培养基A诱导培养后的细胞，B为第3代间充质干细胞。
[0042]图5:为人间充质干细胞体外分化得到的限定性内胚层细胞的实时定量PCR检测结果。
[0043]图6:为限定性内胚层细胞体外分化得到的胰腺干细胞的形态。
[0044]图7:为限定性内胚层细胞体外分化得到的胰腺干细胞的免疫细胞荧光检测结果。A为第3代间充质干细胞诱导获得的限定性内胚层细胞，B为采用培养基C诱导培养后的细胞。
[0045]图8:为限定性内胚层细胞体外分化得到的胰腺干细胞细胞实时定量PCR检测结
果O
[0046]图9:为胰腺干细胞/胰腺祖细胞体外分化得到的胰腺内分泌分泌细胞的免疫细胞荧光染色检测结果。A为第3代间充质干细胞诱导获得的Pdxl阳性细胞，B为采用培养基D诱导培养后的细胞。
[0047]图10:为胰腺干细胞体外分化得到的胰腺内分泌细胞的实时定量PCR检测结果。
[0048]图11:为胰腺干细胞体外分化得到的胰腺内分泌细胞的胰岛素分泌总量检测结果O
[0049]图12:为胰腺干细胞体外分化得到的胰腺内分泌细胞的胰岛素释放情况检测结
果O
[0050]图13:为胰腺干细胞体外分化得到的胰腺外分泌分泌细胞的免疫细胞荧光染色检测结果。A为第3代间充质干细胞诱导获得的Pdxl阳性细胞，B为采用培养基E诱导培养后的细胞。
[0051]图14:为胰腺干细胞体外分化得到的胰腺外分泌细胞的实时定量PCR检测结果。
[0052]图15:为胰腺干细胞体外分化得到的胰腺外分泌细胞的淀粉酶分泌总量检测结
果O
【具体实施方式】
[0053]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不意味着用于限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0054]实施例
[0055]实施例1实验材料
[0056]青霉素、链霉素和胰蛋白酶-EDTA购自GIBCO公司。Trizol购自美国Invitrogen公司，Oligo dT、M-MLV逆转录`酶、Taq DNA聚合酶、dNTP和RNA酶抑制剂购自日本Takara公司。
[0057]小鼠抗人Foxa2单克隆抗体、兔抗人Insulin单克隆抗体、兔抗人C-肽多克隆抗体、兔抗人AMY单克隆抗体购自美国Abcam公司。山羊抗人Soxl7单克隆抗体、山羊抗人pdxl单克隆抗体购自美国R&D公司。异硫氰酸标记的鸡抗小鼠IgG、异硫氰酸标记的鸡抗兔IgG、罗丹明标记的驴抗山羊IgG购自Santa cruz公司，罗丹明标记的山羊抗小鼠IgG、罗丹明标记的山羊抗兔IgG、异硫氰酸标记的小鼠抗山羊IgG购自北京中杉金桥公司。
[0058]实施例2、培养基的制备
[0059]DMEM/F12培养基(又称DF12培养基)和高糖DMEM培养基购自GIBCO公司。胎牛血清(FCS)购自GIBCO公司。尼克酰胺购自Sigma公司。谷氨酰胺购自GIBCO公司，产品目录号为25030-081。维甲酸购自Sigma公司，产品目录号为R2625。
[0060]人活化素A (ActivinA)购自英国Pepro Tech公司，产品目录号为120-14。
[0061]EGF(epidermal growth factor,表皮细胞生长因子)购自 Pepro Tech 公司，产品目录号为100-15。
[0062]bFGF (basic fibroblast growth factor,喊性成纤维细胞生长因子)购自 Sigma公司，产品目录号为H)291。
[0063]exendin-4购自Sigma公司，产品目录号为E7144。
[0064]FGF7购自P印ro Tech公司，产品目录号为100-19。
[0065]DKKl购自R&D公司，产品目录号为5439-DK-010。
[0066]B27购自GIBCO公司，产品目录号为17504-044。
[0067]N2购自GIBCO公司，产品目录号为17502-048。[0068]非必需氨基酸购自GIBCO公司，产品目录号为11140。
[0069]下述培养基A-C均按低含量和高含量进行配置。
[0070]培养基A由高糖DMEM培养基和溶质组成；所述溶质及其在培养基A中的浓度如下:4.75ml/L (低)或 5.25ml/L (高)胎牛血清、4.75ng/mL (低)或 5.25ng/mL (高)activinA和 40ng/mT,(低)或 60ng/mL (高)wnt3a0。
[0071]培养基B由高糖DMEM培养基和溶质组成；所述溶质及其在培养基B中的浓度如下-A.75ml/L (低)或 5.25ml/L (高)胎牛血清、4.75ng/mL (低)或 5.25ng/mL (高)activinA。
[0072]培养基C由DMEM/F12培养基和溶质组成；所述溶质及其在培养基C中的浓度如下:0.95X 10_5mol/L (低)或 1.05 X l(T5mol/L (高)维甲酸、19ng/ml (低)或 21ng/ml (高)EGF、32ng/ml (低)或 64ng/ml (高)FGF2 (bFGF)、80ng/ml (低)或 120ng/mL (高)Dkkl、
1.9mmol/L (低)或2.lmmol/L (高)谷氨酰胺、体积比为0.95% (低)或1.05% (高)的非必需氨基酸和体积比为1.9% (低)或2.1% (高)的B27。其中，维甲酸、？6?236?、01^1、谷氨酰胺及非必需氨基酸为获得胰腺干细胞所必需的成分。
[0073]培养基D由高糖DMEM培养基和溶质组成；所述溶质及其在培养基D中的浓度如下:5ml/L 胎牛血清、20ng/ml exendin-4、10ng/ml activin A、lOmmol/L 尼克酸胺、体积比为2%的B27和体积比为1%的N2。
[0074]培养基E由高糖DMEM培养基和溶质组成； 所述溶质及其在培养基E中的浓度如下:5ml/L 胎牛血清、20ng/ml exendin-4、15ng/ml FGF7、10mmol/L 尼克酰胺、体积比为 2%的B27和体积比为1%的N2。
[0075]实施例3、人胰岛素分泌细胞的序贯诱导培养
[0076]步骤一、制备第3代间充质干细胞
[0077]1、将采用吸脂术采集出来的脂肪组织用D-Hanks’(还可以使用PBS)洗去血细胞和麻醉药，0.2%11型胶原酶37°C消化30min，100目筛网过滤并收集滤液。
[0078]2、用D-Hank’ s液重悬步骤I获得的细胞并重复洗漆2遍以除去I父原酶，室温1200rpm离心lOmin，收集细胞。
[0079]3、将步骤2的细胞以2X IO6个/ml的密度接种于装有扩增培养液(配方的实例之一为含 58%DF12、40%MCDB、2% 胎牛血清、I X IO-9MITS, I X 10-9Μ 地塞米松、I X 10-4Μ2_ 磷酸抗坏血酸、20ng/mL 白介素 _6、10ng/mL EGFU0ng/mL PDGF-BB, 100U/mL 青霉素和 100 μ g/mL链霉素，当然其他具有类似功效的扩增培养液也均可以使用)的T75细胞培养瓶中，在37°C、50ml/L CO2、空气相对湿度为95%的培养箱培养36hr后(24_48hr均可)弃去培养液(含未贴壁的细胞)，并补充新的扩增培养液，以后每3d半量更换新的扩增培养液，当细胞达70%-80%汇合时，用lg/L胰蛋白酶(Gibco公司)常规消化，细胞按照1:3进行传代，得到第I代间充质细胞。
[0080]4、将第I代间充质细胞在扩增培养液中培养2-3d (在37°C、50ml/L CO2、空气相对湿度为95 %的培养箱培养)，达70%-80%汇合，用D-Hank’ s液洗2遍，用lg/L胰蛋白酶(Gibco公司)常规消化，细胞按照1:3进行传代，得到第2代间充质细胞。
[0081]5、将第2代间充质细胞在扩增培养液中培养2-3d(在37°C、50ml/L CO2、空气相对湿度为95%的培养箱培养)，达70%-80%汇合，用D-Hank’ s液洗2遍，然后用lg/L的胰蛋白酶(Gibco公司)常规消化,室温1200rpm离心6min,收集细胞。[0082]6、将步骤5的细胞以I X IO6个/孔的密度接种于装有扩增培养液的6孔板(购自Nunclon公司)中，在37°C、50ml/L CO2、空气相对湿度为95%的培养箱培养4_6hr，待细胞贴壁后弃除培养基，用D-Hank’ s洗2遍，记作第3代间充质干细胞。
[0083]当然，本发明也可以使用本领域公知的其他间充质干细胞的分离培养方法来获得第3代间充质干细胞或者直接使用市售可得的第3代间充质干细胞而无需自行分离培养获得。
[0084]步骤二、采用培养基组合进行序贯诱导培养
[0085]1、第一阶段的培养
[0086](I)在6孔板中加入培养基A (请注意，使用了高浓度和低浓度两个配比的培养基A,下面的培养基B和C也是如此)，每孔2000 μ L0
[0087](2)在步骤(1)的6孔板中接种第3代间充质干细胞，使其在培养基中的浓度为6Χ105个/ml，在37°C、50ml/L CO2、空气相对湿度为95%的培养箱中培养Id。
[0088](3)吸弃步骤(2)的6孔板中的培养基A，加入培养基B (每2d吸弃上清并加入2000 μ L新的培养基B)。
[0089]2、第二阶段的培养
[0090]吸弃第一阶段步骤(3)的6孔板中的上清，加入培养基C，每孔2000 μ L，在37°C、50ml/L CO2、空气相对湿度为95%的培养箱中培养4_6d(每2d吸弃上清并加入2000 μ L新的培养基C)。
[0091]3、第三阶段的培养
`[0092]吸弃第二阶段的6孔板中的上清，分别加入培养基D或培养基Ε，每孔2000 μ L，在37°C、50ml/L CO2、空气相对湿度为95%的培养箱中培养8d(每2d吸弃上清并加入2000 μ L新的培养基D或Ε)，室温1200rpm离心6min，收集细胞(沉淀)。(组合为:A — B — C — D或E)(分别使用D和E培养基仅是为了证明获得的胰腺干细胞具有分化为成熟胰腺分泌细胞的功能。序贯诱导到培养基C的使用后就完成了。)
[0093]步骤三、诱导效果的鉴定(下述实验结果均是低浓度的培养基A、B、C进行诱导的结果)
[0094]1、第3代间充质干细胞的免疫表型测定
[0095]步骤一得到的第3代间充质干细胞的细胞形态见图1。
[0096]用间接免疫荧光法检测第3代间充质干细胞的表型，用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的小鼠抗人 CD29、CD34、CD44、CD73、CD90、CD105、CD106, CDl 17、Flk-1、HLA-ABC 和HLA-DR抗体(抗体均购自BD公司)标记后进行流式检测，流式细胞仪为ACXURI C6 (BectonDickinson)。
[0097]结果见图2，横坐标表示细胞荧光强度，纵坐标表示细胞数；P2表示所选细胞群体。表型结果显示，第3代间充质干细胞的⑶29、⑶44、CD73、⑶90、⑶105、Flk-l和HLA-ABC均为阳性，⑶34、⑶106、⑶117和HLA-DR分子均为阴性。与现有技术相比，本发明所获得的间充质干细胞的特有表型是Flk-1阳性。
[0098]2、人间充质干细胞诱导分化为限定性内胚层细胞的鉴定
[0099](I)形态鉴定
[0100]在培养基A和B中培养6d后细胞达80%_90%汇合，培养过程中细胞的形态变化如下:培养l-2d，细胞基本为梭形，少数呈鹅卵石样上皮细胞形态，梭形细胞的百分比大于90%;培养4-6d后，细胞体积明显增大，排列紧密，梭形细胞比例减少，多数细胞呈现鹅卵石样上皮细胞形态，鹅卵石样细胞的百分比大于90%，在培养基A和B中培养5d的细胞见图3。
[0101](2)免疫荧光染色鉴定
[0102]将步骤二的I中培养5d的细胞(将第3代间充质干细胞作为对照)进行免疫荧光染色，检测限定性内胚层标志Foxa2和Sox17的表达情况。 [0103]检测Foxa2的具体方法如下:细胞以80%冰乙醇固定，PBS清洗后以含1%BSA的PBST缓冲液封闭；然后用小鼠抗人Foxa2单克隆抗体(工作浓度为1:50稀释)作为一抗室温孵育Ihr ;用PBS缓冲液清洗后，再以异硫氰酸(绿色荧光)标记的山羊抗小鼠IgG作为二抗室温孵育30min ;用？83缓冲液清洗后用Hoechst33342染色液(Sigma)复染细胞核(蓝色荧光)，在荧光显微镜下观察(Olympus)。第3代间充质干细胞均不显示绿色荧光，为阴性结果。采用培养基A诱导培养后的细胞90%以上显示绿色荧光。
[0104]检测Soxl7的具体方法与检测Foxa2的具体方法基本相同，差别仅在于采用山羊抗人Soxl7单克隆抗体(工作浓度为1:100稀释)作为一抗，采用罗丹明(红色荧光)标记的小鼠抗山羊IgG作为二抗。第3代间充质干细胞均不显示红色荧光，为阴性结果。采用培养基A诱导培养后的细胞90%以上显示红色荧光。
[0105]结果见图4(A为采用培养基A诱导培养后的细胞，B为第3代间充质干细胞)。结果表明，采用培养基A诱导培养后大部分细胞为Foxa2和Soxl7阳性。
[0106](3)实时定量PCR分析
[0107]取步骤二的I中培养5d的细胞(将第3代间充质干细胞作为对照)，提取总RNA并反转录为cDNA，通过实时定量PCR鉴定Foxa2基因和Sox17基因的表达情况。采用人GAPDH作为各基因的对照，所用的引物如下:
[0108]用于扩增Foxa2基因的引物为:
[0109]上游引物:5，-CTGAGCGAGATCTACCAGTGGA-3’(SEQ ID NO:1)；
[0110]下游引物:5，-CAGTCGTTGAAGGAGAGCGAGT-3，(SEQID NO:2)。
[0111]用于扩增Soxl7基因的引物为:
[0112]上游引物:5’-GCATGACTCCGGTGTGAATCT-3’ (SEQ ID N0:3)；
[0113]下游引物:5’-TCACACGTCAGGATAGTTGCAGT-3’(SEQ ID NO:4)。
[0114]用于扩增GAPDH的引物为:
[0115]上游引物:5’-GGTCACCAGGGCTGCTTTTA-3’ (SEQ ID N0:5)；
[0116]下游引物:5’-GAGGGATCTCGCTCCTGGA-3’(SEQ ID N0:6)。
[0117]采用AACT法计算各基因的相对表达量。以第3代间充质干细胞的foxa2基因(或soxl7基因)的表达量为1，计算采用培养基A和B诱导培养后的细胞中各个基因的相对表达量。采用培养基A和B序贯诱导培养后的细胞中，foxa2基因的相对表达量为15.43，soxl7基因的相对表达量为4.70。结果见图5。
[0118]以上鉴定结果表明，采用培养基A和B诱导培养后的细胞主要为人限定性内胚层细胞(如上所述，表达了限定性内胚层细胞的特异性标志基因，并显示了限定性内胚层细胞的形态)。[0119]3、限定性内胚层细胞分化为胰腺干细胞的鉴定
[0120](I)形态鉴定
[0121]在培养基C中培养6d，培养过程中细胞的形态变化如下:细胞逐渐变小并呈团状聚集状态。在培养基C中培养6d的细胞见图6。
[0122](2)免疫荧光染色鉴定
[0123]将步骤二的2中培养6d的细胞(将第3代间充质干细胞作为对照)进行免疫荧光染色，分别检测胰腺干细胞标志Pdxl和限定性内胚层细胞标志Foxa2的表达情况。
[0124]检测Pdxl的具体方法与检测Foxa2的具体方法基本相同，差别仅在于采用山羊抗人Pdxl单克隆抗体(工作浓度为1:100稀释)作为一抗。第3代间充质干细胞均不显示红色荧光，为阴性结果。采用培养基C诱导培养后的细胞90%以上显示红色荧光。
[0125]结果见图7 (A为第3代间充质干细胞诱导获得的限定性内胚层细胞，B为采用培养基C诱导培养后的细胞)。结果表明，采用培养基C诱导培养后大部分细胞为Pdxl免疫细胞荧光染色阳性。
[0126](3)实时定量PCR分析
[0127]取步骤二的2中培养6d的细胞(将第3代间充质干细胞作为对照)，提取总RNA并反转录为。0嫩，通过实时定量？0?分别鉴定？(111、？48、3(?9、!11^6、!11^113、败16.1和Nkx2.2基因的表达情况。采用人GAPDH作为各基因的对照，所用的引物如下:
[0128]用于扩增Pdxl的引物为:
[0129]上游引物:5，-TACTGGATTGGCGTTGTTTGTGGC-3，(SEQID N0:7)；
[0130]下游引物:5’-AGGGAGCCTTCCAATGTGTATGGT-3’(SEQ ID NO:8)。
[0131]用于扩增P48的引物为:
[0132]上游引物:5’-TTCACCGACCAGTCTTCACG-3’ (SEQ ID N0:9)；
[0133]下游引物:5，-GTGGCTAAGGAACTCCACCT-3，(SEQID NO: 10)。
[0134]用于扩增Sox9的引物为:
[0135]上游引物:5’-GGCGGAGGAAGTCGGTGAAG-3’ (SEQ ID NO: 11)；
[0136]下游引物:5，-GGGTGCGGTGCTGCTGAT-3，(SEQID NO: 12)。
[0137]用于扩增Hnf6的引物为:
[0138]上游引物:5’-TGTGGAAGTGGCTGCAGGA-3’ (SEQ IDNO: 13)；
[0139]下游引物:5，-TGTGAAGACCAACCTGGGCT-3’(SEQID NO: 14)。
[0140]用于扩增Hnflb的引物为:
[0141]上游引物:5，-GCACCTCTCCCAGCATCTCA-3’(SEQ IDNO: 15)；
[0142]下游引物:5’-GTCGGAGGATCTCTCGTTGC-3’(SEQ ID NO: 16)。
[0143]用于扩增Nkx6.1的引物为:
[0144]上游引物:5’-AGAGAGTCAGGTCAAGGTCTGGTT-3’ (SEQ ID NO: 17)；
[0145]下游引物:5，-TGTCTCCGAGTCCTGCTTCTTCTT-3’(SEQIDN0:18)。
[0146]用于扩增Nkx2.2的引物为:
[0147]上游引物:5’-GACAACTGGTGGCAGATTTCGCTT-3’ (SEQ ID NO: 19)；
[0148]下游引物:5’ -AGCCACAAAGAAAGGAGTTGGACC-3 ’ (SEQ IDNO: 20 )。
[0149]用于扩增GAPDH的引物为:[0150]上游引物:5’-GGTCACCAGGGCTGCTTTTA-3’ (SEQ ID N0:5)；
[0151]下游引物:5，-GAGGGATCTCGCTCCTGGA-3’(SEQID N0:6)。
[0152]采用ΛΛ CT法计算各基因的相对表达量。以第3代间充质干细胞的Pdxl基因(或ρ48基因或sox9基因或hnf6基因或hnf Ib基因或nkx6.1基因或nkx2.2基因)的表达量为1，计算采用培养基C诱导培养后的细胞中各个基因的相对表达量。采用培养基C诱导培养后的细胞中，Pdxl基因的相对表达量为49.53，p48基因的相对表达量为58.04，sox9基因的相对表达量为2.24, hnf6基因的相对表达量为4.30，hnf Ib基因的相对表达量为24.41，nkx6.1基因的相对表达量为6.50,nkx2.2基因的相对表达量为17.71。结果见图8。结果表明，采用培养基C培养后，人间充质干细胞来源的限定性内胚层细胞的胰腺干细胞基因Pdxl、胰腺内胚层及胰腺前体细胞基因P48、Sox9、Hnf6、Hnflb、Nkx6.1和Nkx2.2基因的表达均上调。以上鉴定结果表明，采用培养基C诱导培养后呈团状聚集状态的细胞即为胰腺干细胞(该细胞表达胰腺干细胞特异性标志基因，并显示出团状聚集状态，且该细胞进一步诱导可获得胰腺内分泌细胞和胰腺外分泌细胞)。
[0153]4、胰腺干细胞体外分化为胰腺内分泌细胞的鉴定
[0154](I)免疫荧光染色鉴定
[0155]将步骤二的3中培养8d的细胞(将第3代间充质干细胞作为对照)进行免疫荧光染色，检测内分泌细胞标 志胰岛素(Insulin)和C肽(C-peptide)的表达情况。
[0156]检测胰岛素的具体方法与检测Foxa2的具体方法基本相同，差别仅在于采用兔抗人胰岛素单克隆抗体(工作浓度为1:50稀释)作为一抗，采用异硫氰酸(绿色荧光)标记的山羊抗兔IgG作为二抗。第3代间充质干细胞均不显示绿色荧光，为阴性结果。采用培养基D诱导培养后的细胞95%以上显示绿色荧光。
[0157]检测C肽的具体方法与检测Foxa2的具体方法基本相同，差别仅在于采用兔抗人C肽多克隆抗体(工作浓度为1:100稀释)作为一抗，采用罗丹明(红色荧光)标记的山羊抗兔IgG作为二抗。第3代间充质干细胞均不显示红色荧光，为阴性结果。采用培养基D诱导培养后的细胞95%以上显示红色荧光。
[0158]结果见图9 (A为第3代间充质干细胞诱导获得的Pdxl阳性细胞，B为采用培养基D诱导培养后的细胞)。结果表明，采用培养基D诱导培养后大部分细胞为胰岛素和C肽阳性。
[0159](3)实时定量PCR分析
[0160]取步骤二的3中的细胞，将在培养基D中培养8d的细胞(将第3代间充质干细胞作为对照)提取总RNA并反转录为cDNA，通过实时定量PCR鉴定胰岛素基因、胰高血糖素基因、生长抑素基因、胰多肽(Pan-pol)基因、ghrelin基因、MafA基因和Glut-2基因的表达情况。采用人GAPDH作为各基因的对照，所用的引物如下
[0161]用于扩增胰岛素基因的引物为:
[0162]上游引物:5’-AGAGGCCATCAAGCAGATCACTGT-3’(SEQ ID NO:21);
[0163]下游引物:5’-CACAGGTGTTGGTTCACAAAGGCT-3’(SEQ ID N0:22)。
[0164]用于扩增胰高血糖素基因的引物为:
[0165]上游引物:5’-TCTTGATAATCTTGCCGCCAGGGA-3’ (SEQ ID NO:23)；
[0166]下游引物:5’-CATGCAAAGCAATGTGGCCTCAGA-3’(SEQ ID NO:24)。[0167]用于扩增生长抑素基因的引物为:
【权利要求】
1.一种培养基C，其由动物细胞基础培养基和溶质组成；所述溶质及其在动物细胞基础培养基中的浓度如下:0.50X 10 5mol/L_2.0X 10 5mol/L 维甲酸、10ng/ml-30ng/ml EGF>10ng/ml-100ng/ml bFGF、20ng/ml-200ng/ml Dkkl、0.2mmol/L-10mmol/L 谷氨酸胺、体积比为0.2%-5%的非必需氨基酸以及可选的体积比为0.5%-5%的B27 ;优选地，0.95X 10_5mol/L-1.05X 10 5mol/L 维甲酸、19ng/ml_21ng/ml EGF、32ng/ml_64ng/ml bFGF、80ng/ml-120ng/ml Dkkl> 1.9mmol/L_2.lmmol/L 谷氨酰胺、体积比为 0.95%-1.05% 的非必需氨基酸以及可选的体积比为1.9%-2.1%的B27 ;并且其中所述动物细胞基础培养基为高糖DMEM培养基或DMEM/F12培养基。
2.根据权利要求1所述的培养基C，其特征在于其由DMEM/F12培养基和溶质组成；所述溶质及其在培养基B中的浓度如下:10_5mol/L维甲酸、20ng/ml EGF、60ng/ml bFGF、100ng/ml Dkkl、2mmol/L谷氨酰胺、体积比为1%的非必需氨基酸以及可选的体积比为2%的B27。
3.一种将间充质干细胞诱导为胰腺干细胞的试剂盒，其由培养基A、培养基B和培养基C组成，其中 所述培养基A由动物细胞基础培养基和溶质组成；所述溶质及其在动物细胞基础培养基中的浓度如下:1.00ml/L-20.00ml/L 胎牛血清、1.0Ong/mL-15.00ng/mL activin A和 10-200ng/mL wnt3a ；优选地，4.75ml/L_5.25ml/L 月台牛血清、4.75ng/mL_5.25ng/mLactivin A 和 40_60ng/mL wnt3a ； 所述培养基B由动物细胞基础培养基和溶质组成；所述溶质及其在动物细胞基础培养基中的浓度如下:1.0 0ml/L-20.00ml/L 胎牛血清和 1.0Ong/mL-15.00ng/mL activin A ;优选地,4.75ml/L-5.25ml/L 胎牛血清和 4.75ng/mL_5.25ng/mL activin A ； 所述培养基C如权利要求1所述； 并且其中所述动物细胞基础培养基为高糖DMEM培养基或DMEM/F12培养基。
4.根据权利要求3所述的将间充质干细胞诱导为胰腺干细胞的试剂盒，其特征在于: 所述培养基A由高糖DMEM培养基和溶质组成；所述溶质及其在培养基A中的浓度如下:5ml/L 胎牛血清、5ng/mL activin A 和 5ng/mL wnt3a ； 所述培养基B由高糖DMEM培养基和溶质组成；所述溶质及其在培养基A中的浓度如下:5ml/L 胎牛血清和 5ng/mL activin A ； 所述培养基C如权利要求2所述。
5.根据权利要求3或4所述的将间充质干细胞诱导为胰腺干细胞的试剂盒，其特征在于其还包括培养基D或E，其中 培养基D由高糖DMEM培养基和溶质组成；所述溶质及其在培养基D中的浓度如下:5ml/L胎牛血清、20ng/ml exendin-4、10ng/ml activin A、lOmmol/L尼克酸胺、体积比为 2%的B27和体积比为1%的N2 ； 培养基E由高糖DMEM培养基和溶质组成；所述溶质及其在培养基E中的浓度如下:5ml/L 胎牛血清、20ng/ml exendin-4、15ng/ml FGF7、10mmol/L 尼克酰胺、体积比为 2% 的B27和体积比为1%的N 2。
6.根据权利要求3-5任一项所述的将间充质干细胞诱导为胰腺干细胞的试剂盒，其特征在于所述间充质干细胞为脂肪间充质干细胞，优选地，所述间充质干细胞为第3代间充质干细胞。
7.一种将间充质干细胞诱导为胰腺干细胞的方法，其包括步骤:将间充质干细胞依次用权利要求3或4所述的试剂盒中的培养基A、培养基B和权利要求1或2中所述的培养基C进行培养，得到胰腺干细胞，其中所述间充质干细胞采用常规方法获得。
8.根据权利要求7所述的将间充质干细胞诱导为胰腺干细胞的方法，其特征在于:所述方法包括如下步骤: 1)将常规方法获得的间充质干细胞接种于所述培养基A中，培养Id； 2)将完成步骤I)的细胞转接于所述培养基B中，培养4-5d； 3)将完成步骤2)的细胞转接于所述培养基C中，培养4-6d，得到胰腺干细胞。
9.根据权利要求8所述的将间充质干细胞诱导为胰腺干细胞的方法，其特征在于:所述步骤(1)中，所述间充质干细胞在所述培养基A中的初始浓度为2 X IO5个/ml-1 X IO6个/ml ;所述方法中，整个培养过程的培养条件为:在37°C、50ml/LC02、空气相对湿度为95%的培养箱中培养。
10.根据权利要求7-9任一项所述的将间充质干细胞诱导为胰腺干细胞的方法，其还包括下述步骤: 将得到的胰腺干细胞分别加入培养基D或培养基E，每孔2000 μ L，在37°C、50ml/LCO2、空气相对湿度为95%的 培养箱中培养8d，每2d吸弃上清并加入2000 μ L新的培养基D或E0
11.一种根据权利要求7-9任一项所述的将间充质干细胞诱导为胰腺干细胞的方法获得的胰腺干细胞。
【文档编号】C12N5/074GK103710302SQ201210371241
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2012年9月28日 优先权日:2012年9月28日
【发明者】赵春华 申请人:中国医学科学院基础医学研究所