专利名称：一种rna的预备模板pcr检测方法
技术领域：
本发明涉及一种RNA的预备模板PCR (Template-Ready PCR, TRPCR)检测方法。
背景技术：
RNA是遗传信息传递的载体。RT-PCR (reverse transcription逆转录-聚合酶链反应)，指将逆转录反应(Reverse Transcription, RT)和 PCR (Polymerase ChainReaction)反应组合在一起的方法.RT- PCR将以RNA为模板的cDNA合成，即RT，同PCR结合在一起，提供了一种分析基因表达的快速灵敏的方法。RNA的RT-PCR检测或定量分析，比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及SI核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作，已发展成为进行基因表达水平的检测分析，病原体的检测分析等 有力的手段。RT-PCR的模板可以为总RNA或poly (A) +RNA.其中RT需要用逆转录酶，可以用随机引物、oligo (dT)或基因特异性的引物(GSP)起始.RT和PCR可以在两个反应管中分步先后进行(两管法)，也可以在一个反应管中先后进行(一管法)。两管法比较常见，在两管法RT-PCR中，每一步都可以尽量在最佳条件下进行，但由于RT体系中含有PCR抑制物，所以一般只能取出约5%的RT产物进行PCR，这限制了最终检测的灵敏度，但在使用一个样品检测多个目标RNA时比较很有用——因为一个RT产物可以分别用于很多个PCR反应。一管法RT-PCR中，RT和PCR在一只管中进行，必须尽可能地提供同时为逆转录和PCR优化的条件.一步法RT-PCR在处理大量样品时易于操作，有助于减少残余污染，因为在cDNA合成和扩增之间不需要打开管盖.一步法优化成功的话，可以得到更高的灵敏度，最低可以达到0. Ipg总RNA，这是因为整个cDNA样品都被扩增-理论上灵敏度可以比两管法提高20倍.然而，为一步法RT-PCR优化的条件很难掌控，经常会带来严重的非特异扩增，而且成本上有很大提升.虽然RT-PCR在科研领域的推广普及程度很高，但在临床检测应用方面，仍存在很大的改进空间.主要问题包括步骤繁琐，对操作要求高，特别是2种酶促反应(RT和PCR)的最优反应条件是有差异的，容易受到各种抑制物质的影响，也容易受到非特异扩增和假阳性的困扰，最后，逆转录酶的价格居高不下，操作成本很难降下来.
发明内容
本发明目的是提供一种操作简单快速、特异性强的用于RNA检测的预备模板PC检测方法。本发明采用的技术方案是一种RNA的预备模板PCR检测方法，所述方法包括(I)设计与目标RNA上任意一段序列互补的长度为25 40mer的单链寡核苷酸DNA，记为探针A ;探针A的GC含量为40-60%，解链温度(Tm值)为70_85°C ;将探针A锚定在PCR管内，得到锚定PCR管；探针A的锚定可以采用本领域常规方法进行，用于锚定探针A的固体介质，可以是塑料离心管，也可以是磁珠，凝胶颗粒或其他可以吸附结合核酸的固体介质；(2)设计部分序列与目标RNA上任意的另一段序列互补的单链寡核苷酸DNA，其结构为两端是特异的长度为2(T30mer的PCR引物序列、中间为与目标RNA互补的长度为25 40merbp的序列，记为探针B ;探针B的GC含量为40_60%，解链温度(Tm值)为70_85°C，与探针A和目标RNA的结合区域互不重叠。(3)取待测样本，加入探针B和裂解液，反复吸打，转移至离心管中，冰上放置20min, 4°C离心，取上清液，得到裂解上清液；所述裂解液为本领域常规含有表面活性剂(如吐温20、NP-40等)、用于细胞或组织裂解的缓冲液；待测样本可来自组织或细胞，或者临床标本如痰液、血液等；
待测样本来自痰液时，裂解上清液获得方法如下1飞ml痰液+ 5^10 ml痰融液，37。。振荡IOmin, 4°C >5000 rpm离心IOmin,弃上清,取沉淀+ 200 ul裂解液(其中探针8浓度为1_01/1)，反复吸打，转移到1.5 ml离心管中，冰上放置20min，4°C、15000 rpm离心20min，取上清，得到裂解上清液；痰融液组成PBS+O. 1% (w/vol)DTT0待测样本来自细胞时，裂解上清液获得方法如下24孔板细胞培养，吸去培养液，+ 200ul裂解液(其中探针B浓度为lnmol/Lol/L)，反复吸打，转移到1.5 ml离心管中，冰上放置20min，4°C、15000 rpm离心20min，取上清，得到裂解上清液；待测样本来自组织时，裂解上清液获得方法如下取约0. lmmol/L3大小的组织块放入I. 5 ml离心管中，+ 200ul裂解液(其中探针B浓度为lnmol/Lol/L)，用吸头捣碎组织，室温振荡IOmin, 4°C、15000 rpm离心20min,取上清,得到裂解上清液；(4)取裂解上清液20uL至锚定PCR管中，6(T70°C保温5 15min，吸干管内液体，以洗涤液洗涤3、次，吸干，加入20uL由PCR缓冲液和PCR引物(该PCR引物即与探针B两端的PCR引物序列相同的引物对)配制的PCR反应液(PCR反应液中引物对浓度为0. 2umol/Lol/L)，进行PCR扩增，扩增产物进行SYBR荧光定量分析；所述缓冲液为PCR反应常规缓冲液；所述洗涤液可为本领域常规含有表面活性剂(如吐温20、NP-40等)的缓冲液。在杂交反应之后，通过多次反复的洗涤，在洗去未杂交结合的核酸的同时，也洗去了其他可能干扰PCR反应的物质，从而保证了 PCR反应的特异性和成功率；(5)以空白裂解液作为阴性对照，按照步骤(I)和(2)方法进行处理和分析，以样本Ct值小于空白裂解液Ct值判断为阳性。本发明方法原理如下(1)预先制备好与目标RNA上一段序列互补的锚定探针——探针A ;探针A被固定在PCR管壁，磁珠或其他可吸附结合核酸的固体介质上，作用是通过特异性地结合目标RNA,将目标RNA选择性地吸附在固体介质上；(2)与目标RNA上另一段序列互补的模板探针——探针B ;探针B两端带有PCR引物序列，使用时是添加在裂解液中的；当细胞被裂解后，探针B通过部分杂交与目标RNA结合，这样探针B也就被选择性地吸附在上述固体介质上；(3)在杂交反应之后，经过反复清洗，只有能与探针A互补杂交结合的目标RNA分子及与该RNA杂交结合的探针B留在反应管中；(4)由于探针B两端带有PCR引物序列，这样加入PCR反应液后，以探针B为模板，不需要RT，可直接进行PCR反应。优选的，所述裂解液组成如下l%(w/vol)SDS, 500mmol/Lol/L NaCl, 2mmol/Lol/L MgCI o, 10mmol /LoI /T, 2_ 疏基乙醇，0. lmg/ml 鱼精 DNA (市购)，0. 1% (vol/vol)Tween20,1% (w/vol)脱脂奶粉，溶剂为 10mmol/Lol/L、pH7. 5 的 Tris-HCl。优选的，所述PCR 缓冲液组成如下50mmol/Lol/L KCl, I. 5mmol/Lol/L MgCl2,0.2mmol/Lol/L dNTP，5% (vol/vol) DMSO,0. 05% (vol/vol) Tween20,0. 4XSYBR Green I(浓度0.4X的含义是，其中各组分在反应液中的终浓度为IXSYBR Green I中的0.4倍，市购生产商Microprobe的SYBR Green I原液为10000 X，使用时按体积比稀释至PCR缓冲液中终浓度为 0.4X 即可)，0. 5U/20ul Taq 酶，溶剂为 10mmol/Lol/L、pH9. 0 的 Tris-HCl。优选的，所述洗涤液为TBST缓冲液，其终浓度组成如下150 mmol/L NaCl,0. 05%Tween 20，溶剂为 10 mmol/L、pH 7.5Tris_HCl。所述方法用于检测端粒酶催化亚基(hTERT)时，所述探针A序列如下5’_GACTCAG
CTGCGTCTGGGCTGTCCTGAGTGACCCCA-3，，所述探针 B 序列如下5，-CCGGAGGAAAGCGTGGACACCCTCCTTCAGGCAGGACACCTGGCGGAAGGAGGGGGCCGACGGTTGAGGTTTCGGCG-3’ ；所述 PCR 引物为NTPl :5’ -CCGGAGGAAAGCGTGGACACC-3’ 和 NTP2 :5’ - CGCCGAAACCTCAACCGTCG -3’ ；所述方法用于检测人Bcl-2基因时，所述探针A的序列为ccgcatcccactcgtagcccctctgcgaca,所述探针 B 的序列为CGCCGAAACCTCAACCGTCGcacacacatgaccccaccgaactca aagaaggccacaatcggtgtccacgctttcctccgg,所述 PCR 引物序列为NTPl :5’ -CCGGAGGAAAGCGTGGACACC-3’ 和 NTP2 :5’ - CGCCGAAACCTCAACCGTCG -3’ ；所述方法用于检测人PAR-2基因时，所述探针A的序列为cagggcatagacatggctctggccctggct,所述探针 B 的序列为CGCCGAAACCTCAACCGTCGcttggcaaacccaccacaaacacaattgtgtagacaattgggtgtccacgctttcctccgg,所述 PCR 引物序列为NTPl :5’ -CCGGAGGAAAGCGTGGACACC-3’ 和 NTP2 :5’ - CGCCGAAACCTCAACCGTCG -3’ ；或者，所述探针A序列为ctctctccagcgccgcgcgaggctcc,所述探针B序列为CGCCGAAACCTCAACCGTCGccaaatcttctcactccttctgttaaccacaccactccggggtgtccacgctttcctccgg,所述 PCR 弓丨物序列为NTP1 :5’ -CCGGAGGAAAGCGTGGACACC-3’ 和 NTP2 :5’ - CGCCGAAACCTCAACCGTCG -3’ ；所述方法用于检测人hRPLPO基因时，所述探针A的序列为AGCCAAGAAGGCCTTGACCTTTTCAGCAAGTGGGAA,所述探针 B 的序列为CCGGAGGAAAGCGTGGACACCTGCCCATCAGCACCACAGCCTTCCCGCGAAGGGACACGACGGTTGAGGTTTCGGCG,所述 PCR 引物序列为NTP1 5， -CCGGAGGAAAGCGTGGACACC-3，和 NTP2 :5， - CGCCGAAACCTCAACCGTCG -3，；所述方法用于检测人hGAPDH基因时，所述探针A的序列为ggactccacgacgtactcagcgccagcatc,所述探针 B 的序列为CAGGAGCAGCATTCCATCACGgaagtcagaggagaccacctggtgctcagtgtagcccaggCGTCGCAGGTCCAGAGAAGG,所述 PCR 引物序列为NTPl :5’ -CCGGAGGAAAGCGTGGACACC-3’ 和 NTP2 :5’ - CGCCGAAACCTCAACCGTCG -3’ ；所述方法用于检测人hTERC基因时，所述探针A的序列为gcatgtgtgagccgagtcctgggtgcac,所述探针 B 的序列为CAGGAGCAGCATTCCATCACGagcacggcgcctacgcccttctcagttagggttagacCGTCGCAGGTCCAGAGAAGG,所述 PCR 引物序列为NTP1 5， -CCGGAGGAAAGCGTGGACACC-3，和 NTP2 :5， - CGCCGAAACCTCAACCGTCG -3，；所述方法用于检测大肠杆菌中氨苄青霉素抗性基因时，所述探针A的序列为CGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGT,所述探针 B 的序列为CAGGAGCAGCAITCCATCACGCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGCGTCGCAGGTCCAGAGAAGG,所述 PCR 引物序列为NTP1 5，-CCGGAGGAAAGCGTGGACACC-3，和 NTP2 :5，- CGCCGAAACCTCAACCGTCG -3，。本发明采用最新的预备模板PCR (Template-Ready PCR，TRPCR)技术，整个PCR的前处理流程被简化成裂解保温洗涤等3步简单操作，耗时由常规的3个小时以上，减少到50分钟以下，不需要纯化RNA，不需要去除DNA，不需要对RNA进行特别的保护，不需要进行逆转录反应，因此，操作简单，快速，标准化程度高。由于RNA的利用率高，引物是特别优化设计，且通过洗涤步骤能去除各种干扰因素，PCR的特异扩增效率得到了很大的增强。
图I为本发明原理示意图；A:探针A;B:探针B;C:固定介质；P1/P2:引物对；RNA:目标RNA; IIII:双链互补杂交结合；图2为琼脂糖电泳结合EB染色检测结果；
图3为采用TRPCR与RT-PCR对hTERT mRNA的检测结果比较；I 4为TRPCR法；I.空白裂解液对照，2.大肠杆菌裂解对照，3.磁珠法50ul，4.偶联法50ul; 5 8为RT-PCR法；5. MM0L/LLV,6. AMV, 7. FD, 8. Tth; M. Marker;“〉”指示特异扩增条带的位置；“〉〉”指示引物聚合体的位置。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例I :洗涤去除非固定的探针B用于检测hTERT mRNA 的探针 B : 5’ -CAGGAGCAGCATTCCATCACGCTCCTTCAGGCAGGACACCTGGCGGAAGGAGGGGGCCGTCGCAGGTCCAGAGAAGG-3’，阴影部分为与 mRNA 结合的互补序列，两端为 PCR 引物序列。PCR 引物TABl CAGGAGCAGCATTCCATCACG, TAB2 CCTTCTCTGGACCTGCGACG。人肺癌细胞株A549细胞于24孔板中进行细胞培养，1000个细胞/孔，过夜培养后，吸去培养液，+ 200ul裂解液B (裂解液添加探针B浓度为lnmol/L)，反复吸打，转移到I. 5 ml离心管中，冰上放置20min，4°C、15000 rpm离心20min，取上清，得到细胞裂解上清液；裂解液 B 组成如下1% SDS,500mmol/L NaCl,2mmol/L MgCl2,10mmol/L 2-巯基乙醇，0. lmg/ml 鱼精 DNA (Sigma 公司)，0. 1% Tween20,1% 脱脂奶粉，lnmol/L 探针 B，溶剂为10mmol/L、pH7.5 的 Tris-HCl ；取50ul的上述的细胞裂解液上清，其中含有lnmol/L的探针B，加到0. 2ml的PCR薄壁管中，66°C保温lOmin，再吸干管内液体，以TBST缓冲液洗涤1，3，5，7，9或12次，力口入50ul PCR反应液(50ul PCR缓冲液+引物对0. 2umol/L)，进行PCR程序(94°C 3min预变性，然后40个循环的94°C 3s, 66 °C 30s，二步法)，以SYBR green I荧光定量分析，结果显示洗涤次数达到及超过5次，探针B不再有强于空白对照的扩增信号(Ct值与空白相当)，表明洗涤步骤可以彻底洗掉不结合的探针DNA。
权利要求
1.一种RNA的预备模板PCR检测方法，所述方法包括 (1)设计与目标RNA上任意一段序列互补的长度为25 40mer的单链寡核苷酸DNA，记为探针A ;探针A的GC含量为40 60%，解链温度为7(T85°C ;将探针A锚定在PCR管内，得到锚定PCR管； (2)设计部分序列与目标RNA上另一段任意序列互补的单链寡核苷酸DNA，其结构为两端是特异的长度为2(T30mer的PCR引物序列、中间为与目标RNA互补的长度为25 40mer的序列，记为探针B ;探针B的GC含量为40飞0%，解链温度为7(T85°C，与探针A和目标RNA的结合区域互不重叠； (3)取待测样本，加入探针B和含表面活性剂的细胞裂解液，反复吸打，转移至离心管中，冰上放置20min，4°C离心，取上清液，得到裂解上清液； (4)取裂解上清液20uL至锚定PCR管中，6(T70°C保温5 15min，吸干管内液体，以洗涤液洗涤3、次，吸干，加入20uL由PCR缓冲液和PCR引物配制的PCR反应液，进行PCR扩增，扩增产物进行荧光定量分析； (5)以空白裂解液作为阴性对照，按照步骤(I)和(2)方法进行处理和分析，以样本Ct值小于空白裂解液Ct值判断为阳性。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于所述裂解液组成如下1%SDS,500mmol/LNaCl, 2mmol/L MgCl2,10mmol/L 2-疏基乙醇，0. lmg/ml 鱼精 DNA, 0.1% Tween20,1% 脱脂奶粉，溶剂为 10mmol/L、pH7. 5 的 Tris-HCl。
3.如权利要求I所述的方法，其特征在于所述PCR缓冲液组成如下50mmol/LKCl,1.5mmol/L MgCl2,0. 2mmol/L dNTP，5% DMS0,0. 05% Tween20,0. 4XSYBR Green I,0. 5U/20ul Taq 酶，溶剂为 10mmol/L、pH9. 0 的 Tris-HCl0
4.如权利要求I所述的方法，其特征在于所述洗涤液为TBST缓冲液。
全文摘要
本发明提供了一种RNA的预备模板PCR(Template-Ready PCR，TRPCR)检测方法。本发明方法与采用传统的RT-PCR方法相比，不需要纯化抽提RNA，不需要进行逆转录反应，将原本长达3个小时以上的PCR前处理过程缩短为约50分钟，因此，操作简便快速易行，具有较高的RNA检测的灵敏度和特异性，适合对各种来源的样品裂解得到RNA进行检测。
文档编号C12Q1/68GK102864233SQ201210371539
公开日2013年1月9日 申请日期2012年9月27日 优先权日2012年9月27日
发明者陈燃, 伍迪, 金晓铮 申请人:浙江今复康生物科技有限公司