专利名称：一种快速测定水产品中副溶血性弧菌总量的方法
技术领域：
本发明属于水产品质量安全检测领域，特别涉及一种快速测定水产品中副溶血性弧菌总量的方法。
背景技术：
副溶血性弧菌(Vibrio parahaemoIyticus,简称V. p)是一种广泛分布于海水、海底沉积物、海产品及盐溃食品中的嗜盐性细菌，也是目前引起我国食源性疾病的首要病原菌。该菌的最大特点是需盐才能生长，因此频繁在海产品或盐溃食品中被分离出来。人们食用受该菌污染的食物后，极易导致急性胃痛、腹痛、呕吐等为主要症状的食源性疾病，严重时可出现脱水、休克，甚至死亡。为此，该菌被我国列入海产食品中致病微生物的重点监控指标之一。 关于V. P引起食源性疾病的发病剂量目前尚不十分清楚，但一些发达国家和地区根据自身情况对其规定了安全限量，如美国规定贝类为10000MPN/g，日本和欧盟则为100MPN/g，均是采用定量检测进行测定。我国对V. P开展的监控主要是定性检测，检出即为不合格，这也严重影响了我国的出口贸易，2011年开始我国对V. P的限量进行了修改，征求意见值为100MPN/g。国际上通用的V.p定量检测方法为美国FDA细菌管理手册中的最大可能数(MPN)法，2008年我国将其发布为国家标准(GB/T 4789. 7-2008)，该方法具有准确性高、应用范围广等特点，但是检测耗时长、实验工作繁琐，通常需要4-5d才能得到结果，无法满足当前食品安全快速检测的需求。此外，也有采用分子生物学法、微生物快速检测试剂片等测定V. P的研究报道，但这些方法大多存在假阳性或假阴性的特点，并且实验成本昂贵、技术要求高，有的也不能完全反映检测样品中该菌污染的真实程度。因此，建立简单、快速、准确的检测副溶血性弧菌总量的方法具有十分重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种快速测定水产品中副溶血性弧菌总量的方法，该方法具有良好的选择性和试验重复性，结果准确可靠，操作步骤简单，成本低廉，可以达到快速检测的目的，结果可在l-2d内得到，同时无需昂贵复杂的试验材料，可以避免该菌的计数结果偏低。本发明的一种快速测定水产品中副溶血性弧菌总量的方法，包括(I)从水产品中取部分或全部组织作为检样；取10mL 15mL选择性显色培养基倾注到无菌培养皿中，室温下放置，待完全凝固后，再取10mL 15mL已灭菌的冷至45飞5°C的胰蛋白胨大豆琼脂培养基倾注到选择性显色培养基上，静置凝固，得到双层平板培养基；(2)取上述检样按lg:9mL加入含3wt% 3. 5wt%氯化钠的缓冲蛋白胨水中，制成1:10的样品匀液，将1:10的样品匀液进一步稀释为1:100的样品匀液；(3)根据样品污染程度，取2 3个稀释度的样品匀液，吸取0. ImL ImL至步骤(I)中的双层平板培养基上，均匀涂布，同时分别取空白稀释液做空白试验对照；待涂布液体完全浸入培养基中后，将平板翻转，置于32°C 37°C培养箱中培养24h 36h，进行计数与报告，即得副溶血性弧菌总量。所述步骤(I)中从水产品中取部分或全部组织的具体工艺为鱼类或头足类取表面肉组织；或贝类取全部内容物，包括贝肉和体液；或甲壳类取整个动物或者动物的中心部分，包括肠和腮。所述贝类中的带壳贝类以及甲壳类先刷洗外壳并甩干表面水分，然后以无菌操作打开外壳，取相应部分。 所述步骤(I)中的胰蛋白胨大豆琼脂培养基中NaCl的添加量为I. 5wt%^3. 5wt%。所述步骤(2)中制成1:10的样品匀液的具体工艺为用均质器均质lmirT2min或 将检样放入无菌研钵中磨碎，然后放入灭菌容器内充分振荡。所述步骤(2)中稀释为1:100的样品匀液的具体工艺为用无菌枪头或吸管吸取1:10的样品匀液lmL，注入盛有9mL无菌生理盐水的试管内，振摇混匀，制得1:100的样品匀液。所述步骤(3)中每个稀释度做2 3个平皿。本发明中选择性显色培养基(BCVM)购自科马嘉公司。胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)和硫代硫酸钠柠檬酸胆盐蔗糖琼脂培养基(TCBS)购自上海市疾病预防控制中心。TSA为通用的细菌培养基，添加一定量的钠盐后有利于副溶血性弧菌的生长。TCBS是弧菌选择性培养基，对副溶血性弧菌、创伤弧菌、拟弧菌等具有较强的选择性，但是易造成对V. P计数偏高的现象。BCVM也是一种选择性显色培养基，但因其对副溶血性弧菌显示专一的紫色，可以避免计数结果偏高。双层平板(DLAP)的底层是BCVM，上层是添加钠盐的TSA，既能克服V. P受伤状态下被抑制生长，又具有菌落生长颜色特征的唯一性，可以体现样品中该菌的真实数量。所述步骤(2)中的稀释原则为梯度稀释，检样和稀释液按I :9的比例准确吸取混合，并依次进行梯度稀释，此稀释方法对最终的计数和报告的准确性有关键作用。有益效果本发明具有良好的选择性，试验重复性好，结果准确可靠，操作步骤简单，成本低廉，可以达到快速检测的目的，结果可在l-2d内读取，同时实验无需昂贵复杂的试验材料，可以避免该菌的计数结果偏低，适用于水产品中副溶血性弧菌的定量监控，在水产品质量安全领域具有无可比拟的优势和广泛的应用前景。
图I为四种检测方法对冷冻前(a)、后(b)混合菌悬液中V. P的测定图(n=3)；图2为四种检测方法对冷藏的牡蛎样品中V.p的测定图(n=3)。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例II.菌株副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus),大肠杆菌(Escherichinacoli),沙门氏菌(Salmonella)。2.混合菌悬液制备将上述菌株分别接种于缓冲蛋白胨水(V. P接种至含3wt%NaCl的缓冲蛋白胨水中)于35°C静置培养24h后取出，用接种环取一环转接至胰蛋白胨大豆琼脂平板上(V. P转接至含3wt%NaCl的胰蛋白胨大豆琼脂平板上)于35°C静置过夜培养。挑取生长旺盛的菌落于缓冲蛋白胨水中再次培养，重复传代几次后，收集菌悬液于灭菌的离心管中，4000r/min离心，弃去上清液，用生理盐水将沉淀打散混匀，制成菌悬液备用。将几种菌的菌悬液转至无菌的缓冲蛋白胨水中混合，制成混合菌悬液。细菌初始值的测定按照GB4789. 2-2010测定。3.平板制备分别将灭菌好的硫代硫酸钠柠檬酸胆盐蔗糖琼脂培养基(TCBS)和弧菌选择性培养基(BCVM)倾注到无菌培养皿中，制成相应的培养平板，静置凝固待用。双 层平板(DLAP)的制备，取约IOmL选择性显色培养基倾注到无菌培养皿中，室温下放置，待完全凝固后，再取约IOmL已灭菌的冷至45 55°C的胰蛋白胨大豆琼脂培养基倾注到选择性显色培养基上，静置凝固，得到双层平板培养基。4.双层平板(DLAP )法对混合菌悬液中副溶血性弧菌的测定用MPN法、DLAP法、TCBS法和BCVM法对混合菌悬液中的V. P进行定量测定，判断DLAP的测定结果。其中，双层平板法具体为取检样按lg:9mL加入含3wt%氯化钠的缓冲蛋白胨水中，制成1:10的样品匀液，将1:10的样品匀液进一步稀释为1:100的样品匀液；根据样品污染程度，取2 3个稀释度的样品匀液，吸取O. ImL至双层平板培养基上，均匀涂布，同时分别取空白稀释液做试验对照；待涂布液体完全浸入培养基中后，将平板翻转，置于35°C培养箱中培养24h，进行计数与报告，即得副溶血性弧菌总量。将混合菌悬液进行人工模拟减菌，在_18°C条件下处理24h，判断DLAP的测定结果。5.双层平板(DLAP)法对冷藏的牡蛎样品进行测定新鲜购买的牡蛎样品经过人工染菌，在5°C条件下冷藏24h后，判断DLAP的测定结果。6.双层平板(DLAP)法对不同水产品中副溶血性弧菌的测定对不同的水产品基质进行人工染菌，分别测定初始状态和经过减菌处理后的样品中副溶血性弧菌的总量，判断DLAP的测定结果。7.定量分析结果采用对数值统计分析，利用SPSS软件对测定结果进行分析，显著性水平为P < O. 05。8.混合菌悬液中副溶血性弧菌的定量结果在初始状态下，四种方法对原始混合菌悬液的测定结果与添加值均在同一水平，经统计分析无显著性差异(P > O. 05)，说明在理想的控制条件下DLAP对副溶血性弧菌总量的测定是可行的，见附图la。在实际检测时若不能及时将样品送到实验室，需要对样品进行冷藏或冷冻暂存。将混合菌悬液经过24h冷冻(_18°C)处理后，因V. P不耐低温，可能会导致菌体部分死亡或受伤，四种方法的测定结果均比初始值有下降，且TCBS法和BCVM法的测定结果明显低于MPN法和DLAP法，存在显著性差异(P < O. 05);而DLAP法的测定结果与MPN法一致，说明通过DLAP上层的TSA培养基的温和作用对处于受伤或抑制状态的V. p能恢复菌体活力，可以较好地体现样品中真实活菌的数量，见附图lb。9.冷藏条件下DLAP对牡蛎中副溶血性弧菌的定量结果人工模拟染菌的牡蛎样品经过冷藏贮存后，其中的副溶血性弧菌数量也有减少，但通过上层TSA培养基对菌体的恢复作用，用DLAP法测定的结果与MPN法的测定结果和添加值均无显著性差异(P >0.05)。见附图2。10.不同水产品中副溶血性弧菌的定量结果附表是DLAP法、MPN法、TCBS法和BCVM法对不同的水产品在模拟染菌状态下和人工减菌处理后V. P的测定结果。四种方法对水产品中V. P的测定结果与混合菌悬液的测定结果相似，不同的是，不同的水产品经过减菌处理后，V. P的下降程度比菌悬液的下降程度要低，说明生物基质在一定程度上对V. P有保护作用。无论是在理想的可控状态下还是经过人工减菌处理后，DLAP法的测定结果与MPN法的测定结果均具有良好的一致性，而其他两种平板计数法的测定结果却存在显著性差异。此外，对不同的水产生物基质而言，DLAP法的测定结果也具有一致性和可重复性。附表四种方法对冷冻前后不同水产品中副溶血性弧菌的测定结果
权利要求
1.一种快速测定水产品中副溶血性弧菌总量的方法，包括 (1)从水产品中取部分或全部组织作为检样；取10mL 15mL选择性显色培养基倾注到无菌培养皿中，室温下放置，待完全凝固后，再取10mL 15mL已灭菌的冷至45飞5°C的胰蛋白胨大豆琼脂培养基倾注到选择性显色培养基上，静置凝固，得到双层平板培养基； (2)取上述检样按1g:9mL加入含3wt% 3. 5wt%氯化钠的缓冲蛋白胨水中，制成1:10的样品匀液，将1:10的样品匀液进一步稀释为1:100的样品匀液； (3)根据样品污染程度，取2 3个稀释度的样品匀液，吸取O.1mL 1mL至步骤(1)中的双层平板培养基上，均匀涂布，同时分别取空白稀释液做试验对照；待涂布液体完全浸入培养基中后，将平板翻转，置于32°C 37°C培养箱中培养24h 36h，进行计数与报告，即得副溶血性弧菌总量。
2.根据权利要求1所述的一种快速测定水产品中副溶血性弧菌总量的方法，其特征在于所述步骤(1)中从水产品中取部分或全部组织的具体工艺为鱼类或头足类取表面肉组织；或贝类取全部内容物，包括贝肉和体液；或甲壳类取整个动物或者动物的中心部分，包括肠和腮。
3.根据权利要求2所述的一种快速测定水产品中副溶血性弧菌总量的方法，其特征在于所述贝类中的带壳贝类以及甲壳类先刷洗外壳并甩干表面水分，然后以无菌操作打开外壳，取相应部分。
4.根据权利要求1所述的一种快速测定水产品中副溶血性弧菌总量的方法，其特征在于所述步骤(1)中的胰蛋白胨大豆琼脂培养基中NaCl的添加量为1. 5wt9T3. 5wt%。
5.根据权利要求1所述的一种快速测定水产品中副溶血性弧菌总量的方法，其特征在于所述步骤(2)中制成1:10的样品匀液的具体工艺为用均质器均质1minlmin或将检样放入无菌研钵中磨碎，然后放入灭菌容器内充分振荡。
6.根据权利要求1所述的一种快速测定水产品中副溶血性弧菌总量的方法，其特征在于所述步骤(2)中稀释为1:100的样品匀液的具体工艺为用无菌枪头或吸管吸取1:10的样品匀液lmL，注入盛有9mL无菌生理盐水的试管内，振摇混匀，制得1:100的样品匀液。
7.根据权利要求1所述的一种快速测定水产品中副溶血性弧菌总量的方法，其特征在于所述步骤(3)中每个稀释度做2 3个平皿。
全文摘要
本发明涉及一种快速测定水产品中副溶血性弧菌总量的方法，包括(1)检样制备；(2)双层平板制备；(3)样品稀释；(4)样品检测；(5)细菌培养。本发明具有良好的选择性，试验重复性好，结果准确可靠，操作步骤简单，成本低廉，可以达到快速检测的目的，结果可在1-2d内读取，同时无需昂贵复杂的试验材料，可以避免该菌的计数结果偏低，适用于水产品中副溶血性弧菌的定量监控，在水产品质量安全领域具有无可比拟的优势和广泛的应用前景。
文档编号C12Q1/06GK102888440SQ201210377078
公开日2013年1月23日 申请日期2012年9月28日 优先权日2012年9月28日
发明者王媛, 沈晓盛, 蔡友琼, 顾润润, 于慧娟, 黄宣运 申请人:中国水产科学研究院东海水产研究所