专利名称：AaORA基因启动子及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种基因工程技术领域的基因启动子及其用途，具体是一种 AaORA基因启动子及其用途。
背景技术：
青蒿(Artemisia annua L.)是菊科蒿属的一年生草本植物。青蒿素是从其地上部分分离出的一种含有过氧桥结构的倍半萜内酯化合物，是目前世界上公认的最有效的治疗疟疾药物，特别是对脑型疟疾和抗氯喹疟疾更加有效。目前，世界卫生组织推荐的最有效的治疗痕疾的方法就是青蒿素联合疗法(ACTs)。目前青蒿素的主要来源是从青蒿植株的地上部分提取，然而青蒿中青蒿素的含量非常低(O. 01%-1%)，使得这种药物的大规模商业化生产受到了限制。
AaORA是从青蒿中分离得到的一个AP2-ERF类的转录因子。在青蒿植株中抑制 AaORA可以有效降低青蒿中青蒿素及二氢青蒿酸的含量，表明该基因在青蒿素生物合成途径中具有重要的调节作用。AaORA在叶片发育初期及不同组织部位中的表达谱与青蒿素合成途径中腺毛特异性表达的基因ADS、CYP71AV1和DBR2均具有较高的相似性。因此，该基因的启动子也极有可能在腺毛中特异性表达。由于青蒿素是在青蒿的油性腺毛中合成，因此，克隆得到青蒿腺毛特异性的启动子对青蒿素代谢工程具有较为重要的意义。在青蒿基因工程研究中，目前所采用的启动子大多数是组成性的启动子，例如烟草花叶病毒35S启动子(CaMV35)。这种启动子能够驱动外源基因在所有的组织和器官中表达，极可能会对植物的正常生长造成一定的负担和危害。由于腺毛特异表达的启动子对植物的腺毛系统进行遗传操作，不会对植物的生长发育造成危害。因此，克隆AaORA基因的启动子对利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种具有重要意义。克隆其启动子将为研究AaORA 基因的表达调控和分析启动子上的顺式作用元件奠定基础。经对现有技术文献的检索发现，尚未发现有与本发明的AaORA基因启动子序列相关的报道。发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种AaORA基因启动子及其用途。本发明提供的基因启动子能引导基因在植物腺毛中特异表达，在利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种过程中，本发明提供的启动子能够特异性地在腺毛组织启动并高效表达外源基因，而且不会对植物的生长发育造成危害。
本发明是通过以下技术方案实现的，
第一方面，本发明涉及一种AaORA基因启动子，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。
第二方面，本发明还涉及前述AaORA基因启动子在利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中的用途。
优选的，所述代谢产物为青蒿素。
本发明涉及的AaORA基因启动子的获得步骤具体如下步骤一，培养青蒿无菌苗；步骤二，基因组DNA步移(Genomic DNA Walking)法克隆启动子基因组序列；步骤三，分析启动子上的顺式作用元件，确定AaORA基因启动子的类型；步骤四，AaORA基因启动子连入1391Z载体；步骤五，将构建好的载体1391Z_Aa0RA载体转化根癌农杆菌；步骤六，将带有1391Z_Aa0RA载体的根癌农杆菌转化青蒿；步骤七，PCR检测转基因植株；步骤八，启动子所引导的gus报告基因在植株中的表达部位的确定。本发明具有如下有益效果本发明提供的AaORA基因启动子，可特异性地在腺毛组织启动并高效表达外源基因，并且不会对植物的生长发育造成危害，能广泛应用于利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中。
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显图I为AaORA基因启动子区域的顺式作用元件结构图；图2为转基因青蒿植株的PCR阳性检测结果图；图3为利用AaORA基因启动子与gus基因融合的载体1391Z_Aa0RA转化青蒿后， 所获得的转基因青蒿中的GUS组织染色图。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册见 New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press 的 1989 年版中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。本实施例涉及的根癌农杆菌EHA105已在《黄亚丽，蒋细良，田云龙，郭萍，朱昌雄；根癌农杆菌介导的哈茨木霉菌遗传转化的研究，中国生物工程杂志，2008，28 (3):38-43》文献中公开。根癌农杆菌EHA105，质粒pCAMBIA1391Z可通过公开市售的商业渠道取得，如可以从澳大利亚CAMBIA公司购得，菌株编号为Gambarl。实施例本实施例涉及AaORA基因启动子的获得,具体包括如下步骤步骤一，培养青蒿无菌苗青蒿种子用体积分数为75%的乙醇浸泡Imin,再用20%(w/v)的NaClO浸泡20min后，无菌水冲洗3次 4次，用无菌吸水纸吸干表面水分，接种于无激素的MS固体培养基上，25°C、16h/8h (light/dark)光照培养，14天后即可获得青蒿无菌苗；
步骤二，基因组DNA步移(Genomic DNA Walking)法克隆启动子基因组序列本实施例采用基因组DNA步移分离AaORA基因5’侧翼序列，基因组DNA步移的方法参照基因组WalkerTM Universal Kit (Clontech, 638904)的说明书，具体步骤如下①基因组因组酶切采用3种平末端的限制性内切酶DraI、EcoRV和StuI分别对青蒿基因组DNA进行酶切，反应体系如表I所示，将反应体系轻轻地混匀，于37°C水浴中反应过夜；表I限制性内切酶体系
权利要求
1.一种AaORA基因启动子，其特征在于，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO. I所/Jn ο
2.一种如权利要求I所述的AaORA基因启动子在利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中的用途。
3.如权利要求2所述的AaORA基因启动子在利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中的用途，其特征在于，所述代谢产物为青蒿素。
全文摘要
本发明涉及一种AaORA基因启动子，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；同时本发明还涉及前述AaORA基因启动子在利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中的用途。本发明提供的启动子能引导基因在植物腺毛中特异表达，由于腺毛特异表达的启动子对植物的腺毛系统进行遗传操作，不会对植物的生长发育造成危害，本发明对利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种具有重要意义。
文档编号C12N15/113GK102925441SQ201210384850
公开日2013年2月13日 申请日期2012年10月11日 优先权日2012年10月11日
发明者唐克轩, 陆续, 张芳源, 沈乾, 张凌, 江伟民, 吕宗友 申请人:上海交通大学