专利名称：一种阳离子脂质载体及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新型的非病毒基因给药载体，具体涉及到一种新型阳离子脂质载体及其制备方法。本发明属于生物医药技术领域，
背景技术：
上个世纪90年代，人类开展了规模宏大而意义非凡的人类基因组计划，随着整个计划的完成，人类开始了自己的基因时代。人类对基因的进一步认识也开启了医药研究的生物时代，而基因治疗自然就成为了国内外生物医药要研究的热点领域之一。基因治疗与 传统的疗法相对有着独特的优势，尤其是对一些传统医药无法治愈的遗传性或是后天疾病，如一些恶性肿瘤或是先天性免疫性疾病。在基因治疗的发展中有一个关键问题就是需要一种安全，高效的基因给药载体。目前应用于基因输送的运载系统有很多，主要分为病毒和非病毒转运体系。病毒性载体具有转染效率高的特点，但是病毒性载体具有很强的免疫原性反应，缺乏靶向性，具有与宿主细胞潜在的整合的危险。在病毒性载体的发展中分别有三次医疗事故对病毒性载体的发展起到了很大的影响1999年在美国宾夕法尼亚大学医学院发生的重组腺病毒“Jesse Gelsinger”事件；2000年在法国发生的逆转录病毒诱导的白血病事件；2003年发生了第二例白血病诱发事件。这些事件严重打击了基因治疗的研究，同时也促使了研究人员对如何研发出安全有效的基因载体提出了更高的要求。在这样的背景下，非病毒基因载体的研究逐渐成为研究的热点。目前非病毒转运系统主要包括阳离子脂质体、聚合物、纳米粒、树突结构和透膜性肽等。其中阳离子载体中的阳离子脂质载体因其独特的结构特点一直成为科学界的研究热点。阳离子类物质的报道最早见于上世纪70年代，该类物质能表现出很好的油水两性。在上个世纪90年代阳离子脂质载体的发展就取得了很好的发展，通过对多种哺乳类生物细胞的研究发现阳离子载体能够有效的转入多种基因，而使细胞成功的表达相对应的蛋白。阳离子类载体是由阳离子头部，脂肪族尾部及连接臂组成的两性物质。头部通常以多肽、糖脂等阳离子为主，尾部通常为脂肪族长链，连接臂主要以在体内能降解的二硫键或酰胺键为主。该类化合物主要是通过静电与DNA/RNA相互作用，将DNA/RNA压缩聚合。以内吞的形式进入细胞，形成的核内体，由于环境pH的变化而使核内体的结构由膜状结构变为六面体结构，而释放DNA/RNA产生作用。阳离子脂质载体具有较高的转染效率，其原因在于首先，阳离子脂质载体作为一种PH敏感型载体，具有质子海绵作用与亲水-疏水型构型变化作用，载体可以通过这两种方式有效的释放包载物。阳离子脂质载体的头部由于自身的结构特点多具有两个不同的PKa值，一个高于平均生理pH值，另外一个低于平均生理pH值。因此，阳离子脂质体从胞外进入到胞内形成核内体的过程，就是经历生理PH值从高到低的过程(细胞中内吞体与溶酶体及细胞核周围的pH值约为4. 5左右)，而这种pH的变化势必会引起如赖氨酸或是组氨酸等易于质子化的基团质子化，从而带来核内体膜的不稳定，使核内体膜的形态从在近中性的PH环境下的亲水结构层状结构变为在酸性环境下的疏水六面体结构，从而释放出包载物。对于核内体膜会在不同pH条件下发生形态变化的直接证据，则是来源于流感病毒中的一种蛋白。该种蛋白被称之为融合蛋白(fusogenic protein),其基本结构融合肽(fusogenic peptide),来源于流感病毒血凝素蛋白。融合蛋白序列是一种短的、两亲性序列，在酸性PH环境中，该序列会发生构型变化，从而使病毒逃逸出核内体，这也是流感病毒能够进入人体细胞并能成功自我复制，感染细胞的原因所在。有研究表明，与常用转染试剂Lipofectamine 2000相比，在同样的实验条件下，融合蛋白/融合肽能够使mRAN的沉默效率提高约3. 5倍(Oliveira, S et al. IntJ Phar，2007，331 (2) ,211-2 14)。其次，载体中若是存在氧化还原势的结构(如二硫键)，同样能够有效的促使siRNA从核内体中释放。之所以含有氧化还原势的载体结构能够有效的释放包载物，是因为在包载物进入细胞后形成的核内体中存在着谷胱甘肽(glutathione, GSH)与硫氧还原蛋白(thioredoxin)等物质[D. Jere, et al. BiomedMater, 2009，4 (2)，025020.]。这些酶能够在酸性环境中有效的与载体中的相关基团发生作用，造成Iipoplex结构的崩解，从而引起核内体膜的不稳定而释放出包载物。有研究表明含有二硫键结构的D0GSDS0及CHDTAEA，在实验条件一致的情况下，与不含类似结构的转染试剂相比，其转染效率能够提高50倍[F. Tang, et al. BioconjugateChem, 1999，10 (5) ,791-796]。再次，载体结构中其它一些体内已知可降解键，如:酯键，同样可以起到崩解Iipoplex结构的作用，从而促进包载物的释放[R. H. Kallet, et al. Am.J. Respir. Crit. Care Med, 2000, 161(4 pt I)，1149-1153]。此外，阳离子脂质载体与被包载物所形成的复合物的大小，对包载物的转染效率有着很大影响，尤其是在体内转运时。然而，对于到底多大的复合物对于转染是适合的，却没有明确的定义。早期的研究表明，大小为200-2000nm复合物都能够有效的转染[P. C. Ross, et al, Gene Ther, 1999，6，651-659]。但是随后的研究表明，小颗粒复合物(<200nm)表现出更好的转染效率[N. Yagi, et al, Cancer Res, 2009，69 (16)，6531-6538]。对于这个问题目前较为一致的看法就是复合物易于聚集，使其直径往往>200nm;复合物进入细胞的异质内吞作用是与其大小相关的；直径〈lOOnm的颗粒利于在毛细血管中转运。所以，复合物的大小较为一致的看法是处于100 - 300nm之间具有较好的转染效率。阳离子脂质载体之所以能够包载核酸类物质，就是因为两者之间的静电作用。但是，正是因为阳离子脂质载体带有正电荷，同样使其在体内转运中具有不稳定性，从而限制了阳离子脂质载体的应用。具体包括以下几点1.由于阳离子脂质载体形成的阳离子脂质载体表面都带有正电荷，而在体循环中这些表面的正电荷的阳离子脂质载体势必会与血液中的蛋白质或是内皮组织相互作用，从而造成其在体循环中的快速移动产生脱靶效应。2.正电荷复合物通过与血液中的蛋白作用，引起血管栓塞。3.阳离子脂质载体往往会出现对siRNA包载不完全的现象，从而致使siRNA被血清蛋白降解。正是由于上述原因，在使用阳离子脂质载体时，尤其是在体循环中，往往与多种其它脂质体(被称为辅助脂质体)按照一定摩尔比混合使用，使其成为中性脂质体，而这种中性脂质体往往具有很好的转染效果。目前，常用的辅助脂质体有N-[l-(2, 3-dioleyloxy) propyl] -N, N, N-trimethylammoniumchloride (DOTMA) ； I,2-dioley Ioxy-3-trimethylammonium propane (DOTAP)；cetyItrimethylammonium bromide (CTAB) ；dioctadecylamidoglycylapermin(DOGS)；3 β -[N-(N1 ，N' -dimethyl aminoethane)-carbamoyl]cholesterol(DC-Chol) ;l，2_dioleoyl-sn-glycerol-3-phospho ethanolamine (DOPE) ；cholesterol (Chol)等等。
之所以加入这些脂质体，除了改善复合物表面的电荷特性外，还有其它作用，诸如D0PE及类似磷脂类物质可以稳定复合物、增加复合物与细胞膜的相互作用、促进包载物的释放；胆固醇类物质具有稳定体循环时复合物的作用，有研究表明胆固醇可能是通过某种方式减少血清中蛋白与复合物的作用[R. Banerjee, et al, J. Med.Chem, 1999，42 (21)，4292-4299]。这也是众多文献及专利中，多应用辅助脂质体的原因所在。本发明的意义在于提供了一种新型阳离子脂质载体的制备，该载体具有制备简单，易于修饰，细胞毒性低，转染效率优于商用转染试剂的优点。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种非病毒基因给药载体；本发明的目的之二是提供所述的载体的制备方法；本发明的目的之三是提供所述的载体在制备细胞转染试剂中的应用。为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段本发明设计了一种以氨基酸为骨架的两亲性阳离子脂质体，本发明的一种阳离子脂质载体，其特征在于所述阳离子脂质载体具有通式VI的结构
权利要求
1. 一种阳离子脂质载体，其特征在于所述阳离子脂质载体具有通式VI的结构
2.根据权利要求I所述的阳离子脂质载体，其特征在于R为二硫键、硫原子、氧原子或是碳原子。
3.根据权利要求I所述的阳离子脂质载体，其特征在于所述的3A或A4的结构如式XIV 或XV，其中n=0 25，m=0 25 ；
4.根据权利要求I所述的阳离子脂质载体，其特征在于所述的链状疏水性分子为饱和或是不饱和性脂肪族烷烃、胆固醇或如式XI所示的疏水性分子
5.根据权利要求4所述的阳离子脂质载体，其特征在于所述的饱和脂肪族烷烃如式 VII所示，其中η=5 25 ；所述的不饱和脂肪族烷烃如式VIII所示，其中η=5 25，m=5 25 ;或所述的不饱和脂肪族烧烃如式IX所示，其中n=5 25，m=5 25 ;或所述的不饱和脂肪族烧烃如式X所示，其中n=5 25 ；在式 VII，VIII，IX，X 中 X 为-OH、-NH2, -Cl 或-Br ；
6.一种制备权利要求I所述的阳离子脂质载体的方法，其特征在于包括以下步骤 A.使用式I的结构与Boc2O反应，得到式II:
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于1A或A2的结构式如式XII或式XIII所示， 其中n=0 25, m=0 25 ；
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于R为二硫键、硫原子、氧原子或是碳原子。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述的3A或A4的结构如式XIV或XV， 其中n=0 25, m=0 25 ；
10.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述的链状疏水性分子为饱和或是不饱和性脂肪族烷烃、胆固醇或如式XI所示的疏水性分子
11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于所述的饱和脂肪族烷烃如式VII所示，其中n=5 25 ；所述的不饱和脂肪族烷烃如式VIII所示，其中n=5 25，m=5 25 ;或所述的不饱和脂肪族烧烃如式IX所示，其中n=5 25，m=5 25 ;或所述的不饱和脂肪族烧烃如式X所示，其中n=5 25 ；在式 VII，VIII, IX，X 中 X 为-0H、-NH2、-C1 或-Br ；
12.权利要求1-5任一项所述的阳离子脂质载体在制备细胞转染制剂中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种阳离子脂质载体及其制备方法和应用。本发明所提供的新型阳离子脂质载体化合物具有通式VI的结构，其中，3A及A4为亲水性头部，3A或A4为由一个或是多个相同或不同的氨基酸组成的亲水性分子，3A与A4相同或不同；R为头部与尾部的链接臂，为链状或支链结构；3B及B4为疏水性尾部，3B或B4为链状疏水性分子，3B与B4相同或不同。本发明的新型阳离子脂质载体化合物，具有结构简单、合成方便等特点。此外该化合物具有毒性低、转染效率高的特点，并且避免了合成中的繁琐，转染过程中也无需使用其他类型的辅助脂质体，易于操作和使用，因此，本发明的新型阳离子脂质载体具有潜在的商用转染试剂开发前景。
文档编号C12N15/87GK102925487SQ20121038504
公开日2013年2月13日 申请日期2012年10月11日 优先权日2012年10月11日
发明者杨振军, 郑宜, 李雅婷, 武芸, 张礼和 申请人:北京大学