专利名称：一种添加扩增内标的食品中猪肉或鸡肉成分Taqman探针荧光定量PCR快速检测方法
技术领域：
本发明属于食品安全检测领域，涉及的是食品中动物源性成分的快速检测，具体涉及一种添加扩增内标的食品中猪肉、鸡肉成分Taqman探针荧光定量PCR快速检测方法。
背景技术：
肉制品掺假是公众关注的焦点问题之一。目前，肉类掺假主要表现在不法企业使用相对廉价的猪肉、鸡肉等肉类，通过多种形式的深加工，冒充牛肉制品进行销售，以谋取不当利益。掺假行为不仅侵犯了消费者的合法权益，而且极大打击了公众对于我国食品质量安全状况的信心。因此，对于掺假牛肉制品中较常出现的猪肉和鸡肉，建立科学、准确快速的检测方法已十分必要。以聚合酶链反应(PCR)为基础的技术已逐步成为了食品中肉类种属鉴定的核心方 法。许多学者根据不同物种基因序列的差异位点设计特异性引物，利用PCR反应实现食品中特征基因片段的指数级扩增，继而通过电泳检测鉴别食品中可能的物种来源。近年来，实时荧光PCR技术的飞速发展大大提高了食品中物种鉴别的效率和灵敏度，并使得肉类含量的定量溯源成为可能。在目标基因选择方面，动物细胞核基因组DNA序列具有高度的物种特异性，能够保证检测过程中不会出现物种间非特异性扩增而导致的交叉干扰；此外，目前对食品中动物源性的荧光定量PCR检测研究均缺乏阳性扩增内标(IAC)对反应体系进行监控，无法避免检测假阴性结果的产生，导致检测结果不准确。目前国际上以细胞核基因DNA序列为目标基因，并添加有扩增内标的食品中动物源性荧光定量PCR检测方法尚未见报道。因此，建立添加有扩增内标的食品中猪肉和鸡肉的荧光定量PCR快速检测方法将对食品安全的快速监管具有重要的创新性实践意义。
发明内容
本发明从猪和鸡细胞核基因中的物种特异性序列出发，探索并完善了快速检测食品中猪肉和鸡肉的Taqman荧光定量PCR检测方法。一种添加扩增内标的食品中猪肉和鸡肉成分Taqman探针荧光定量PCR快速检测方法，包括以下步骤(1)应用根据猪的beta actin基因及鸡的transforming growthfactor基因设计扩增引物和Taqman探针，分别使用荧光基团FAM、HEX作为探针的发光基团；(2)设计构建含有阳性扩增内标DNA的重组质粒并设计相应探针；(3)以含有待检DNA模板、含有阳性扩增内标DNA的重组质粒，阳性扩增内标DNA的Taqman探针，以及设计合成的猪beta actin基因扩增引物和Taqman探针，或鸡transforming growth factor基因扩增引物和Taqman探针的荧光定量PCR反应体系进行荧光定量PCR反应；(4)应用ABI7500Software SDS1. 4对实验结果进行分析处理，以Ct值小于36的扩增作为检测的阳性结果；其中步骤(2)所述的设计构建含有阳性扩增内标DNA的重组质粒的方法为使用DNA随机生成软件产生一段DNA序列，使其在NCBI中Blast后没有出现与之同源的DNA片段，在这段随机DNA序列上、下游分别连接上目标物种的扩增引物序列，从而形成针对猪检测体系和鸡检测体系长度分别为98bp和94bp的阳性扩增内标DNA序列；将这两段扩增内标DNA序列委托人工基因合成，合成片段分别连接载体pGH，转化感受态细胞DH5 α，小量提取并测序验证，得到分别针对猪肉和鸡肉检测体系的含有阳性扩增内标DNA的重组质粒。本发明根据Genbank中猪的beta actin基因(登录号为DQ452569. I)和鸡的transforming growth factor基因(登录号为AY685072. I)设计了用于突光定量PCR检测的扩增引物和Taqman探针，分别使用荧光基团FAM、HEX作为探针的发光基团。引物与探针序列见表I。表I荧光定量PCR引物与探针序列
权利要求
1.一种添加扩增内标的食品中猪肉或鸡肉成分Taqman探针荧光定量PCR快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤(I)应用根据猪的beta actin基因或鸡的transforminggrowth factor基因设计扩增引物和Taqman探针,分别使用突光基团FAM、HEX作为探针的发光基团；(2)设计构建含有阳性扩增内标DNA的重组质粒并设计相应探针；(3)以含有待检DNA模板，含有阳性扩增内标DNA的重组质粒，阳性扩增内标DNA的Taqman探针，以及设计合成的猪beta actin基因扩增引物和Taqman探针，或鸡transforming growth factor基因扩增引物和Taqman探针的荧光定量PCR反应体系进行荧光定量PCR反应；(4)应用ABI 7500SoftwareSDSl. 4对实验结果进行分析处理，以Ct值小于36的扩增作为检测的阳性结果；其中步骤(2)所述的设计构建含有阳性扩增内标DNA的重组质粒的方法为使用DNA随机生成软件产生一段DNA序列，使其在NCBI中Blast后没有出现与之同源的DNA片段，在这段随机DNA序列上、下游分别连接上目标物种的扩增引物序列，从而形成针对猪检测体系和鸡检测体系长度分别为98bp和94bp的阳性扩增内标DNA序列；将这两段扩增内标DNA序列委托人工基因合成，合成片段分别连接载体pGH，转化感受态细胞DH5 α，小量提取并测序验证，得到分别针对猪肉和鸡肉检测体系的含有阳性扩增内标DNA的重组质粒。
2.根据权利要求I所述的一种添加有扩增内标的用于检测食品中猪肉或鸡肉成分的Taqman探针荧光定量PCR法，其特征在于 猪beta actin基因扩增上游引物为SEQ ID NO. 1，下游引物为SEQ ID NO. 2，探针为 5’ -FAM-ACAGTAGGTCTGACGTGACTCCCCGA-BHQ 1-3’ ； 鸡transforming growth factor基因扩增上游引物为SEQ ID NO. 3,下游引物为SEQID NO. 4，探针为 5’ -HEX-CTGCCAAGCTCTGCCACTCCTCTG-BHQ 1-3’ ； 针对猪检测体系的阳性扩增内标DNA序列SEQ ID NO. 5 ； 针对鸡检测体系的阳性扩增内标DNA序列SEQ ID NO. 6 ； 阳性扩增内标 DNA 的 Taqman 探针为5’ -CY5-ATGACCAAAGCCTCCGGGCGTAG-BHQ3-3’。
3.根据权利要求I所述的一种添加扩增内标的食品中猪肉或鸡肉成分Taqman探针荧光定量PCR快速检测方法，其特征是，所述荧光定量PCR反应体系为20 μ L反应体系包含模板DNA和含有阳性扩增内标DNA的重组质粒各2 μ L，Premix Ex Taq 10 μ L，靶基因探针溶液和扩增内标探针溶液各O. 4μ M，ROX校正溶液O. 4 μ L，猪和鸡扩增体系中引物浓度分别为 O. 2 μ M 和 O. 6μΜ。
4.根据权利要求I所述的一种添加扩增内标的食品中猪肉或鸡肉成分Taqman探针荧光定量PCR快速检测方法，其特征在于，所述荧光定量PCR反应条件为95°C 30s，40个循环的 950C 5s 和 600C 34s。
5.权利要求I所述的一种添加扩增内标的食品中猪肉、鸡肉成分Taqman探针荧光定量PCR快速检测方法在食品质量控制和质量安全检测中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种添加扩增内标的食品中猪肉或鸡肉成分Taqman探针荧光定量PCR快速检测方法。具体方法为分别基于动物细胞核基因设计引物和探针；人工合成一段竞争型扩增内标及相应的探针，建立内标荧光定量PCR体系，应用ABI 7500 Software SDS 1.4对实验结果进行分析处理，以Ct值小于36的扩增作为检测的阳性结果。本发明检测方法具有良好的针对目标物种的特异性的同时通过实时监控PCR反应以避免假阴性检测结果的产生，为食品中动物源性成分鉴定探索了新的途径，具有准确稳定、操作方便等有益效果。
文档编号C12Q1/68GK102864243SQ201210390500
公开日2013年1月9日 申请日期2012年10月15日 优先权日2012年10月15日
发明者黄明, 何玮玲, 杨静, 徐幸莲, 周光宏 申请人:南京农业大学