专利名称：一种猪环曲病毒rt-pcr检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及猪的一种病毒抗原检测试剂盒，具体说是一种猪环曲病毒核酸RT-PCR快速诊断试剂盒及其检测方法。
背景技术：
猪环曲病毒(Porcine Torovirus,PToV)为冠状病毒科,环曲病毒属成员。基因组为单股正链RNA，大小约为25-30kb。根据国际病毒分类委员会确认环曲病毒属主要有马环曲病毒(Equine Torovirus,EToV)、猪环曲病毒、牛环曲病毒(Bovine Torovirus,BToV)和人环曲病毒(Human Torovirus,HToV)。有报道指出，环曲病毒在全世界范围内广泛分布,从1987年首次报道猪环曲病毒以来，在荷兰、加拿大、南非、美国、匈牙利和英格兰等国家相继被报道。目前，普遍认为环曲病毒与腹泻相关，但在其病毒结构和功能、发病机理、致病性等 方面还存在许多问题尚未得到解决。猪环曲病毒感染主要引起一些亚临床症状，病毒在粪便中存在的时间相对较短，目前还无法在培养的组织细胞中生长繁殖。因此，研发一种针对猪环曲病毒的快速准确RT-PCR检测试剂盒，对于我国猪群中环曲病毒分子流行病学调查和其他相关研究意义重大。
发明内容
本发明的目的在于提供一种猪环曲病毒核酸RT-PCR检测试剂盒及其检测方法。根据猪环曲病毒保守的S蛋白区域，设计特异性病毒核酸引物，用RT-PCR的方法，对猪群中猪环曲病毒的感染情况进行监测。该试剂盒所用时间相对较少，灵敏度较高，适用于猪环曲病毒病原的快速诊断，可为猪环曲病毒的分子流行病学调查及相关研究提供技术支持。为了达到以上目的，本发明采取以下技术方案一种猪环曲病毒RT-PCR检测试剂盒，按照每个试剂盒检测20个样品计，每次检测样品时设阳性、阴性对照，试剂盒组成包括阳性对照模板对猪环曲病毒的阳性样品抽提RNA，逆转录后获得的cDNA，共20ul,每次 Iul ；阴性对照样品SPF猪粪便样品和PBS按SPF猪粪便样品的重量PBS的体积=
O.5 I. O I 加入 PBS 混匀，3000r/min 离心 15min，取上清液抽提RNA，逆转录后获得的cDNA，共20ul，每次用Iul ；上游引物Pl :5’ -ACCCCTGCCTGAGGTTTCYTT-3’，下游引物 P2 :5’-AGCACGACGTTGTCTRCGTGT-3’，上游引物 Pl 和下游引物 P2 浓度均为 10pmol/ul，各 30ul，每个样品各用O. 5ul ；2XTaq PCR Master Mix :300ul,每个样品用 IOul ；ddH20 :200ul,每个样品用 8ul。所述的猪环曲病毒RT-PCR检测试剂盒的检测方法，反应体系2XTaq PCR MasterMix 10ul、ddH20 8ul、上游引物PU下游引物P2各O. 5ul、反转录模板Iul ；PCR反应条件950C lmin, 95°C 5s,50°C 10s、72°C 30s 反应 30 个循环，最后 72°C延伸 3min。本发明与现有技术相比有以下优点灵敏度较高，最低可以检测IOpg病毒核酸；检测时间短，可用于大批样品的检测。
图I是目的基因PCR扩增的结果，其中M marker DL2000 ；1 :PCR扩增产物；2 :阴性对照； 图2M marker DL2000 ；I :猪环曲病毒；2 :猪崎病毒；3 :猪伪狂大病毒；4 :猪传染性胃肠炎病毒；5 :猪流行性腹泻病毒；6 :A群猪轮状病毒；7 :猪瘟病毒；8 :猪沙门氏菌；9 猪大肠杆菌；10 :阴性对照；图3 是敏感性实验PCR 结果，其中 M :marker DLlOOO ；1 100ng ；2 10ng ；3 lng ；4 IOOpg ；5 10pg ；6 lpg ；7 :H20。
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。实施例I(I)设计病毒特异引物根据猪环曲病毒S基因序列设计一对特异PCR引物，上游引物Pl 5’ -ACCCCTGCCTGAGGTTTCYTT-3’，下游引物 P2 :5’ -AGCACGACGTTGTCTRCGTGT-3’，目的片段扩增大小为451bp。(2)病毒总RNA提取采集腹泻仔猪粪便，取O. 5-lg粪渣加入Iml PBS混匀，3000r/min离心15min，取上清液O. 3ml进行RNA提取。首先在上清液中加入750ul trizol变性液，振摇直至变粘稠，室温放置5min ；4°C, 12000r/min离心5min ;取上清液加入1/5体积(约O. 2ml)氯仿，剧烈振荡15s,室温静置5min ；4°C, 12000r/min离心15min ;取上层水相,加入等体积(约600ul)异丙醇，室温静置IOmin ；4°C, 12000r/min离心lOmin，沉淀RNA ;小心弃尽上清，用冰冷的75%乙醇Iml洗漆沉淀,混悬后，4°C, 12000r/min离心5min。小心弃尽上清；超净台内风干RNA沉淀，直至没有酒精气味；用无Rnase的灭菌双蒸水20ul溶解沉淀，4°C保存备用。(3)逆转录，反应体系5XBuffer 2ul、RT Enzyme Mix 0. 5ul、Oligo dTPrime (50uM) 0. 5ul> Random 6mers (IOOuM) 0. 5ul> Total RNA 3ul、RNase Free ddH202. 5ul、dNTP Iul ;反应条件37°C 20min、85°C 2min。(4)PCR 反应体系2XTap PCR Master Mix 10ul、ddH20 8ul、上下游引物 PUP2(浓度为lOpmol/ul)各0. 5ul、反转录模板lul。PCR :反应条件95°C lmin, 95 °C 5s、50°C 10s、72°C 30s (反应 30 个循环)，最后72°C延伸3min。I %琼脂糖凝胶电泳检查扩增产物，结果(见图I)显示约在450bp出现特异性扩增条带。(5)特异性实验用以上方法对猪伪狂犬病毒(Porcine pseudorabies virus)、猪嵴病毒(Porcine Kobuvirus)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis ofswine virus, TGEV)、猪流行性腹湾病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)、A 群猪轮状病毒(Group A Porcine Rotavirus A, PRoV A)、猪痕病毒(Classical swine fevervirus,CSFV)、沙门氏菌(Stptococcus suisre)和大肠杆菌(Escherichia Coli)阳性模板板进行PCR扩增，验证本方法特异性。结果(见图2)显示本方法能够特异性的扩增猪环曲病毒基因，而其他阳性模板均未见扩增产物出现。(6)敏感性实验将提取的病毒核酸用紫外分析仪测定浓度后，用双蒸水做10倍倍比稀释，取每个稀释度的病毒模板按上述体系及方法进行PCR反应，验证本方法的敏感性。结果(见图3)显示本方法可以有效检测出猪环曲病毒最低核酸浓度为10pg。实施例2试剂盒的组成按照每个试剂盒检测20个样品计，每次检测样品时设阳性、阴性对照，试剂盒组成包括 阳性对照模板猪环曲病毒阳性样品抽提RNA，逆转录后获得的cDNA，共20ul，每次 Iul ；阴性对照样品SPF猪粪便样品和PBS按SPF猪粪便样品的重量PBS的体积=
0.5 I. O I加入PBS混匀，3000r/min离心15min，取上清液抽提RNA，逆转录后获得的cDNA，共 20ul，每次用 Iul ；上游引物Pl和下游引物P2浓度均为10pmol/ul，各30ul，每个样品各用0. 5ul ；2XTaq PCR Master Mix :300ul,每个样品用 IOul ；ddH20 :200ul，每个样品用 8ul ；2.使用方法反应体系2XTaqPCR Master Mix IOuUddH2O 8ul、上游引物P1、下游引物P2各
0.5ul、反转录模板Iul ；PCR 反应条件95°C lmin，95°C 5s、50°C 10s、72°C 30s (反应 30 个循环)，最后 72°C延伸3min。应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
权利要求
1.一种猪环曲病毒RT-PCR检测试剂盒，其特征在干，按照每个试剂盒检测20个样品计，毎次检测样品时设阳性、阴性对照，试剂盒组成包括 阳性对照模板对猪环曲病毒的阳性样品抽提RNA，逆转录后获得的cDNA，共20ul，每次 Iul ； 阴性对照样品=SPF猪粪便样品和PBS按SPF猪粪便样品的重量PBS的体积=0.5 1.0 I 加入 PBS 混匀，3000r/min 离心 15min, 取上清液抽提RNA，逆转录后获得的cDNA，共20ul，每次用Iul ； 上游引物 Pl :5’ -ACCCCTGCCTGAGGTTTCYTT-3’，下游引物 P2 :5’-AGCACGACGITGTCTRCGTGT-3’，上游引物 Pl 和下游引物 P2 浓度均为 IOpmo 1/ul，各 30ul，甸个样品各用0. 5ul ； 2 X Taq PCR Master Mix :300ul，每个样品用 IOul ；ddH20 :200ul,姆个样品用 8ul。
2.根据权利要求I所述的猪环曲病毒RT-PCR检测试剂盒的检测方法，其特征在于，反应体系2XTaq PCR Master Mix 10ul、ddH20 8ul、上游引物 PI、下游引物 P2 各 0. 5ul、反转录模板Iul ;PCR反应条件95°C lmin，95°C 5s, 50 °C 10s、72°C 30s反应30个循环，最后72°C 延伸 3min。
全文摘要
本发明公开了一种猪环曲病毒RT-PCR检测试剂盒及其检测方法，试剂盒组成包括阳性对照模板对猪环曲病毒的阳性样品抽提RNA，逆转录后获得的cDNA，共20ul，每次1ul；阴性对照样品SPF猪粪便样品和PBS按SPF猪粪便样品的重量∶PBS的体积＝0.5～1.0∶1加入PBS混匀，3000r/min离心15min，取上清液抽提RNA，逆转录后获得的cDNA，共20ul，每次用1ul；上游引物P1和下游引物P2浓度均为10pmol/ul，各30ul，每个样品各用0.5ul；2×Taq PCR Master Mix300ul，每个样品用10ul；ddH2O200ul，每个样品用8ul。本发明与现有技术相比有以下优点灵敏度较高，最低可以检测10pg病毒核酸；检测时间短，可用于大批样品的检测。
文档编号C12Q1/68GK102952898SQ201210398440
公开日2013年3月6日 申请日期2012年10月10日 优先权日2012年10月10日
发明者朱玲, 徐志文, 周璐 申请人:四川农业大学