专利名称：一种预测前列腺癌易感性的试剂盒和方法
技术领域：
本发明涉及一种预测前列腺癌易感性的试剂盒和方法，更具体的说是通过测定与前列腺癌相关基因GPRC6A的内含子上rsl606365位点多态性预测受试者对于前列腺癌的易感性，该方法可用于疾病的辅助诊断和新药开发，属于生物技术领域。
背景技术：
前列腺癌(prostate cancer, PCa)是发生在男性生殖系统中最常见的恶性肿瘤。美国在对1975-2006癌症发病率进行统计后，估算2010年PCa新发病例为217，730例，位居男性好发肿瘤中第一位，PCa的死亡人数估计为32，050，在男性肿瘤死亡率中位居第二。年龄是PCa的一个重要风险因素，年龄45岁以下的基本很少发病，随年龄的增长而增加。美国癌症协会统计，40岁以下的男性PCa发病率为1/8499,40-59岁男性中为1/38，60_69岁男性中为1/15，70岁以上男性中则为1/8。随着我们国家人口老龄化，PCa的发病率在我国正逐年上升，上海标化发病率从1973 1975年的1. 8/10万上升至1997 1999年的
5.5/10万，贵州省南部地区部分县市PCa的发病率已从1994 1998年的1. 72/10万上升到2004 2008年的4. 28/10万，成为威胁我国男性健康的公共问题。目前进行PCa遗传病因研究，多采用大规模全基因组关联研究和小样本多人群中的验证，并且GWAS鉴定的多个PCa易感SNPs已在多个不同人群中被复制确定，证明了 SNPs作为基因组标志的关联分析方 法在PCa遗传研究中的有效性。SNPs是指染色体基因组水平上单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性，在人群中的频率需>1%，SNPs是双等位基因标记，这种单碱基变化中有70. 1%为同型碱基之间的转换如G/A或T/C，29. 1%为发生在嘌呤和嘧啶之间的颠换。SNPs包含了已知多态性的80-90%，是最常见的遗传变异。由于生存的选择压力导致SNP在单一基因和整个基因组中的分布呈不均匀性。SNPs在基因非编码区的数量是编码区的4倍，总数可达3百万个。SNPs以其密度高(平均每Ikb就有I个)、代表性强(位于基因内部的SNPs可能直接影响蛋白质结构或表达水平)、遗传稳定性好(同微卫星多态性比较而言)、易于自动化分析(因SNPs在人群中为双等位基因标记，可简单以“+ / 一或1/0”直接分型)等特点成为很好的遗传标志。GPRC6A (G 蛋白偶联受体 C 家族 6 组 A 亚型)(G protein-coupledreceptor, familyC, group6, memberA, GPRC6A)基因是 Wellendorph P 等在 2004 年发现提出的，编码G蛋白偶联受体C家族6组A成员，G蛋白偶联受体(G protein-coupledreceptors, GPCRs)是一类有7次跨膜区域，是人类基因组上由约近千个基因编码的大的受体家族，在许多生理病理进程包括发育、造血、血管生成、炎症、精神障碍、代谢疾病及病毒感染等中起重要作用。研究表明许多GPCRs和他们的配体参与肿瘤发生发展，如内皮缩血管肽类通过与GPCRs相互作用介导组织分化、发育和细胞增殖，通过增强细胞增殖抑制凋亡和调节基质成分在PCa和其他肿瘤中起重要作用。许多趋化因子受体如CXCR4、CXCR2、CCR7等在许多肿瘤表达上调，在肿瘤生长、侵袭和转移中起重要作用。许多被称为内皮分化基因家族的GPCRs是溶血磷脂酸或鞘氨醇-1-磷酸盐的受体，调节细胞的增殖、迁移和生存。如肺腺癌或肺腺癌3期时许多化学因子受体、神经肽受体、激素受体等PAR2(GPR11)、Edg2 (GPR2)等GPCRs表达上调；乳腺癌或乳腺癌3期时PAR2和CXCR-4表达增加；PCa时CXCR-3、GPR68等在PCa组织表达高于正常前列腺组织，其他肿瘤胃癌、转移黑色素瘤等的发展中也有多种GPCRs参与。据估计，市场上接近30%的药物靶标是GPCRs或者与其相关的信号通路，其研发依据部分为许多疾病与GPCRs的变异和多态性关联，因此研究GPCRs与肿瘤包括GPCRs的多态性与肿瘤的关联可以为以干扰GPCRs或其介导的信号通路为基础的药物研发提供理论依据。GPRC6A基因的功能已有研究，GPRC6A广泛表达在脑和外周组织，在睾丸、肾脏、骨骼肌中高表达。GPRC6A敲除的小鼠表现为代谢综合征成骨细胞缺陷介导的骨钙化，肾脏处理钙磷异常，脂肪肝，糖耐受和类固醇合成紊乱等性状。最近的体内体外GPRC6A功能研究也表明其是一个调节PCa生长和肿瘤发展相关的靶分子。再者，GPRC6A是骨-胰腺分泌环中调节骨钙素应答的基因，骨-胰腺分泌环调节胰岛素信号通路，而胰岛素受体和胰岛素样生长因子也在许多研究中被证明与PCa相关。从GPRC6A可以调节激素和影响胰岛素信号通路这两方面支持基因上位点的变异可能会影响PCa的易感性。2010年，Takata R等鉴定了位于RFX6基因上的rs339331和PCa风险关联，此后，此位点在欧洲人群和中国人群中复制验证。结合以上对GPRC6A功能的分析，我们推测GPRC6A基因为PCa易感基因并且选择了位于其第一内含子的rsl606365，在273个PCa患者和606个对照人群中分型后进行关联分析,结果确定了 rsl606365与中国人群PCa关联。rsl606365在染色体上位置为117，238，735，位于GPRC6A的第一内含子上，该内含子有19202个bp，rsl606365是距离起始端17940的SNP位点，内含子在选择性剪接扮演重要角色，一个基因可以 因此而产生多种不同的蛋白质。经查询检索，截至目前，GPRC6A基因rsl606365与PCa风险还未见有报道。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种检测前列腺癌易感性基因的方法。本发明的第二个目的是提供一种检测前列腺癌易感性基因的试剂，包括PCR引物和含有该引物的试剂盒。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案一种检测前列腺癌易感性的核苷酸序列，为序列表SEQ ID No.1所示核苷酸序列。所述核苷酸序列为GPRC6A基因内含子上包含单苷酸多态性位点rsl606365的核苷酸片段。图1为GPRC6A基因结构及rsl606365多态性变异位点的示意图，GPRC6A基因包含有5个内含子，rsl606365位点标在GPRC6A基因图中第I内含子的相应位置。所述单苷酸多态性位点rsl606365的基因型为CG或GG时，前列腺癌易感性最高；基因型为CC时，前列腺癌易感性较低。一组检测前列腺癌易感性的引物和探针，能扩增得到GPRC6A基因内含子上包含单苷酸多态性位点rsl606365的检测前列腺癌易感性的核苷酸序列。所述引物和探针的核苷酸序列分别为序列表SEQ ID No. 2、序列表SEQ ID No. 3和序列表SEQ ID No. 4所示。
一种前列腺癌易感性基因的检测方法，包括如下步骤(1)抽提样品的基因组DNA，扩增GPRC6A基因内含子上的包含单苷酸多态性位点rsl606365的核苷酸片段；(2)检测步骤(I)产物中单苷酸多态性位点rsl606365的基因型，基因型为CG或GG时，前列腺癌易感性最高；基因型为CC时，前列腺癌易感性较低。所述步骤(I)中的核苷酸片段为序列表SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，rsl606365位点位于该核苷酸序列的+501位。所述扩增GPRC6A基因内含子的包含单苷酸多态性位点rsl606365的核苷酸片段，使用的一组引物和探针的核苷酸序列分别为序列表SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3和SEQ IDNo. 4所示。本发明提供了一种检测前列腺癌易感性的诊断试剂盒，其中含有本发明特异性扩增GPRC6A基因内含子rsl606365位点的引物对和用于PCR扩增检测的试剂盒的常规组件、试剂、缓冲液等，本领域技术人员熟知这些常规组件和检测方法。本发明试剂盒中的全部组分、含量、来源和使用方法如下一种预测PCa的试剂盒，供10人份检测应用，由以下试剂组成10 ii LlO X PCR 缓冲液(购自 Pharmacia)，2 U LlOmM dNTP 混合液(购自 Pharmacia),2 u L Taq DNA 聚合酶(2unit/U L)(购自 Takara),0. 2uL Fl引物，为SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列，浓度为lOpmol/U L ；IuL Rl引物，为SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列，浓度为lOpmol/ii L ；I U L P探针，为SEQ ID NO. 4所示的核苷酸序列，浓度为lOpmol/ii L ;10 u LlOXLC-greenPLUS饱和荧光染料；(购自美国Idaho公司)63. 8 ii L 纯水。使用方法I) PCR扩增通过PCR扩增GPRC6A基因的内含子部分片段，制备混合液10XPCR反应缓冲液 I U L，IOmmoI/L dNTPO. 2 u L, TaqDNA 聚合酶 0. 2 y L，IOpmoI/L 上游引物0. 02 u L, 10pmol/L下游引物 0.1 u L, 10XLC Green PLUS饱和荧光染料 I y L，探针 0.1 u L,基因组DNAlii L，加去离子水至10iiL。PCR反应条件为95°C预变性5min，95°C变性lmin，54°C退火30s，72°C延伸6s，总共45个循环，72°C总延伸7min。在进行高分辨熔解曲线分析之前，进行变性和复性处理95°C 30s, 25°C 2min，94°C 30s, 24°C 4min。PCR时于每一体系中加入20iil的石蜡油，以防止液体挥发。2)基因型判定将PCR产物移入HRM专用96孔板内，在Light scanner TMHR-196上进行HRM分析,用Light Scanner Call IT软件对采集后的曲线进行分析,根据熔解曲线的差异判定基因型。使用非标记的但3’端有C3封闭的探针,LCgreenplusDNA结合染料可以结合在探针与配对目的链形成的双链中，其中的一条DNA链(与探针结合的链)是过度扩增使产生过多的目的链，如果SNPs是纯合型则目的链只有一种形式，但野生纯合和突变纯合与探针结合的紧密程度不同，解链时各形成 一个单峰；如果SNPs是杂合的，则扩增的目的链有两种形式，探针结合的两种形式决定解链时形成双峰，从而把三种不同的基因型区分出来。
GPRC6A基因内含子单苷酸多态性位点rsl606365在制备诊断或治疗前列腺癌的试剂或药物中的用途。本发明的测定方法测定了来源于人的基因组DNA，样品没有限制，如体液(血液、腹水及尿液等)、组织细胞(如肝组织)等。通过提取和纯化这些样品可制备基因组DNA。调整基因组DNA的浓度，使其尽可能的一致。以基因组DNA为模板，可扩增出含GPRC6A内含子突变位点rsl606365的核酸片段，以获取测定的大量样本。这种通过扩增含GPRC6A内含子突变点的DNA片段获得的样品，特别适于用作测定材料。在进行基因辅助诊断时，本发明优先适用于测定根据GPRC6A内含子rsl606365突变类型存在的辅助诊断试剂，辅助诊断试剂包括作为必要成分的特定试剂，其对应于用于测定rsl606365基因突变类型的方法。按采用的测定方法来选择适当的特定试剂，如DNA片段和/或用于PCR扩增步骤的引物。本发明的优点是本发明首次阐明了 GPRC6A内含子rsl606365多态性位点与PCa的相关性，提供了一种预测PCa易感性的方法和试剂盒，该方法可用于PCa的预防、辅助诊断，还可以用于新药研发。下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步叙述，以便公众对发明内容有更深入的了解，并非对本发明的限制，凡依照本发明公开内容所做的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
图1为GPRC6A基因结构及内含子多态性变异位点的示意2为GPRC6A基因内含子rsl606365位点经HRM分型溶解曲线3为GPRC6A基因内含子rsl606365位点的测序图
具体实施例方式用于下列实施例中表示试剂的英文缩写如下10XPCR 缓冲液10mM Tris-HCl (pH=8. 3)，500mM 氯化钾(KCI )，IOmM 氯化镁(MgCl2)jO. 01%(W/V)白明胶dNTP :脱氧核苷三磷酸EDTA 乙二胺四乙酸二钠TE IOmM Tris-HCI (pH=7. 5)，ImM EDTA (pH=8. 0)实施例1 :血液样本收集和基因组DNA的提取(I)PCa患者均经组织病理学诊断，共选取来自北京和天津地区无血缘关系的PCa患者273例(年龄46 - 93岁，平均72. 3岁)，同地区的年龄匹配的对照606例(年龄58 - 94岁，平均70.4岁)，均为男性，无PCa家族史、DRE阴性并且PSA〈4ng/mL。所有受检者均为汉族且签署书面知情同意书，这项研究得到卫生部北京医院，卫生部老年医学研究所伦理审核委员会的认可，符合世界医学会赫尔辛基宣言人体医学研究的伦理原则。(2)根据下列方法，制备人基因组DNA。①首先在已标号的1.5mLEP管中加1000 y L红细胞裂解液，后加入400 u LEDTA抗凝血(抗凝血加入前颠倒混匀3_5次)，颠倒混匀，室温静置10分钟；②13000rpm离心30秒后，除去上清液；③在所得沉淀中加480 U I核酸裂解液，弹击管壁，充分混匀后加入20 ii L蛋白酶K (用裂核液稀释20倍稀释蛋白酶K)，颠倒混匀，65°C孵箱10分钟，(期间不时上下混匀，确保无凝块);④取出后降至室温，加300 u L蛋白沉淀液，充分颠倒混匀，静置10分钟，13000rpm离心2分钟；⑤将上清液移至新EP管中，加入670 y L预冷的异丙醇，充分颠倒混匀(10次以上)，可见线状DNA逐渐形成小团块，13000rpm离心2分钟；⑥弃上清液并确保沉淀留在EP中，加入670 u L70%乙醇，上下颠倒混匀，13000rpm离心2分钟；⑦弃上清，使管内乙醇挥发干净；⑧加入TE溶解液(400 u L)，充分溶解，然后对提取的基因组DNA进行浓度和纯度的分析，吸取部分DNA溶液作为工作液，浓度校正至20ng/U L，放置于4°C备用，剩余基因组DNA置_20°C冰箱保存。 实施例2SNP的识别鉴定本发明采用PCR-高分辨率溶解曲线(HRM)分析法和PCR测序技术同时对GPRC6A的内含子基因区的rsl606365位点(其等位位点为C/G)的基因型进行检测。I) PCR-HRM弓丨物的确定从Genebank中查取rsl606365附近的DNA喊基序列(SEQ ID NO.1),引物设计在01igo6. 0和primer5. 0软件下完成。目的片段定位在GPRC6A基因内含子区，全长180bp,确定了正义链Fl (+425bp—+446bp)与反义链Rl (+583bp—+604bp)，特异性引物序列如下Fl :5，-AGAAGTA AGCCCAGCTCATCAT-3，(SEQ ID NO. 2)Rl :5’ -AGGTGCCTTACTCAAATACTGA-3’ (SEQ ID NO. 3)P :5’ -CCTGTCACTGCCGTTGCCATC-3’ (SEQ ID NO. 4)2 ) PCR-HRM反应体系及条件通过PCR扩增GPRC6A的内含子基因区的rsl606365位点所在片段，PCR反应体系为10XPCR 反应缓冲液 I ii L，10mmol/L dNTPO. 2 u L, Taq DNA 聚合酶 0. 2 y L，10pmol/L 上游引物0. 02 u L, IOpmoI/L下游引物0.1 u L, 10XLC Green PLUS饱和荧光染料I U L，探针0.1 u L，基因组DNAl u L，加去离子水至IOii L。PCR时于每一体系中加入20 y I的石蜡油，防止液体挥发。PCR反应条件为95°C预变性5min，95°C变性lmin，54°C退火30s，72°C延伸6s,总共45个循环，72°C总延伸7min。在进行高分辨熔解曲线分析之前，进行变性和复性处理95°C 30s, 25°C 2min，94°C 30s，24°C 4min。3) HRM判定基因型将PCR产物移入HRM专用96孔板内，在Light scanner TMHR-196上进行HRM分析从45°C开始，以0. 30C /s的斜率采集熔解曲线，到98°C结束，用Light ScannerCall IT软件对采集后的曲线(图2)进行分析，判定基因型。4)测序验证从所得的不同基因型的个体中分别随机抽取3例样本进行测序验证。测序样本重新进行 PCR 扩增，测序引物序列为F2 :5’-AGAAGTAAGCCCAGCTCATCAT-3’ (SEQ ID No. 5)，R2 :5’-AGGTGCCTTACTCAAATACTGA-3’(SEQ ID No. 6)，扩增片段长 180bp。PCR反应总体系为30 u L,包含基因组 DNA3ii L，10 X PCRBuf fer3ii L，IOmmo 1/L dNTPO. 6 u L, Taq DNA 聚合酶(5~1^)0.61^，上下游引物(10 11101/1^)各0. 3 ii L，去离子水补充至总体积30ii L。PCR反应条件为95°C预变性5min后进入主循环，95°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸60s，35个循环，72°C延伸7min。PCR产物经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，凝胶成像系统观察合格后送华大基因测序部进行测序验证(图3)。实施例3基因SNP与PCa的相关性统计方法运用Hardy-Weinberg平衡检验研究样本的群体代表性。利用SPSS11. 0软件Pearson卡方检验计算GPRC6A基因内含子rsl606365多态性位点的等位基因、基因型在PCa病例组与正常对照组间的分布频率，logistic回归评价PCa的患病风险OR值及其95%CI可信区间，以P〈0. 05为差异显著性标准。结果位于GPRC6A基因内含子的SNP rsl606365多态位点的基因型和等位基因频率在病例与对照组间的分布及与PCa的关联分析详见表2。表1GPRC6A基因内含子SNP rsl606365多态性位点的基因型和等位基因频率在中国人群中病例对照组间的分布及与PCa的关联分析
权利要求
1.一种检测前列腺癌易感性的核苷酸序列，其特征在于为序列表SEQ ID No.1所示核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的检测前列腺癌易感性的核苷酸序列，其特征在于所述核苷酸序列为GPRC6A基因内含子上包含单苷酸多态性位点rsl606365的核苷酸片段。
3.根据权利要求2所述的检测前列腺癌易感性的核苷酸序列，其特征在于所述单苷酸多态性位点rsl606365的基因型为CG或GG时，前列腺癌易感性最高；基因型为CC时，前列腺癌易感性较低。
4.一组检测前列腺癌易感性的引物和探针，其特征在于能扩增得到权利要求1所述的检测前列腺癌易感性的核苷酸序列。
5.根据权利要求4所述的一组检测前列腺癌易感性的引物和探针，其特征在于所述引物和探针的核苷酸序列分别为序列表SEQ ID No. 2、序列表SEQ ID No. 3和序列表SEQ IDNo. 4所示。
6.一种前列腺癌易感性基因的检测方法，其特征在于包括如下步骤 (1)抽提样品的基因组DNA，扩增GPRC6A基因内含子上的包含单苷酸多态性位点rsl606365的核苷酸片段； (2)检测步骤(I)产物中单苷酸多态性位点rsl606365的基因型，基因型为CG或GG时，前列腺癌易感性最高；基因型为CC时，前列腺癌易感性较低。
7.根据权利要求6所述的前列腺癌易感性基因的检测方法，其特征在于所述步骤(I)中的核苷酸片段为序列表SEQ ID No.1所不的核苷酸序列，rsl606365位点位于该核苷酸序列的+501位。
8.根据权利要求6所述的前列腺癌易感性基因的检测方法，其特征在于所述扩增GPRC6A基因内含子的包含单苷酸多态性位点rsl606365的核苷酸片段，使用的一组引物和探针的核苷酸序列分别为序列表SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示。
9.一种检测前列腺癌易感基因的试剂盒，其特征在于由以下试剂组成IOii LlO X PCR 缓冲液； 2u LlOmM dNTP 混合液；2u L Taq DNA 聚合酶，2unit/ U L ； 0. 2uL Fl引物，为SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列，浓度为lOpmol/u L ； IuL Rl引物，为SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列，浓度为lOpmol/u L ； IuLP探针，为SEQ ID NO. 4所示的核苷酸序列，浓度为lOpmol/y L ； 10 u LlOXLC-green PLUS 饱和荧光染料；63. 8 ii L 纯水。
10.GPRC6A基因内含子单苷酸多态性位点rsl606365在制备诊断或治疗前列腺癌的试剂或药物中的用途。
全文摘要
本发明公开了一种预测前列腺癌易感性的试剂盒和方法，属于生物技术领域。本发明通过提取宿主细胞的基因组DNA，测定受试者的GPRC6A基因第一内含子上rs1606365位点的基因型，预测受试者对前列腺癌的易感性；GPRC6A基因内含子上的rs1606365的基因型为CG或GG时，受试者的易感性最高；rs1606365的基因型为CC时，受试者的易感性较低。本发明的优点是首次阐述了rs1606365基因多态性位点与前列腺癌的相关性，提供了一种预测前列腺癌易感性的方法，该方法可用于前列腺癌的早期预防诊断、辅助诊断，还可以用于新药研发。
文档编号C12N15/11GK103060433SQ201210398648
公开日2013年4月24日 申请日期2012年10月19日 优先权日2012年10月19日
发明者杨泽, 赵承孝, 刘铭, 王建业, 史晓红, 魏东, 朱小泉, 杨帆, 张耀光, 梁思颖, 王飞, 唐雷, 孙亮 申请人:卫生部北京医院