专利名称：一种恩拉霉素高产菌株及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于生产抗生素的菌株，具体地说，涉及一种高产恩拉霉素的菌株及其制备方法和应用。
背景技术：
恩拉霉素是由真杀菌链霉菌(Streptomyces fungicidious)发酵产生的ー种由十几种氨基酸和不饱和脂肪酸结合而成的环状多肽类抗生素。以往用于生产恩拉霉素的杀真菌链霉菌菌株大多是从野生菌株中筛选得到的，其生产水平较低。中国专利ZL201010528367. 2公开了ー种杀真菌链霉菌突变菌株FYFJ03 (保藏号CGMCC No. 4113)，其筛选方法是首先采用5-溴尿嘧啶诱使出发菌株突变，产生突变株，然后采用金黄色葡萄球菌，按照生物效价法对突变株进行筛选，得到高产恩拉霉素的菌株。该方法虽然在一定程度上提高了菌株的生产能力，但是由于仅采用了化学诱变，且筛选方式単一，因此菌株生产能 力的提闻有限。
发明内容
本发明的目的是提供一种高产恩拉霉素的菌株，同时提供上述菌株的筛选方法，以及提供该菌株在恩拉霉素生产中的应用。为实现本发明目的，本发明提供了一种分类名称是杀真菌链霉菌(Streptomycesfungicidious) DCS067 (以下简称DCS067)的恩拉霉素高产菌株，其保藏号是CGMCCNo. 6220，保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会(CGMCC)，保藏日期是2012年6月14曰。本发明所提供的DCS067菌株其微生物学特征如下
单菌落的形态为菌落直径2-3mm，孢子灰色或白色，丰满。显微镜观察孢子圆形或椭圆形。本发明提供的DCS067的制备方法，包括以下步骤
a、孢子悬液I的制备取杀真菌链霉菌的出发菌株，接种于斜面培养基上，在28. 0±0. 5°C、相対湿度40%-60%条件下培养5_8天，然后加入无菌水，将孢子刮下，混匀，得到孢子悬液I ;
b、有机溶剂处理向孢子悬液I中加入无菌有机溶剂，振荡后静置，分层，取水相得到孢子悬液II ;所述振荡可以采用漩涡振荡器振荡15-60 S，静置时间最好为15-30min。C、紫外诱变将孢子悬液II置于灭菌的培养皿中，于波长为254nm的紫外灯下照射45-60s ;照射吋，最好是在功率为30W的紫外灯下垂直距离30cm处照射。d、抗性筛选将诱变处理后的孢子悬液II涂布在含有抗生素的分离培养基上，在28. 0±0. 5°C、相対湿度40%-60%条件下培养5_8天，生成具有抗生素耐药性的若干单菌落；培养时最好第一天正置，第二天起倒置培养；分别挑取上述单菌落，接种于斜面培养基上，在28. 0±0. 5°C、相対湿度40%-60%条件下培养5_8天后，接种于种子培养基上，在28. 0±0. 5°C, 200^220 rpm条件下培养26_30h后，接种于发酵培养基上，在28. 0±0. 5°C，200^220 rpm条件下培养9-12天，得到发酵液，采用HPLC法测定发酵液中恩拉霉素效价，其中，效价最高的发酵液对应的菌株即为本发明所述杀真菌链霉菌(Streptomycesfungicidious) DCS067。本发明首先将菌株孢子悬液经过有机溶剂处理，去除了孢子表面的多糖被、蛋白类物质等附着物，有利于后续的诱变和筛选。这是因为菌株细胞在生长繁殖过程中，孢子周围会形成主要由多糖被以及蛋白类物质组成的附着物，此类附着物不仅能阻挡紫外线的作用，还能防碍抗生素的渗入，同时，多糖被中还含有较高浓度的抗生素降解酶，进一歩阻止了抗生素对深层孢子的影响。去除上述附着物，能够使孢子更好地暴露于外部环境中。本发明在后续步骤中，采用了紫外诱变和抗生素抗性筛选相结合的方式，克服了以往单ー诱变的不足，进ー步提高了突变菌株的恩拉霉素产率。与出发菌株相比，本发明所述菌株的恩拉霉素产率提高了 47. 80%。本发明a步骤所述孢子悬液I中孢子浓度最好为IOll-IO13个/mL或者是吸光度A6tltl为I. 0-2.0 ;该浓度或吸光度下的孢子悬液，易于除去孢子表面的附着物(多糖被、蛋白类物质)，同时还具有良好的繁殖性能。本发明b步骤所述有机溶剂最好 是经灭菌处理的苯酚、三氯甲烷、正十六烷、正己烷、正辛烷、正十二烷、正辛醇、ニ甲苯中的任意ー种或几种的混合物。其中，更优选的组合是苯酚和三氯甲烷的混合物；混合物中，苯酚和三氯甲烷的体积比最好为25:4。采用上述混合物对孢子悬液I进行处理时，能够更好地除去孢子表面的多糖被、蛋白类物质。按质量体积比计算，本发明所述斜面培养基的成分最好为0. 5-1.0%麦芽糖粉，
0.05-0. 10%干酵母粉，0. 05-0. 10%金枪鱼膏，0. 06-0. 12%胰蛋白胨，0. 1-0. 5%氯化钠，
1.8-2. 2%琼脂，其余为水，所述分离培养中抗生素的含量优选0. ro. 7ug /mL，其余成分及含量与斜面培养基相同，所述斜面培养基和分离培养基均采用质量百分含量为30%的NaOH水溶液调节pH至6.7±0. I。本发明所述分离培养基中的抗生素优选链霉素。按质量体积比计算，本发明d步骤所述种子培养基成分最好为2.5-4.5%玉米粉，0. 2-0. 8%玉米蛋白粉，0. 2-0. 8%棉籽饼粉，I. 5-2. 5%轻质碳酸钙，0. 15-0. 35%硫酸铵，
0.02-0. 05%硫酸亚铁，0. 05-0. 25%磷酸ニ氢钾，I. 5-3. 5%玉米浆，其余为水，该培养基采用质量百分含量为30%的NaOH水溶液调节pH至6. 7±0. I。按质量体积比计算，本发明d步骤所述发酵培养基成分最好为6-15%玉米粉，2-6%玉米蛋白粉，0. 2-0. 8%轻质碳酸钙，0. 2-0. 8%氯化钠，0. 1-0. 5%硫酸铵，0. 003-0. 012%硫酸亚铁，0. 007-0. 027%磷酸ニ氢钾，0. 1-0. 5%尿素，0. 005-0. 015%氯化锌，0. 05-0. 25%氢氧化钾，0. 07-0. 15%玉米浆，0. 1-0. 5%L-乳酸，0. 04-0. 12%耐高温a -淀粉酶，其余为水，该培养基采用质量百分含量为30%的NaOH水溶液调节pH至5. 9±0. I。本发明所述菌株能够用于恩拉霉素的生产。用于恩拉霉素生产时，最好在28. 0±0. 5°C，20(T220 rpm条件下，将DCS067菌株在发酵培养基中发酵9-12天，制得含有恩拉霉素的发酵液；发酵采用的培养基成分最好为6-15%玉米粉，2-6%玉米蛋白粉，0. 2-0. 8%轻质碳酸钙，0. 2-0. 8%氯化钠，0. 1-0. 5%硫酸铵，
0.003-0. 012%硫酸亚铁，0. 007-0. 027%磷酸ニ氢钾，0. 1-0. 5%尿素，0. 005-0. 015%氯化锌，
0.05-0. 25% 氢氧化钾，0. 07-0. 015% 玉米浆，0. 1-0. 5%L-乳酸，0. 04-0. 12% 耐高温 a -淀粉酶，其余为水，该培养基采用质量百分含量为30%的NaOH水溶液调节pH至5. 9±0. I。本发明所述杀真菌链霉菌DCS067经菌株复试及稳定性考察结果可知，其具有良好的传代稳定性，同时用于生产恩拉霉素时，可有效提高恩拉霉素的产率。本发明所述方法其筛选方法，操作简便，结果可靠。
具体实施例方式下面用具体实施例来进ー步说明本发明的内容，但并不以任何方式意味着对本发明进行限制。下述实施例采用的杀真菌素链霉菌的出发菌株购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(编号为4. 1312)。实施例I恩拉霉素高产菌株的筛选
a、制备斜面培养基称取8g麦芽糖粉,0. 8g干酵母粉,0. 8g金枪鱼膏，Ig胰蛋白胨,3g氯化钠，20g琼脂，加水定容至1000ml，然后用质量百分含量为30%的NaOH水溶液调节pH至6. 7±0. I,得到混合液A。取上述混合液A,分装至若干30 mmX200 mm的试管中，依次加棉塞、两层纱布、两层牛皮纸包好，在0. ll±0.05MPa、121±l°C条件下灭菌20 min。灭菌完毕后立即摇匀，降温至手感不烫时，铺成斜面，凝固后得到斜面培养基。制备孢子悬液I :取杀真菌链霉菌的出发菌株(4. 1312)，接种至上述斜面培养基 上，在28. 0±0. 5°C、相対湿度40-60%条件下培养7天，然后加入3mL无菌水，用无菌接种针将孢子刮下，转入含有数颗玻璃珠的无菌三角瓶中，振荡，取水层得到孢子悬液I，采用分光光度法检测，其吸光度为A_=l. 506，孢子浓度为IO12个/mL。b、有机溶剂处理将苯酚、三氯甲烷按照体积比25:4混合后，经0. 22 Um有机微孔滤膜过滤除菌，得到无菌有机溶剤。取5mL步骤a得到的孢子悬液I，加入5mL上述无菌有机溶剂，在漩涡振荡器上振荡30 s后，静置30 min，分层；取水相得到孢子悬液II，采用分光光度法检测，其吸光度为A_=0. 456。与孢子悬液I相比，孢子悬液II的吸光度明显下降，外观上也更加澄明通透，说明孢子表面的多糖被、蛋白类物质与有机溶剂结合后从水相转移到了有机相。C、紫外诱变取5mL上述孢子悬液II,置于直径6 cm的无菌培养皿中，培养皿中放有灭菌转子，将培养皿置于磁力搅拌器上，在搅拌条件下，于波长254nm、30W的紫外灯下垂直距离30cm处照射45s。d、制备含有链霉素的分离培养基取a步骤所述混合液A，按200 mL/瓶的用量分装至容积为500 mL的三角瓶中，然后依次加棉塞、两层纱布、两层牛皮纸包装，在
0.11±0. 05MPa、121 土 1°C条件下灭菌20 min。灭菌后立即摇匀，降温至手感不烫时，按照每ImL培养基0. 3 U g链霉素的添加量，加入链霉素水溶液，再次摇匀后倒平板，凝固后得到分离培养基。制备种子培养基称取35g玉米粉，5g玉米蛋白粉，5g棉籽饼粉，20g轻质碳酸钙，
2.5g硫酸铵，0. 36g硫酸亚铁，I. 25g磷酸ニ氢钾，加入去离子水搅拌均匀后，倒入沸水中进行糊化，降至室温时加入28g玉米衆,再用去离子水定容至IOOOmL,最后用30%氢氧化钠溶液调节pH至6. 7±0. I。按照50 mL/瓶的用量，边充分搅拌边分装至若干容积为500 mL的三角瓶中，用棉塞、两层纱布、ー层牛皮纸封ロ。在0. ll±0.05MPa 121±1°C条件下灭菌30min，冷却后得到种子培养基。制备发酵培养基称取120g玉米粉，40g玉米蛋白粉，5g轻质碳酸I丐，5g氯化钠，3g硫酸铵,0. 07g硫酸亚铁,0. 17g磷酸ニ氢钾，3g尿素,0. Ig氯化锌，I. 5g氢氧化钾,加入400mL去离子水搅拌均匀后，倒入500mL沸水中进行糊化，然后加入0. 7g耐高温a -淀粉酶进行液化处理，再加入Ig玉米衆和3g L-乳酸,加水定容至IOOOmL ;最后用30%氢氧化钠溶液调节pH至5. 9±0. I。按照50 mL/瓶的用量，边充分搅拌边分装至若干容积为500mL的三角瓶中，用八层纱布、ー层牛皮纸封ロ，在0. ll±0.05MPa 121 ± 1°C条件下灭菌30min,冷却后得到发酵培养基。抗性筛选将c步骤紫外诱变处理后的孢子悬液II稀释至每ImL含10_4_10_7个孢子，涂布在上述含有链霉素的分离培养基上，于28. 0±0. 5°C、相対湿度40-60%条件下培养7天，第一天正置，第二天起倒置培养，生成具有抗生素耐药性的若干单菌落；分别挑取若干上述单菌落，接种于a步骤制备的斜面培养基上，在28. 0±0. 5°C、相対湿度40-60%条件下培养7天后，用接种铲挖取约0. 5X0. 5cm2接种于上述种子培养基上，在28. 0±0. 5°C， 200^220 rpm条件下培养28h后，接种于上述发酵培养基上，在28. 0±0. 5°C，20(T220 rpm条件下培养10天，得到发酵液，測定发酵液中恩拉霉素效价，效价最高为10617U/mL，将其所对应的菌株命名为杀真菌链霉菌DCS067。測定DCS067的形态学特征，其单菌落的形态为菌落直径2-3mm，孢子灰色或白色，丰满。显微镜观察孢子圆形或椭圆形。对DCS067进行砂土保藏向保存有DCS067菌株的斜面培养基中加入2 mL无菌水，用接种针将孢子刮下，摇匀后取0.2 mL转移至空白砂土管中，注明菌株名称、制备日期和有效期，在压强为-750'760 mmHg柱下抽真空4-6 h,密封后置于装有变色娃胶的干燥器中，于5±3°C保存。其保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会(CGMCC)，保藏号为CGMCC No. 6220，保藏日期2012年6月14日。实施例2恩拉霉素高产菌株的复试及稳定性考察
菌株复试取实施例I中保藏DCS067的砂土管，接种至实施例I制备的斜面培养基上，于28. 0±0. 5°C，相対湿度40-60%条件下培养7天后，用接种铲挖取约0. 5X0. 5 cm2菌层接种至实施例I制备的种子培养基上，于28. 0±0. 5°C, 220 rpm条件下震荡培养26-30 h后，转接至实施例I制备的发酵培养基上，于28. 0±0. 5°C, 220 rpm震荡培养10天，测定发酵液中恩拉霉素的效价，结果为10079、11034、10604 U/mL、平均10572 U/mL。此结果表明DCS067菌株活性良好，并具有高产恩拉霉素的特性。稳定性考察取实施例I中保藏DCS067的砂土管，接种至上述斜面培养基上，于28. 0±0. 5°C，相対湿度40-60%条件下培养7天后，再次接种于上述斜面培养基上进行培养，如此重复，连续转接三次后，转接至上述种子培养基上，于28. 0±0. 5°C，220 rpm条件下震荡培养26-30 h后，转接至上述发酵培养基中，于28.0±0. 5°C，220 rpm震荡培养10天，检测发酵液中土霉素的效价，结果为10217、9805、10079U/mL，平均10034U/mL。此结果表明DCS067具有传代稳定性。实施例3对比实施例
以出发菌株为发酵菌株，采用等同于实施例2复试的培养条件进行发酵，检测发酵液中恩拉霉素的效价，结果为7114、7030、7315U/mL，平均7153U/mL。比较实施例I、实施例3所得发酵液中恩拉霉素效价可知，与出发株相比，本发明所述DCS067菌株的恩拉霉素的产率提高了 47. 80% 。
权利要求
1.ー种恩拉霉素高产菌株，其特征在所述菌株保藏名称是杀真菌链霉菌(Streptomyces fungicidious) DCS067,保藏单位 CGMCC,保藏号是 CGMCC No. 6220,保藏日期2012年6月14日。
2.权利要求I所述恩拉霉素高产菌株的制备方法，其特征在于包括以下步骤 a、制备孢子悬液I:取杀真菌链霉菌的出发菌株，接种于斜面培养基上，在28. 0±0. 5°C、相対湿度40-60%条件下培养5_8天，然后加入无菌水，将孢子刮下，混匀，得到孢子悬液I ; b、有机溶剂处理向孢子悬液I中无菌有机溶剂，振荡后静置，分层，取水相得到孢子悬液II ； C、紫外诱变将孢子悬液II置于灭菌的培养皿中，于波长254nm的紫外灯下照射45_60s ； d、抗性筛选将诱变处理后的孢子悬液II涂布在含有抗生素的分离培养基上，在28. 0±0. 5°C、相対湿度40-60%条件下培养5_8天，生成具有抗生素耐药性的若干单菌落；分别挑取上述单菌落，接种于斜面培养基上，在28. 0±0. 5°C、相対湿度40-60%条件下培养5-8天后，接种于种子培养基上，在28. 0±0. 5°C，200^220 rpm条件下培养26_30h后，接种于发酵培养基上，在28. 0±0. 5°C，200^220 rpm条件下培养9_12天，得到发酵液，测定发酵液中恩拉霉素效价，选取效价最高的发酵液对应的菌株即为杀真菌链霉菌(Streptomycesfungicidious) DCS067。
3.根据权利要求2所述恩拉霉素高产菌株的制备方法，其特征在于，所述孢子悬液I中孢子浓度为1011-1013个/mL或吸光度A600为I. 0-2. 0，所述有机溶剂为苯酚、三氯甲烷、正十六烷、正己烷、正辛烷、正十二烷、正辛醇、ニ甲苯中的任意ー种或几种的混合物。
4.根据权利要求3所述恩拉霉素高产菌株的制备方法，其特征在干，所述有机溶剂是体积比为25:4的苯酚、三氯甲烷的混合物。
5.根据权利要求2或3所述恩拉霉素高产菌株的制备方法，其特征在干，按质量体积比计算，所述斜面培养基的成分为0. 5-1. 0%麦芽糖粉，0. 05-0. 10%干酵母粉，0. 05-0. 10%金枪鱼膏，0. 06-0. 12%胰蛋白胨，0. 1-0. 5%氯化钠，I. 8-2. 2%琼脂，其余为水；所述分离培养中抗生素的含量为0. r0.7ug /mL，其余成分及含量与斜面培养基相同，上述斜面培养基和分离培养基均采用质量百分含量为30%的NaOH水溶液调节pH至6. 7±0. I。
6.根据权利要求5所述恩拉霉素高产菌株的制备方法，其特征在干，c步骤所述抗生素是链霉素。
7.根据权利要求2或3所述恩拉霉素高产菌株的制备方法，其特征在干，按质量体积比计算，d步骤所述种子培养基的成分为2. 5-4. 5%玉米粉，0. 2-0. 8%玉米蛋白粉，0. 2-0. 8%棉籽饼粉，I. 5-2. 5%轻质碳酸钙，0. 15-0. 35%硫酸铵，0. 02-0. 05%硫酸亚铁，0. 05-0. 25%磷酸ニ氢钾，I. 5-3. 5%玉米浆，其余为水，该培养基采用质量百分含量为30%的NaOH水溶液调节 pH 至 6. 7±0. I。
8.根据权利要求2或3所述恩拉霉素高产菌株的制备方法，其特征在干，按质量体积比计算，d步骤所述发酵培养基的成分为6-15%玉米粉，2-6%玉米蛋白粉，0. 2-0. 8%轻质碳酸钙，0. 2-0. 8%氯化钠，0. 1-0. 5%硫酸铵，0. 003-0. 012%硫酸亚铁，0. 007-0. 027%磷酸ニ氢钾,0. 1-0. 5% 尿素，0. 005-0. 015% 氯化锌，0. 05-0. 25% 氢氧化钾，0. 07-0. 15% 玉米浆，.0.l-o. 5%L-乳酸，0. 04-0. 12%耐高温a -淀粉酶，其余为水，该培养基采用质量百分含量为30%的NaOH水溶液调节pH至5. 9±0. I。
9.权利要求I所述菌株在恩拉霉素生产中的应用。
10.根据权利要求9所述菌株在恩拉霉素生产中的应用，其特征在于，在28.0±0. 5°C，200^220 rpm条件下，将DCS067菌株在发酵培养基中发酵9_12天，制得含有恩拉霉素的发酵液；所述发酵培养基的成分为6-15%玉米粉，2-6%玉米蛋白粉，0. 2-0. 8%轻质碳酸钙，0. 2-0. 8% 氯化钠，0. 1-0. 5% 硫酸铵，0. 003-0. 012% 硫酸亚铁，0. 007-0. 027% 磷酸ニ氢钾，0. 1-0. 5% 尿素，0. 005-0. 015% 氯化锌，0. 05-0. 25% 氢氧化钾，0. 07-0. 015% 玉米浆，0.l-o. 5%L-乳酸，0. 04-0. 12%耐高温a -淀粉酶，其余为水，该培养基采用质量百分含量为30%的NaOH水溶液调节pH至5. 9±0. I。
全文摘要
本发明公开了提供一种高产恩拉霉素的菌株，同时提供上述菌株的筛选方法，以及提供该菌株在恩拉霉素生产中的应用。本发明提供的恩拉霉素高产菌株DCS067保藏号是CGMCCNo.6220，保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会(CGMCC)，保藏日期是2012年6月14日。本发明所述DCS067菌株将恩拉霉素产率提高了47.80%。
文档编号C12N1/20GK102864114SQ20121039913
公开日2013年1月9日 申请日期2012年10月19日 优先权日2012年10月19日
发明者王雪峰, 闫彩洁, 刘卫哲 申请人:河北圣雪大成制药有限责任公司