专利名称：：似活的非可培养状态的可培养细菌及其制备方法似活的非可培养状态的可培养细菌及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种似活的非可培养状态(VBNC)的可培养细菌及其制备方法。
背景技术：
：细菌VBNC状态是指细菌在不良环境中，细胞缩成球形，用常规方法(平板法、最大可能近似值法)培养时，不能生长繁殖，但仍然是活的一种特殊存在形式。细菌活的非可培养状态(ViablebutNon-culturable,VBNC)的复苏是指将不能培养的细菌恢复为可培养状态的过程，目前，国内外用于VBNC沙门氏菌复苏的方法主要源自于Reissbrodt等人在2002年发表在AppliedandEnvironmentalMicrobiology刊物上的一篇题为((ResuscitationofSalmonellaentericaSerovarTyphimuriumandEnterohemorrhagicEscherichiacolifromtheViablebutNonculturableStatebyHeat-StableEnterobacterialAutoinducer》的文章。文中提及的VBNC沙门氏菌复苏所需主要材料为含有30%牛血清和50μπιΟ1/1去甲肾上腺素的SAPI培养基，基中SAPI培养基成份较为复杂，由6.25mmol/LNH4NO3,1.84mmol/LKH2PO4,3.35mmol/LKCl，1.Olmmol/LMgSO4,2.77mmol/L(pH=7.5)葡萄糖等组成。主要复苏步骤如下首先将SAPI培养基6000r/min，离心15min，上清液过滤除菌。然后将滤后的上清液涂于羊血琼脂平板上，37°C厌氧培养48h，以检测培养基中是否有杂菌污染。最后将可能含有IO2IO3个CFU/mL浓度的VBNC沙门氏菌无菌接种于SAPI中，37°C厌氧培养至0D_=0.4时，细菌数量增多，浓度可接近IO8个CFU/mL。通过此法可以使维持VBNC长达I年的细菌恢复为可培养状态。细菌VBNC状态自20世纪80年代发现至今，一直是预防医学、流行病学、微生物生态学以及公共卫生检验检疫方面研究的热点问题之一。现阶段，人们已在VBNC细菌诱导、检测、致病性等方面取得重要成果，并且在分子水平上也对该状态有了进一步地了解和认识。但是摆在现阶段的一个瓶颈问题，即VBNC维持期内的细菌，其生物学性质难以稳定存在，而且极易在研究过程中突然消失，使细菌转入真正死亡期，这使得研究者无法做更为深入地研究。也就是说，只有准确捕获VBNC状态，才能对该状态细菌进行系统研究。然而遗憾的是，在VBNC领域中至今尚未获得具有稳定遗传性状的研究模型。也正因如此，有关VBNC状态发生机制的研究也只停留在某一(些)已知基因(如大肠杆菌、霍乱弧菌的毒力基因)在正常与VBNC状态下表达情况的比较，尚未能对VBNC发生机制做客观评述。因而，凭借VBNC特异性基因建立针对VBNC细菌检测方法的研究也只能停滞不前。尽管应用高通量的基因芯片技术能合理躲避瓶颈问题，可对VBNC发生机制进行深入研究，但是繁杂的工作以及大量的资金投入亦会使更多的研究者却步。
发明内容本发明目的是解决VBNC维持期内的细菌，其生物学性质难以稳定存在，而且极易在研究过程中突然消失，使细菌转入真正死亡期，使得研究者无法做更为深入地研究的问题，而提供一种VBNC细菌的研究模型，似活的非可培养状态(VBNC)的可培养细菌及其鉴定方法。似活的非可培养状态(VBNC)的可培养细菌的鉴定方法，它包括用常规的进入VBNC状态诱导方法诱导，可培养的既为似活的非可培养状态(VBNC)的可培养细菌；同时设立对照组，所述的对照组为和待检细菌相同种类的标准细菌；对照组用常规方法培养不可培养；所述的不可培养，连续常规培养3次，每次平板菌落数均为O。所述的常规的进入VBNC状态诱导方法为在适合该种细菌的液体培养基中，4°C培养。似活的非可培养状态(VBNC)的可培养细菌，它是通过上述方法中的任意一种方法鉴定的可培养细菌。似活的非可培养状态(VBNC)的可培养鼠伤寒沙门氏菌，保藏号为CGMCCNo.6578。所述的似活的非可培养状态(VBNC)的可培养鼠伤寒沙门氏菌,它是由鼠伤寒沙门氏菌ATCC10708，在亚硝基胍(NTG)作用下，至死率在8595%的条件下，诱变获得的；所述的似活的非可培养状态(VBNC)的可培养鼠伤寒沙门氏菌，在液体LB培养基中，4°C培养，进入VBNC状态后，对照组鼠伤寒沙门氏菌ATCC10708用常规培养方法培养不可培养，可培养的即为似活的非可培养状态(VBNC)的鼠伤寒沙门氏菌可培养。本发明人，多年从事活的非可培养状态(VBNC)细菌的研究，细菌VBNC状态是指细菌在不良环境中，细胞缩成球形，用常规方法(平板法、最大可能近似值法)培养时，不能生长繁殖，但仍然是活的一种特殊存在形式。发现了一种进入VBNC后，却仍然可用常规方法培养的细菌，也就是说本发明人发现了一种细菌的另一种活的存在状态，它具有所有的非可培养状态(VBNC)细菌的表征，具备了VBNC细菌相关基因，不用经过细菌活的非可培养状态(ViablebutNon-culturable,VBNC)的复苏过程(例如用SAPI培养基复苏)，用常规方法培养既可培养。本发明人将其命名为似活的非可培养状态(VBNC)的可培养细菌，筒称似VBNC的可培养细菌。本发明人获得了多株似VBNC的可培养细菌，其中，似活的非可培养状态(VBNC)的可培养鼠伤寒沙门氏菌MVS株和似活的非可培养状态(VBNC)的可培养乳酸菌MVR株，已于2012年9月18日，送至中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心保藏，保藏编号分别为CGMCCNo.6578和CGMCCNo.6579。本发明提供的似活的非可培养状态(VBNC)的可培养细菌，是能准确获取具有稳定遗传性状的VBNC细菌研究模型，解决了VBNC维持期内的细菌，其生物学性质难以稳定存在，而且极易在研究过程中突然消失，使细菌转入真正死亡期，使得研究者无法做更为深入地研究的瓶颈问题，从而为客观揭示VBNC形成机制奠定基础。似活的非可培养状态(VBNC)的可培养细菌，是在不良环境中能持续存活的“菌种”，作为益生菌制剂及疫苗等方面，提高保质期具有广阔的应用前景。本发明还提供了似活的非可培养状态(VBNC)的可培养细菌的制备和鉴定方法。图1为预扩增产物琼脂糖凝胶检测，其中，M:分子量标记；1=VBNC细菌突变体；2正常细菌；3:阴性对照；图2选择性扩增产物琼脂糖凝胶检测，其中，M:分子量标记；1，2:阴性对照；3，4:正常细菌；5，6=VBNC细菌突变体；图3选择性扩增产物PAGE检测，其中，M:分子量标记；1:阴性对照；2:正常细菌；3VBNC细菌突变体；图4分子量标记为200bp和700bp的DHPLC图谱；图5阴性对照组的DHPLC图谱；图6未经NTG处理的正常细菌选择性扩增产物的DHPLC图谱；图7VBNC细菌突变体的选择性扩增产物的DHPLC图谱；图8VBNC细菌突变体DHPLC图谱鉴定结果；图9选择性扩增产物PAGE检测，其中，M:分子量标记；1:阴性对照；2:乳酸杆菌；3VBNC乳酸杆菌突变体。具体实施方式实施例1鼠伤寒沙门氏菌化学诱变。一、实验组1.菌株培养。将鼠伤寒沙门氏菌iSalmorwllatyphimurium)标准株(ATCC10708)纯培养物接种至含有100mlLB液体培养基的三角烧瓶中，37°C，180r/min，通气振荡培养过夜，当OD6tltl接近O.6时，停止培养。2.鼠伤寒沙门氏菌悬液制备。取浓度为5X108个/ml的细菌培养液2ml，6000rpm,离心5min，弃上清，灭菌生理盐水洗菌体2次，2ml磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲液(O.93%的柠檬酸，O.1lM磷酸二氢钠，pH5.2)悬浮菌体。3.亚硝基胍(NTG)诱变鼠伤寒沙门氏菌。取Iml细菌悬浮液，加入100μINTG(工作浓度为lmg/ml)，此剂量对细菌的致死率为92%。充分混合后，在30°C条件下作用30min，反应结束后用O.1M磷酸缓冲液[pH7.O]终止反应；将经NTG处理和处理的菌液进行10倍稀释，涂布于SS固体培养基中，37°C培养。二、对照组将鼠伤寒沙门氏菌{Salmonella标准株(ATCC10708)纯培养物接种10倍稀释，涂布于SS固体培养基中，37°C培养。实施例2似活的非可培养状态(VBNC)的可培养细菌的制备。1.VBNC状态诱导。将在沙门、志贺菌属固体培养基(SS)上生长出的，实验组和对照组的单菌落，接种到IOOml的液体LB中，37°C振荡培养至OD6tltl接近O.6时，停止培养。取ImL菌液至无菌离心管中，6000r/min离心5min，弃上清，用灭菌生理盐水洗菌体2次，然后将菌液再次转移至含有IOOml液体LB中，4°C培养。3.VBNC状态检测。按专利200810051106.9提供方法检测，即取待检菌液50μ1，加入SYT09和PI各25μ1，吹吸混匀，避光染色1520min。然后将经墨水染黑的微孔滤膜置于无自发荧光的载玻片上，吸取适量菌体滴在微孔滤膜上，待液体刚好被滤膜吸干时，在其上盖上盖玻片，并用力压片，使细菌充分固定在膜上。最后在盖玻片上滴一滴无自发荧光的油，用落射荧光显微镜于暗室观察。对照组及实验组均在荧光显微镜可见呈现绿色荧光的菌体，证明两组均进入VBNC状态。3.可培养能力测定。取待检菌液50μI，用灭菌的L型玻璃棒将菌液均匀涂布在LB固体培养基上。然后将平板正向培养30min后，再倒置于37°C中，培养2028h。经NTG处理的菌体仍能在平板上生长(实验组)。对照组连续培养3次，无生长能力。实施例3=VBNC沙门氏菌突变体鉴定。1.基因组DNA双酶切。分别取正常条件(37°C，LB液体培养18h)培养的沙门氏菌和疑似VBNC细菌突变体的基因组DNA，用JfeeJ和PJ两种酶对基因组DNA进行酶切。酶切反应体系DNA模板2μI,MseI和EcoRI各3U，双酶共用Buffer2μ1,100ΧBSA(IOmg/ml)0.2μI，补水至20μI。37°C酶切5h，65°C变性20min。2.双酶切产物与接头连接。酶切产物20μ1，EcoRI接头R、EcoRI接头F、MseI接头R、MseI接头F各IμI，T4DNA连接酶5U，T4DNA连接酶Buffer2μI，补水至50μI。16°C连接过夜。3.预扩增。连接产物2μ1，预扩增引物Pl和P2各10pmol，dNTP2μI,ExTaq酶5U,PCRBuffer2μ1，补水至50μI。反应程序94°C预变性5min—94°C30s,56°C30s,72°Clmin，30个循环一72延伸lOmin。扩增产物在1%琼脂糖凝胶上均呈弥散状，见图1。4.选择性扩增。20倍稀释的预扩增产物2μ1，选择性扩增引物Pl和P2各10pmol,dNTP2.5μI,ExTaq酶2.5U，PCRBuffer2.5μ1，补水至25μI。反应程序94°C预变性5min—94°C30s,65°C30s(0.7°C/循环)共12个循环，72°C60s—94°C30s,56°C30s,72°C60s共18个循环一72°C，lOmin。扩增产物在1%琼脂糖凝胶上分布多条条带，正常沙门氏菌与VBNC沙门氏菌突变体指纹图谱不相同，但重复性较好，而阴性对照组仅出现引物二聚体，见图2。5.8%中性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。PAGE凝胶在电压为100V，恒定功率为50W、温度为50°C条件下预电泳约50min。而后吸取IXTBE缓冲液冲冼加样孔，将2μL6Χ电泳上样缓冲溶液点在Parafilm膜上,并与5μL选择性扩增产物混合,加至加样孔内。设电压为50V，恒定功率50W，直到二甲苯青迁移至凝胶底部，停止电泳。最后用溴化乙锭染色30min。产物在PAGE凝胶上可随机分布众多清晰条带，数量远超过琼脂糖凝胶(图3)，并且VBNC沙门氏菌突变体与正常菌的图谱可见明显差异。6.DHPLC鉴定。取VBNC沙门氏菌和正常沙门氏菌的选择性扩增产物、选择性扩增的阴性对照组、含有IOObp和700bp片段的分子量标记各10μI置于离心管中，并放于同一检测盘内。设定DHPLC仪器的流动相参数，即缓冲溶液A浓度为50%，缓冲溶液B浓度为50%。流速为O.9ml/min，并选用荧光检测器。DHPLC图谱显示含有分子量标记的样品出现两个峰，分别为IOObp和700bp(图4);阴性对照组仅出现引物二聚体，故只在近IOObp处出现色谱峰(图5)；VBNC细菌突变体(图6)与正常菌(图7)的色谱峰数量及出峰时间均存在明显差异(图8)。实施例3植物乳酸杆菌化学诱变乳酸杆菌(L)是吉林农业大学预防兽医学实验室从自然发酵酸牛奶中分离，经16sRNA鉴定为植物乳酸杆菌plantarum)a由吉林农业大学预防兽医学实验室保存。I)似活的非可培养状态的可培养乳杆菌MVR株的获得。实验组取5XIO8个/ml的乳酸杆菌(L)菌体悬浮液lml，加入100μINTG(lmg/ml)，充分混合后，在30°C条件下作用30min，反应结束后用O.1M磷酸缓冲液[pH7.O]终止反应，NTG用量以致死率达到80%95%为宜。对照组未经NTG处理的乳酸杆菌(L)悬浮液。实验组、对照组的菌液进行10倍稀释，涂布于MRS固体培养基中，37°C培养。将单菌落接种到100ml的液体MRS中，振荡培养至0D_接近O.8时，取Iml菌液至pH2.O3.0，MRS液体培养基中，4°C兼性厌氧培养。在VBNC诱导过程中，取经NTG和未经NTG处理的菌液涂布于固体MRS中，37°C培养，未经NTG处理的乳酸杆菌作为对照组在35d内可培养菌数显著下降，连续培养3d，无细菌生长，按专利200810051106.9提供方法检测，即取待检菌液50μ1，加入SYT09和PI各25μ1，吹吸混匀，避光染色1520min。然后将经墨水染黑的微孔滤膜置于无自发荧光的载玻片上，吸取适量菌体滴在微孔滤膜上，待液体刚好被滤膜吸干时，在其上盖上盖玻片，并用力压片，使细菌充分固定在膜上。最后在盖玻片上滴一滴无自发荧光的油，用落射荧光显微镜于暗室观察。而荧光显微镜观察全部为呈现绿色荧光的活菌，表明对照组已于第35d进入VBNC状态。而经NTG处理的实验组的可培养菌数在整个观察期内一直具备可培养能力。采用AFLP法，对实验组、对照组的基因组DNA，用MseI和EcoRI两种酶对对基因组DNA进行酶切，酶切产物与接头连接后，依次进行预扩增和选择性扩增。选择性扩增的模板是预扩增产物，在扩增前要对预扩增产物做20倍稀释，最后选择性扩增产物用8%中性聚丙烯酰胺凝胶EB染色检测。图9可见每条泳道上随机分布的清晰条带，而且条带数目适中，谱带质量较高，产物多集中在50bp750bp。而且实验组与对照组间存在多条差异条带，说明两者基因组DNA存在多态性。由此证明乳酸杆菌在NTG诱变后，其基因组发生了突变。实验组中获得经NTG处理的VBNC乳酸杆菌突变体，命名为似活的非可培养状态可培养乳杆菌MVR株，已于2012年9月18日，送至中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNo.6579ο权利要求1.似活的非可培养状态的可培养细菌的鉴定方法，它包括用常规的进入VBNC状态诱导方法诱导，可培养的为似活的非可培养状态的可培养细菌。2.根据权利要求1所述的似活的非可培养状态的可培养细菌的鉴定方法，其特征在干同时设立对照组，所述的对照组为和待检细菌相同种类的标准细菌；对照组用常规方法培养不可培养。3.根据权利要求2所述的似活的非可培养状态的可培养细菌的鉴定方法，其特征在于所述的不可培养，连续常规培养3次，毎次平板菌落数均为O。4.根据权利要求1、2或3所述的似活的非可培养状态的可培养细菌的鉴定方法，其特征在于所述的常规的进入VBNC状态诱导方法为在适合该种细菌的液体培养基中，4°C培养。5.似活的非可培养状态的可培养细菌，它是通过权利要求1的鉴定方法鉴定的可培养细菌。6.似活的非可培养状态的可培养鼠伤寒沙门氏菌，保藏号为CGMCCNo.6578。7.根据权利要求6所述的似活的非可培养状态的可培养鼠伤寒沙门氏菌，其特征在于，它是鼠伤寒沙门氏菌ATCC10708，在亚硝基胍作用下，至死率在8595%的条件下，诱变获得的。8.根据权利要求7所述的所述的似活的非可培养状态的可培养鼠伤寒沙门氏菌，其特征在于在液体LB培养基中，4°C培养，进入VBNC状态后，对照组鼠伤寒沙门氏菌ATCC10708用常规培养方法培养不可培养，可培养的即为似活的非可培养状态的鼠伤寒沙门氏菌可培养。全文摘要本发明公开了的似活的非可培养状态(VBNC)的可培养细菌，是能准确获取具有稳定遗传性状的VBNC细菌研究模型，解决了VBNC维持期内的细菌，其生物学性质难以稳定存在，而且极易在研究过程中突然消失，使细菌转入真正死亡期，使得研究者无法做更为深入地研究的瓶颈问题，从而为客观揭示VBNC形成机制奠定基础。似活的非可培养状态(VBNC)的可培养细菌，是在不良环境中能持续存活的“菌种”，作为益生菌制剂及疫苗等方面，提高保质期具有广阔的应用前景。本发明还公开了似活的非可培养状态(VBNC)的可培养细菌的制备和鉴定方法。文档编号C12N1/20GK103031360SQ20121040360公开日2013年4月10日申请日期2012年10月22日优先权日2012年10月22日发明者李影,段锐,钱爱东,张文慧,李莹申请人:吉林农业大学