一种封闭式快速培养微藻的方法
【专利摘要】本发明公开了一种封闭式快速培养微藻的方法。该方法包括：（1）培养兼性厌氧细菌种子液；（2）培养自养微藻种子液；（3）将兼性厌氧细菌种子液和自养微藻种子液分别接入具有内置膜分离装置的封闭式光生物反应器内进行半混合培养，厌氧细菌在膜分离装置内部发酵，微藻细胞在膜分离装置以外的光生物反应器内进行光合作用生长，两个反应器内培养基组成和培养条件一致，培养过程中补充兼性厌氧细菌生长代谢所需的有机碳源；所述的光生物反应器还包括导流筒，膜分离装置内置于导流筒内，反光膜贴在导流筒外表面。该法具有提高自养微藻细胞收获量，提高无机碳源（CO2）的利用率，提高微生物油脂含量，简化培养装置等优点。
【专利说明】一种封闭式快速培养微藻的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，涉及一种培养微藻的方法，具体地说涉及一种封闭式半混合快速培养自养产油微藻和兼性厌氧细菌来获取高微藻细胞收获量，同时提高微藻细胞油脂含量的方法。
【背景技术】
[0002]随着社会经济发展，化石资源的供应日益紧缺、油品供需矛盾也日渐突出，相应的环境污染问题也更加突出，多渠道开发可再生资源成为必然。以微生物油脂等可再生资源为来源的生物柴油具有能量密度高、含硫量低、燃烧充分、润滑性好等性能，还具有可再生、环境友好、易生物降解、储运安全、抗爆性能好等特点，可作为石化能源的替代品。 [0003]微藻是含油微生物之一，微藻富含不饱和脂肪酸、淀粉和蛋白质等营养成分(如螺旋藻等)，可用作能源、医药和食品等领域原料；通过条件调控，微藻细胞可以大量积累脂肪酸，有些微藻如小球藻，其体内脂肪酸含量可占细胞干重的30%~60%。利用培养微藻来积累油脂资源，已经成为目前利用太阳能和固定二氧化碳开发可再生资源最热门的研究领域，不仅具有巨大的市场潜力，而且具有突出的社会价值。
[0004]微藻细胞生长方式一般分为光自养和碳源异养两种，光自养过程要消耗CO2, CO2通过微藻细胞的光合作用被高效固定为细胞成份，是实现理想培养效果的关键，同时存在补充CO2与光合作用产生O2的解吸、排出的问题。CN200410020978.0及CN03128138.9均采用在光生物反应器系统中加入一种装置方法，来实现CO2的补给，同时也能实现一定的氧解析效果。碳源异养过程是利用有机碳源为底物替代自养过程中的CO2来进行微藻生物质的积累，细胞生长速度较快，但细胞内油脂积累水平较低。
[0005]利用其它非藻类微生物与微藻进行混合培养的研究也比较多，CN200910038908.0公开了一种芽孢杆菌调控浮游微藻混合培养的方法，该方法在混合培养体系中使用芽孢杆菌对各微藻进行混合培养时发现，各微藻生长均衡，稳定性好，可避免混合培养体系中藻相的生物多样性单一，避免某种微藻的数量出现极端优势或劣势，因此该方法主要用于控制某种微藻在水体中的泛滥。CN200910038910.8公开了一种乳酸杆菌调控微藻混合培养及协同净化养殖排放水的方法，该方法通过乳酸杆菌的直接或间接作用，调控各种微藻的数量比例，使各藻生长均衡，稳定性好，通过菌、藻间的协同作用达到对养殖排放废水的去氮除磷的目的。上述现有技术是通过菌体来控制水体中藻的生长均衡，并不是促进藻的生长和微藻细胞中的油脂积累。
【发明内容】
[0006]针对现有技术的不足，本发明提供一种封闭式快速培养微藻的方法。该法将自养产油微藻与兼性厌氧细菌在封闭式光生物反应器中实现半混合快速培养，具有提高自养微藻细胞收获量，提高无机碳源(CO2)的利用率，提高微生物油脂含量，简化培养装置等优点；同时不影响兼性厌氧细菌的发酵过程，在收获含油微藻细胞的同时还可通过分离培养液中的厌氧发酵产品，实现细菌厌氧发酵生产化学品，是一种油脂与生物化学品同时生产的高效培养方法。
[0007]本发明封闭式快速培养微藻的方法,包括如下内容:
(O培养兼性厌氧细菌种子液；
(2)培养自养微藻种子液；
(3)将兼性厌氧细菌种子液和自养微藻种子液接入具有内置膜分离装置的封闭式光生物反应器内进行半混合培养，兼性厌氧细菌在膜分离装置内部发酵，微藻细胞在膜分离装置以外的光生物反应器内进行光合作用生长，两个反应器内培养基组成和培养条件一致，培养过程中补充兼性厌氧细菌生长代谢所需的有机碳源；所述的光生物反应器还包括导流筒，膜分离装置内置于导流筒内，出口与光生物反应器出口平齐；所述的光生物反应器具有反光膜，反光膜贴在导流筒外表面。
[0008]本发明方法中，膜分离装置优选采用陶瓷膜分离装置，膜孔直径为0.05μπι~0.5 μ m0
[0009]本发明方法中，反光膜优选采用3M反光膜，3M反光膜是一种玻璃珠封入式反光膜，背面涂有压敏胶和易剥离背纸，即使在完全湿润状态下或者在大角度下，也可以保持它良好的反光性能。反光膜可以部分或全部覆盖导流筒的外表面，外置光源的光线射入光生物反应器到达导流筒处经反光膜实现反光，光线返回到光源处，从而实现双光程环境。
[0010]本发明方法中，兼性厌氧细菌包括芽孢杆菌、梭形杆菌、双歧杆菌、乳杆菌或克雷伯氏菌等，有机碳源为葡萄糖、甘油、果糖、淀粉、纤维素水解液等，兼性厌氧细菌的代谢产物，即兼性厌氧细菌发酵产物一般为1，3-丙二醇和/或有机酸等，不同的兼性厌氧细菌得到的发酵产物有所不同，根据兼性厌氧细菌的种类不同而有所不同。兼性厌氧细菌种子液培养是本领域技术人员熟知的方法，如采用搅拌式生物反应器，加入培养基和兼性厌氧细菌，在适宜的条件下进行培养。
[0011]本发明方法中，自养微藻包括小球藻、葡萄藻、小环藻、硅藻等，自养微藻种子液培养是本领域技术人员熟知的方法，如采用常规的气升式光生物反应器进行种子液培养。
[0012]本发明方法中，封闭式半混合培养过程中，兼性厌氧细菌种子液与微藻种子液的初始接入体积比为1:1~1:10。半混合培养的初始培养基采用兼性厌氧细菌所需的培养基，同时添加微藻细胞生长所需的无机盐和微量元素(如按SE培养基的组成添加相关物质)等。半混合培养过程以批次或连续等方式补充兼性厌氧细菌发酵过程所需有机碳源。
[0013]本发明方法中，封闭式半混合培养条件一般采用与兼性厌氧细菌发酵过程的条件相似的条件，如温度一般为20°C~37°C，pH值一般为6~9，优选为6.5~7.5等。
[0014]本发明方法利用膜分离装置将兼性厌氧细菌和微藻细胞进行封闭式半混合培养，兼性厌氧细菌与微藻细胞生长条件和所需碳源的不同，互相补充和促进。微藻细胞利用兼性厌氧细菌发酵后废弃碳源(CO2)为自身生长碳源，同时维持系统较平稳的渗透压条件(pH值)，通过补充有机碳源保证兼性厌氧细菌不断生长。同时，光生物反应器具有反光膜，即在光生物反应器导流筒外表面贴有反光膜，使外置光源实现返程，增加光合作用强度。通过光合作用且在反光膜作用下，培养体系处在双光程环境下使微藻细胞快速生长。
[0015]本发明方法兼性厌氧细菌与微藻细胞通过膜分离装置实现各自单独的生长空间，培养基组成则是实现共混与互通，从而实现兼性厌氧细菌与微藻细胞的半混合培养过程。选择适宜种类兼性厌氧细菌和适宜种类微藻细胞，通过控制兼性厌氧细菌和微藻细胞的培养过程，使两者形成稳定的半混合培养体系，并建立起不同细胞间共同利用环境营养条件而细胞间不互相干扰的生长关系，且微藻细胞处在双光程环境下，实现了含油微藻细胞的快速生长过程，并提高了油脂的累积效果，提高了单一含油微藻培养过程中单位发酵体系内的油脂收获量，从而为微生物油脂的制备奠定了基础。同时对兼性厌氧细菌的发酵过程不存在影响，可以同时获得所需的发酵产物。微藻对发酵过程使用的碳源和发酵产物均具有耐受性，不影响微藻的生长和油脂的积累。与两种微生物同步混合培养过程相比，微藻生物质收获简单，避免与细菌细胞一起收获，而影响藻泥油脂提取部分的效能。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1是本发明一种具体工艺流程示意图。
[0017]其中:1-兼性厌氧细菌种子，2-微藻种子，3-兼性厌氧细菌种子液培养反应器，4-微藻种子液培养反应器，5-兼性厌氧细菌种子液接种管线，6-微藻种子液接种管线，7-膜分离装置，8-封闭式光生物反应器，9-混合培养基及酸碱中和剂进入管线，10-导流筒，11-反光膜，12-进气口，13-尾气出口。
【具体实施方式】
[0018]本发明封闭式快速培养微藻的方法，具体包括如下内容:半混合培养之前，两种微生物分别单独进行种子液培养，采用搅拌式生物反应器进行兼性厌氧细菌种子液培养，采用光生物反应器进行自养微藻种子液培养，搅拌式生物反应器内包括兼性厌氧细菌、厌氧细菌发酵培养基，光生物反应器内包括微藻藻种和自养SE培养基。种子液培养合格后，分别经过各自的接种管线转移到培养兼性厌氧细菌的内置的膜分离装置中和培养微藻的具有反光膜的封闭式光生 物反应器中，并加入经过无菌处理的混合培养基营养成分和酸碱中和剂调节至半混合培养所需生长条件。其中混合培养基中的有机碳源用于兼性厌氧细菌生长，而兼性厌氧细菌生长所产生的CO2用于微藻生长。兼性厌氧细菌种子液与微藻细胞种子液接种体积比例为1:1~1:10。接种后半混合培养体系通过正常pH控制、温度控制和通气量等控制培养过程。其中半混合培养时有机碳源最优选采用流加方式进行，其被兼性厌氧细菌利用生长，兼性厌氧细菌发酵后产生较多的CO2，排出细胞外进入培养系统中。由于兼性厌氧细菌细胞排出的CO2处于溶解状态，因此可以立即通过膜孔隙传递到光生物反应器内被混合培养基系统中的微藻细胞利用，作为微藻细胞生长的碳源供应。
[0019]下面通过附图进一步说明本发明的详细工艺过程。如图1所示，兼性厌氧细菌种子I经兼性厌氧细菌种子液培养反应器3培养生长达生物量OD值为5.0~15.0 ;微藻种子2经微藻种子液培养反应器4培养生长达生物量OD值为2.0~10.0。将培养好的厌氧细菌种子液由接种管线5、微藻细胞种子液由接种管线6分别转接到内置膜分离装置7中和封闭式光生物反应器8中进行半混合培养，并将混合培养基及酸碱中和剂9加入膜分离装置和光生物反应器中进行混合，同时经过检测分析混合后培养系统中PH值来调节混合培养液的pH至6.5~7.5。反光膜11贴在光生物反应器导流筒10的外表面，实现外置光源的双光程效应。气体由进气口 12进入反应体系内，利用三通分别通入膜分离装置7和导流筒10内侦牝从而实现向膜分离装置内兼性厌氧细菌和光生物反应器内供气需要，通入的气体统一由尾气出口 13排出整个反应体系，控制排气阀开度，使反应器内部压力为0.0r0.05MPa。
[0020]本发明方法中，兼性厌氧细菌在有机碳源条件下实现快速生长，兼性厌氧细菌消耗有机碳源，生成细胞生物质和各种代谢产物，细胞生物质由于体形较大而被膜截留在膜分离装置内部，同时发酵产生CO2气体排出细胞外后经过膜孔隙传递到整个混合培养基系统中，使培养体系内无机碳源含量增加，微藻细胞利用这些无机碳源及反光膜形成的双光程环境下进行光合作用，获得微藻细胞自身的快速生长。同时兼性厌氧细菌发酵使系统的PH值下降，而随着微藻细胞的生长，利用溶解的CO2,使系统的pH值上升，两者互为作用，调节系统的PH处于适应范围。
[0021]本发明方法中，光生物反应器可以是板式、管式、气升搅拌式等封闭式反应器，可以通入的氮气或含二氧化碳气体和导流筒作用形成返混状态，在导流筒外表面贴3M反光膜实现双光程环境。光生物反应器的其它操作条件按常规的细菌和微藻培养条件控制。可以设置培养体系二氧化碳和溶解氧量的测定装置，根据需要调整通气量，以获得良好的效果。同时提供PH电极检测，以便通过外源加入酸、碱来实现系统pH的控制。
[0022]本发明方法中，pH控制酸中和剂为HCl、H2SO4, HNO3等常用的无机酸，碱中和剂为NaOH, NaHC03> K0H、Ca (OH) 2、氨水等常用的无机碱。
[0023]本发明方法中，半混合培养过程温度控制为内部盘管加热方式。
[0024]本发明方法中，半混合培养中，向膜分离装置和光生物反应器内可以通入氮气或含二氧化碳的气体。通气管线进入光生物反应器后以三通形式存在，其中一条支路通入膜分离装置中，提供细菌厌氧发酵的环境条件，出口引出整个反应器；其余两支气路分别通入两侧的导流筒内侧区域，实现通气导流作用，使膜分离装置之外的光生物反应器内反应液可以进行混合均匀。通入气体量随培养液体积变化而变化，通入气体体积速率与培养系统装液体积比例为0.1vvm~1.0vvm (单位液体体积每分钟通入的单位气体量)。
[0025]本发明方法中，光生物反应器内的培养基为兼性厌氧细菌和微藻细胞所需的混合培养基，可以提供兼性厌氧细 菌的发酵生长所需营养物质，也提供是微藻细胞光合生长所需营养成份，两种细胞通过膜分离装置被分隔开来，实现单独生长，减弱不同细胞间生态影响，同时也为微藻细胞的收获提供了方便。兼性厌氧细菌利用其适宜的培养基，其中碳源为有机碳源，进行生长，获得生物量的增长，部分有机碳源通过发酵过程呼吸生成CO2,兼性厌氧细菌所生成的CO2在培养体系中作为微藻进行光合作用的碳源，从而获得微藻细胞的生长。
[0026]本发明方法中，兼性厌氧细菌所需的有机碳源可以是甘油、葡萄糖、果糖、淀粉、纤维素水解液等，该有机碳源的加入采用流加方式进行，根据培养液样品成份分析，随时检测系统的有机碳源浓度水平，将配制好的有机碳源母液按消耗速度进行流加。
[0027]本发明方法中，半混合培养过程培养基的初始有机碳源浓度(以有机物质量浓度计，下同)为1.0%~5.0%，培养过程中通过厌氧细菌生长消耗，有机碳源经过补加泵进行不断补加，维持有机碳源浓度为1.0%~2.0%。
[0028]本发明方法中，兼性厌氧细菌种子液的培养基采用其适用的兼性厌氧细菌培养基，自养微藻种子液的培养基采用微藻SE培养基。半混合培养过程采用兼性厌氧细菌培养基和微藻培养基相结合，包括有机碳源、无机盐和微量兀素等成份，成为混合培养基。优选的培养条件为:种子液接种量(占光生物反应器体积，V/V):5%~20% ;温度:25°C~30°C ；通气量:0.1vvm ~1.0vvm,揽拌转速:IOOrpm ~400rpm,时间:24h ~120h。
[0029]方案I (比较例)
将克雷伯氏菌(中国微生物菌种保藏中心CGMCC N0.0798)在300mL摇瓶中进行培养，所用培养基为兼性厌氧细菌甘油培养基，培养20h后得到所需种子液，OD值为12.0左右。将培养的兼性厌氧细菌种子液接入含混合培养基的20L封闭式光生物反应器中内置的IOL陶瓷膜分离装置内，膜孔直径为0.1y m。光生物反应器为气升搅拌式，可以实现培养液的返混；反应器为玻璃体，反应器内有温度控制盘管，以及pH、O2和CO2传感器。
[0030]兼性厌氧细菌为克雷伯氏肺炎杆菌，其培养基为甘油培养基。
[0031]甘油培养基配方(以每升计)=NH4Cl5.35 g, KCl 0.75 g, NaH2PO4 1.38 g, Na2SO4
0.28 g, MgCl2 ? 6H20 0.26 g, CaCl2 ? H2O 0.02 g，酵母提取物 1.0 g，甘油 40 g。
[0032]SE培养基配方(以每升计):
【权利要求】
1.一种封闭式快速培养微藻的方法，包括如下内容: (1)培养兼性厌氧细菌种子液； (2)培养自养微藻种子液； (3)将兼性厌氧细菌种子液和自养微藻种子液分别接入具有内置膜分离装置的封闭式光生物反应器内进行半混合培养，厌氧细菌在膜分离装置内部发酵，微藻细胞在膜分离装置以外的光生物反应器内进行光合作用生长，两个反应器内培养基组成和培养条件一致，培养过程中补充兼性厌氧细菌生长代谢所需的有机碳源；所述的光生物反应器还包括导流筒，膜分离装置内置于导流筒内，出口与光生物反应器出口平齐；所述的光生物反应器具有反光膜，反光膜贴在导流筒外表面。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于:膜分离装置采用陶瓷膜分离装置，膜孔直径为 0.05 μ m ~0.5 μ m。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于:反光膜采用3M反光膜，部分或全部覆盖导流筒的外表面。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于:兼性厌氧细菌包括芽孢杆菌、梭形杆菌、双歧杆菌、乳杆菌或克雷伯氏菌，有机碳源为葡萄糖、甘油、果糖、淀粉或纤维素水解液。
5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于:兼性厌氧细菌种子液培养采用搅拌式生物反应器，自养微藻种子液培养采用气升式光生物反应器。
6.按照权利要求1所述的方法，其特征在于:自养微藻包括小球藻、葡萄藻、小环藻或娃藻。
7.按照权利要求1、4`或6所述的方法，其特征在于:半混合培养过程中，兼性厌氧细菌种子液与微藻种子液的初始接入体积比为1:1~1:10。
8.按照权利要求1所述的方法，其特征在于:半混合培养的初始培养基采用兼性厌氧细菌所需的培养基，同时添加微藻细胞生长所需的无机盐和微量元素。
9.按照权利要求1、4或8所述的方法，其特征在于:半混合培养过程以批次或连续方式补充兼性厌氧细菌发酵过程所需有机碳源。
10.按照权利要求9所述的方法，其特征在于:兼性厌氧细菌培养基初始有机碳源浓度以有机物质量浓度计为1.0%~5.0%，半混合培养过程维持有机碳源浓度以有机物质量浓度计为1.0%~2.0%。
11.按照权利要求1所述的方法，其特征在于:半混合培养的条件为温度20°C~37°C，pH值6~9。
12.按照权利要求1所述的方法，其特征在于:兼性厌氧细菌种子液培养至生物量OD值为5.0~15.0，微藻种子液培养至生物量OD值为2.0~10.0。
【文档编号】C12R1/145GK103773691SQ201210404148
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2012年10月23日 优先权日:2012年10月23日
【发明者】王领民, 金平, 廖莎, 吴丹, 李晓姝, 师文静, 张霖, 高大成, 乔凯, 程国香 申请人:中国石油化工股份有限公司, 中国石油化工股份有限公司抚顺石油化工研究院