专利名称：一对双钩巢粉虱特异性ss-coi引物及快速pcr检测方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域，具体地，本发明ー对双钩巢粉虱特异性SS-COI引物及快速PCR检测方法和试剂盒。
背景技术：
双钩巢粉風Paraleyrodes pseudonaranjae Martin,属同翅目、粉風科、巢粉風属，是ー种世界性检疫害虫。双钩巢粉虱的植物寄主较多，有30科49属63种，分别为芸香科9种,桑科6种,豆科和菌草科各5种,大戟科4种，番蒸枝科3种,棕榈科、樟科、桃金娘科、藤黄科、杜鹃花科、野牡丹科及无患子科各2种，旅人蕉科、蝶形花科、漆树科、菊科、三白草科、锦葵科、使君子科、木棉科、木兰科、杜英科、榆科、买麻藤科、山茶科、冬青科、金缕梅科、五爺科、菝葜科等各I种。其中，樟科Lauraceae、旅人蕉科Strelitziaceae、使君子科 Combretaceae、木棉科 Bombacaceae、菊科 Compositae、木兰科 Magnoliaceae 和杜英科Elaeocarpaceae等7科为双钩巢粉風寄主植物的首次报道,新记录寄主植物15种。而且，随着双钩巢粉虱入侵区域的逐渐扩大和定居时间的推移，其寄主植物的种类和危害程度有进ー步増加的趋势。双钩巢粉虱以成虫和若虫进行为害，其危害方式主要包括两个方面。其ー是直接危害，即，以成虫和若虫在叶片背面及正面刺吸寄主植物汁液，由于其繁殖能力強，发育速度快，虫ロ密度大，使寄主植物的生长发育严重受阻，叶片变黄、畸形乃至提前落叶，长势明显衰弱；其ニ是间接危害，即，成虫和若虫在寄主植物叶片背面分泌大量的蜡粉、蜡丝和蜜露，使叶片背面呈现一片雪白，并同时诱发严重的煤烟病，使叶片表面覆盖ー层黑色霉层，严重影响寄主植物叶片的光合作用、呼吸作用以及蒸腾作用，降低了产品的产量和质量。此外，成虫和若虫分泌大量白色蜡粉、蜡丝，严重影响了花卉及绿化树木的观赏价值。如双钩巢粉在入侵我国香港仅3年后，就对柑橘类果树以及观赏植物杜鹃产生严重危害；而在海南，入侵不足I年便对番荔枝、番石榴、柑橘、油梨、椰子、槟榔、榄仁树等的生长发育产生了极大的不利影响，对我国观赏植物及果树苗木的出口贸易构成了严重威胁。 双钩巢粉虱原产于南美洲，已在佛罗里达、夏威夷、百慕大和香港定居。1996年在香港发现时，仅危害几种植物，且发生量很低，但3年后就使柑橘类和杜鹃的生产遭受重仓1J。我国于2006年9月在海南省三亚市和文昌市首次发现双钩巢粉虱为害椰子，2007年8月在广西省南宁市发现其危害柑橘，2008年在广东省广州市的砂糖橘和柚子上发现其成虫和若虫的危害；截止2009年，双钩巢粉虱已在海南省的18个县市有不同程度的发生，并对20科29属37种植物产生不同程度的危害；其中，番荔枝、番石榴、椰子、槟榔、油梨、柑桔等受害最为严重。双钩巢粉虱是传入我国的另ー种外来入侵害虫，鉴于其目前仅在我国香港、广东、广西、海南发现，而且一旦发生即可造成严重危害，并在我国具有进ー步扩散和蔓延的趋势。而人为传播是双钩巢粉虱扩散蔓延的主要方式，因此加强对双钩巢粉虱的检疫和监测检测是杜绝其进一歩传播扩散的根本途径。双钩巢粉虱体型微小，雌性成虫体长0. 96-1. Ilmm,雄性个体稍小；卵长0. 26-0. 31mm，淡黄色，半透明；初孵若虫体长0. 37-0. 42mm，鲜黄色，具淡黄白色区域；卵及初孵若虫肉眼均难以发现。而加强检疫和监测检测必需建立ー套快速准确的分子检测方法。目前国际上用于双钩巢粉虱鉴定的方法主要有I)形态特征鉴定；2) COI测序等。但目前国内针对双钩巢粉虱尚没有标准的检测方法。COI技术曾用于鉴别双钩巢粉虱及其近缘种。mtDNA COI技术检测是利用通用型的引物，在DNA聚合酶的催化下，对目标DNA进行体外扩增，然后将PCR产物回收、纯化、测序，根据序列比对和系统发育树构建来 判断检测結果。SS-COI PCR技术检测是在mtDNA COI技术的基础上发展起来的特异序列扩增区域标记，是利用特异性的引物，根据预期DNA条带的有无来判断检测結果，无需测序和序列比对，具有灵敏度高、特异性强、快速、简便且重现性和稳定性强等优点。
发明内容
本发明的目的为提供一对双钩巢粉虱特异性SS-COI引物。本发明的另ー目的是提供双钩巢粉虱SS-COI特异性片段。本发明的另ー目的为提供一种双钩巢粉虱的特异性快速PCR检测方法。本发明的再一目的为提供一种双钩巢粉虱的特异性快速检测试剂盒。本发明根据双钩巢粉虱的线粒体DNA序列，设计ー对种特异性引物，该引物只对双钩巢粉虱具有扩增能力。是对双钩巢粉虱mtDNA COI技术检测方法的补充和改进。同吋，本方法采用SS-COI PCR技术，提高了检测的准确性和灵敏度，节约了检测时间，在双钩巢粉虱检测/监测方面具有很高的应用价值，可以试剂盒的形式在我国ロ岸、有机果蔬生产基地、鲜切花生产基地，以及蔬菜、观赏植物和果树种苗/植株等的调运中推广。根据本发明的一对双钩巢粉虱特异性SS-COI引物为引物PPZYF :5' -TAAAGGAACTAATCAATTTCCAAATCCC-3' (SEQ ID No. I);和引物PPZYR :5' -GGTCAACAAATCATAAAGATATTGGGT-3' (SEQ ID No. 2)。根据本发明的双钩巢粉虱SS-COI特异性片段，其序列如SEQ ID No. 3所示。因此，根据本发明的双钩巢粉虱种特异性检测方法包括使用上述SS-COI引物进行PCR扩增的步骤，或者，所述方法包括使用探针与上述特异性片段进行杂交的步骤。根据本发明的双钩巢粉虱种特异性检测试剂盒包括上述双钩巢粉虱特异性SS-COI引物。或者，根据本发明的双钩巢粉虱种特异性检测试剂盒包括上述双钩巢粉虱SS-COI特异性片段(SEQ ID No. 3所示)。本领域普通技术人员利用分子杂交技术进行双钩巢粉虱种特异性检测时，可以根据本领域的公知常识设计与本申请的双钩巢粉虱特异性片段(SEQ ID No. 3所示)特异性杂交的探针。本发明的双钩巢粉虱种特异性SS-COI引物及快速PCR检测方法，用于快速检测双钩巢粉虱。与国际现有方法相比，本发明具有以下的技术优势I)检测准确性高。本方法根据双钩巢粉虱种特异性SS-COI标记设计的引物PPZYF和PPZYR，在PCR快速检测双钩巢粉虱时，可扩增出233bp的片段，不仅对双钩巢粉虱的单头成虫和ニ龄、三龄、四龄若虫可以进行检测，对于单粒卵和单头初孵若虫也能准确检測。2)操作简便快捷。本发明采用PCR技术，操作过程简单、快速、高效。一般整个过程可在5个小时内完成。
3)特异性强。本发明设计的引物可特异性检测双钩巢粉虱，在其近缘种、属粉虱中无扩增产物。因此本方法实用性强，可满足植物检疫及害虫监测/检测的需要。
图I为引物PPZYF/PPZYR对双钩巢粉虱及其近缘种、属粉虱的SS-COI PCR扩增结果，M:分子量标准 Trans2K ; I:双钩巢粉風 Paraleyrodes pseudonaranjae Martin ；2: ZHJ-I型烟粉虱；3:ZHJ-2型烟粉虱；4:B型烟粉虱；5:Q型烟粉虱；6:温室粉虱;7 黑刺粉虱；8:柑橘粉虱；9:螺旋粉虱；10:阴性对照(超纯水)。·
图2为引物PPZYF/PPZYR对双钩巢粉虱不同虫态和性别的SS-COI PCR扩增結果，M:分子量标准Trans2K ;1:单粒卵；2: —龄若虫；3: ニ龄若虫；4:三龄若虫；5:四龄若虫；6:雄性成虫；7:雌性成虫；8:阴性对照(超纯水)。图3为引物PPZYF/PPZYR对双钩巢粉虱检测阈值的測定，M:分子量标准 Trans2K ;1-9 分别为 1:1/320; 2:1/640; 3:1/1280; 4:1/2560; 5:1/5120; 6:1/10240; 7:1/20480; 8:1/40960; 9:1/81920 头雌性成虫;10:阴性对照(超纯水)。
具体实施例方式实施例I :引物PPZYF/PPZYR对双钩巢粉虱的扩增效果I)粉虱模板DNA的制备将单头粉虱置于滴有20iiL提取缓冲液(50mM Tris-HCl, I mM EDTA、1%SDS、20mMNaCl, pH 8.0)的parafilm膜上，以0. 2mL的PCR管底部作为匀浆器充分研磨，匀浆液以微量移液器移入I. 5mL离心管；然后以200 u L缓冲液分2次清洗匀浆器，移入同一离心管，混匀，加入5iiL蛋白酶K(20mg/mL)，充分混匀后于60° C水浴Ih(中途混匀I次)；然后沸水浴8min,加入220 u L氯仿/异戊醇(V: V=24:1)抽提液,轻柔混匀数十次后,冰上放置30min ;4° C、12000r/min离心20min,取上清液,加入440 u L预冷的无水こ醇,轻轻混匀，待出现少量絮状沉淀后于-20° C放置30min ;4° C、12000r/min离心15min，小心弃去上清液。加入500 ii L预冷的75%こ醇洗漆,4° C、12000r/min离心15min,小心弃去上清液；然后将离心管倒扣于洁净滤纸上，自然干燥20min后每管加入20 y L超纯水，充分溶解后于-40° C保存备用。2)检验双钩巢粉虱的特异性引物的合成Primer PPZYF 5' -TAAAGGAACTAATCAATTTCCAAATCCC-3'PrimerPPZYRj' -GGTCAACAAATCATAAAGATATTGGGT-3'由上海生エ生物工程技术服务有限公司合成。3) PCR扩增反应反应体系为20ii L，其中 10XPCR buffer (含 Mg2+) 2. 0 ii L、dNTP (IOmM) 0. 4 ii L、Taq聚合酶(2. 5U/ u L) 0. 15 ii L、上游引物和下游引物(IOuM)各0. 5 y L、模板DNA1. 0 y L、超纯水 15. 45 u L04) PCR扩增程序
94。C 预变性 5min ;30 个循环94。C 30sec、61° C 30sec、72。C 40sec ;最后72。C 延伸 5min。5) PCR产物的鉴定取3 ii L PCR产物用I. 5% (重量/体积)琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化こ锭染色后于凝胶成像系统根据扩增产物的大小判定結果。结果利用引物primer PPZYF/PPZYR以双钩巢粉虱线粒体DNA为模板，以不同生物型的烟粉虱(包括=ZHJ-I型、ZHJ-2型、B型、Q型)以及温室粉虱、黑刺粉虱、柑橘粉虱、螺旋粉虱等4种其他常见种类的粉虱为对照进行SS-COI PCR扩增。在I泳道的双钩巢粉虱中扩增出了 233bp的目的条带(见图I的I泳道)，在其他8种近缘种、属的粉虱中均无扩增产物。说明我们所筛选的来自双钩巢粉虱线粒体DNA的特异性SS-COI PCR扩增引物的特异性強。 SEQ ID No. 3 taaaggaact aatcaatttc caaatccccc gataactaaa ggcatagtta taaaaaaaat 60tattaaaaaa gcatgagaag taactaaaac attatataat tgatcactta ttataaaaga 120tccaatattc ctcaattcca ttcgaattat caaacttaat gaggttccta ataaccctct 180tcaaattcca aaaataaaat ataataaccc aatatcttta tgatttgttg acc233实施例2 :引物PPZYF/PPZYR对双钩巢粉虱不同虫态和性别的扩增效果I)双钩巢粉虱模板DNA的制备将不同虫态和性别的单头/单粒双钩巢粉虱置于滴有20 提取缓冲液(50mMTr i s-HCl、I mM EDTA、l%SDS、20mMNaCl, pH 8.0)的 parafilm 膜上，以 0. 2mL 的 PCR管底部作为匀浆器充分研磨，匀浆液以微量移液器移入I. 5mL离心管；然后以200 u L缓冲液分2次清洗匀浆器，移入同一离心管，混匀，加入5 y L蛋白酶K(20mg/mL)，充分混匀后于60° C水浴Ih(中途混匀I次)；然后沸水浴8min，加入220iiL氯仿/异戊醇(V:V=24:1)抽提液，轻柔混匀数十次后，冰上放置30min ;4° C、12000r/min离心20min，取上清液，加入440 L预冷的无水こ醇，轻轻混匀，待出现少量絮状沉淀后于-20° C放置30min;4° C、12000r/min离心15min，小心弃去上清液。加入500 u L预冷的75%こ醇洗涤，4° C、12000r/min离心15min，小心弃去上清液；然后将离心管倒扣于洁净滤纸上，自然干燥20min后每管加入20 ii L超纯水,充分溶解后于-40° C保存备用。2)检验双钩巢粉虱的特异性引物的合成 Primer PPZYF 5' -TAAAGGAACTAATCAATTTCCAAATCCC-3'PrimerPPZYRj' -GGTCAACAAATCATAAAGATATTGGGT-3'由上海生エ生物工程技术服务有限公司合成。3) PCR扩增反应反应体系为20ii L，其中 10XPCR buffer (含 Mg2+) 2. 0 ii L、dNTP (IOmM) 0. 4 ii L、Taq聚合酶(2. 5U/ u L) 0. 15 ii L、上游引物和下游引物(IOuM)各0. 5 y L、模板DNA1. 0 y L、超纯水 15. 45 u L04) PCR扩增程序94。C 预变性 5min ;30 个循环94。C 30sec、61。C 30sec、72。C 40sec ;最后72。C 延伸 5min。
5) PCR产物的鉴定取3 ii L PCR产物用I. 5% (重量/体积)琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化こ锭染色后于凝胶成像系统根据扩增产物的大小判定結果。结果利用引物PPZYF/PPZYR以不同虫态和性别的双钩巢粉虱线粒体DNA为模板进行PCR扩增。双钩巢粉虱的雌性成虫和雄性成虫均扩增出了 233bp的目的条带(见附图2的7、6泳道)；同时双钩巢粉虱的单头四龄若虫、三龄幼虫、ニ龄幼虫、初孵若虫以及单粒卵也扩增出了 233bp的目的条带(见附图2的5、4、3、2、1泳道)，说明我们所筛选的双钩巢粉虱的种特异性SS-COI PCR扩增弓I物的准确性高。实施例3 :引物PPZYF/PPZYR对双钩巢粉虱检测阈值的测定I)双钩巢粉虱模板DNA的制备 将单头双钩巢粉虱雌性成虫置于滴有20 ii L提取缓冲液(50mM Tris-HCl, ImMEDTA、l%SDS、20mMNaCl，pH 8.0)的parafilm膜上，以0. 2mL的PCR管底部作为匀浆器充分研磨，匀浆液以微量移液器移入I. 5mL离心管；然后以200 y L缓冲液分2次清洗匀浆器，移入同一离心管，混勻，加入5 u L蛋白酶K(20mg/mL),充分混勻后于60° C水浴Ih(中途混匀I次)；然后沸水浴8min，加入220iiL氯仿/异戊醇(V:V=24:1)抽提液，轻柔混匀数十次后，冰上放置30min ;4° C、12000r/min离心20min,取上清液,加入440 u L预冷的无水こ醇，轻轻混匀，待出现少量絮状沉淀后于-20° C放置30min ;4° C、12000r/min离心15min，小心弃去上清液。カロ入500 ii L预冷的75%こ醇洗漆,4° C、12000r/min离心15min,小心弃去上清液；然后将离心管倒扣于洁净滤纸上，自然干燥20min后姆管加入20 y L超纯水。原模板溶液稀释为1/320头后以2倍进行递减梯度稀释至1/81920头，取I y L作为PCR扩增的模板，直接加到PCR反应体系中。2)检验双钩巢粉虱的特异性引物的合成Primer PPZYF :5' -TAAAGGAACTAATCAATTTCCAAATCCC-3'PrimerPPZYRj' -GGTCAACAAATCATAAAGATATTGGGT-3'由上海生エ生物工程技术服务有限公司合成。3) PCR扩增反应反应体系为20ii L，其中 10XPCR buffer (含 Mg2+) 2. 0 ii L、dNTP (IOmM) 0. 4 ii L、Taq聚合酶(2. 5U/ u L) 0. 15 ii L、上游引物和下游引物(IOuM)各0. 5 y L、模板DNA1. 0 y L、超纯水 15. 45 u L04) PCR扩增程序94。C 预变性 5min ;30 个循环94。C 30sec、61。C 30sec、72。C 40sec ;最后72。C 延伸 5min。5) PCR产物的鉴定取3 ii L PCR产物用I. 5% (重量/体积)琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化こ锭染色后于凝胶成像系统根据扩增产物的大小判定結果。结果利用引物primer PPZYF/PPZYR做检测阈值的測定，以不同稀释倍数的双钩巢粉虱线粒体DNA为模板进行PCR扩增，能检测到的最低模板DNA浓度为1/40960头雌性成虫(见附图3)。
权利要求
1.一对双钩巢粉虱特异性SS-COI引物，其特征在于，所述引物序列为引物PPZYF :5'-TAAAGGAACTMTCAATTTCCMATCCC-3';和引物 PPZYR : 5' -GGTCMCAAATCATAMGATATTGGGT-3'。
2.双钩巢粉虱SS-COI特异性片段，其特征在于，所述片段的序列如SEQID No. 3所示。
3.—种双钩巢粉虱特异性检测方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求I所述SS-COI引物进行PCR扩增的步骤。
4.一种双钩巢粉虱特异性检测方法，其特征在于，所述方法包括使用探针与权利要求2所述特异性片段进行杂交的步骤。
5.一种双钩巢粉虱检测特异性检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求I所述的双钩巢粉虱特异性SS-COI引物和/或用于检测权利要求2所述特异性片段的探针。
全文摘要
本发明涉及分子生物学领域，具体地，本发明涉及一对双钩巢粉虱特异性SS-COI引物及快速PCR检测方法和试剂盒。所述双钩巢粉虱特异性SS-COI引物为引物PPZYF5′-TAAAGGAACTAATCAATTTCCAAATCCC-3′；和引物PPZYR5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGGGT-3′。本方法根据双钩巢粉虱种特异性SS-COI标记设计的引物PPZYF和PPZYR，在PCR快速检测双钩巢粉虱时，可扩增出233bp的片段，不仅对双钩巢粉虱的单头成虫和二龄、三龄、四龄若虫可以进行检测，对于单粒卵和单头初孵若虫也能准确检测。
文档编号C12N15/11GK102952882SQ201210420799
公开日2013年3月6日 申请日期2012年10月30日 优先权日2012年9月24日
发明者张桂芬, 万方浩, 郭建洋, 郭建英, 刘万学, 曹凤勤 申请人:中国农业科学院植物保护研究所