专利名称：一种建立鸡永生化前脂肪细胞的方法
技术领域：
本发明涉及建立鸡的永生化前脂肪细胞的方法。
背景技术：
脂肪不仅是能量储藏组织，而且是机体生长发育过程中重要的内分泌器官。脂肪的功能发生紊乱可导致肥胖症，并可引发代谢综合症以及多种复杂疾病，如糖尿病、动脉粥样硬化、血脂异常、高血压和恶性肿瘤等。由于肥胖症及其相关疾病在全球发病率逐年上升，脂肪细胞分化和脂肪细胞功能研究成为了当今生命科学研究的热点。在农业生产领域，腹脂过度蓄积是肉鸡业生产的一个难题。为了解决实际生产中肉鸡腹脂过度蓄积的问题，培育优质低脂肉鸡，我们需要有针对性地开展肉鸡腹部脂肪细胞分化的研究。目前，鸡脂肪细胞分化研究仍然依赖于体外培养的原代鸡前脂肪细胞，而原 代培养的细胞本身存在不能无限传代、异质性(混合了巨噬细胞、间皮细胞或者其它一些细胞类型)、不同来源的细胞存在遗传背景差异等难以克服的缺点和不足，从而导致了研究难以获得稳定可靠的结果。脂肪细胞分化的理想研究模型是永生化的前脂肪细胞。与体外培养的原代细胞相比，永生化的前脂肪细胞既具有无限增殖能力，又具有正常前脂肪细胞的特征，它能提供大量稳定均一、性状一致的细胞来源，排除由于不同发育阶段、不同生理条件以及不同细胞群体间的影响，保证了研究的重复性和可比性。目前，人类已通过多种方法建立了人(包括白色脂肪和棕色脂肪)、鼠、牛和猪等物种的永生化前脂肪细胞系，而鸡的永生化前脂肪细胞至今尚未建立。建立永生化细胞系主要有自发突变、射线照射、化学诱变、病毒感染、病毒癌基因转导和端粒酶活性重建等方法，其中端粒酶活性重建被认为是目前建立永生化细胞的首选方法。人的端粒酶基因hTERT已被广泛用于人及多种哺乳动物细胞的永生化。截至目前，国内、外尚无应用hTERT建立鸡永生化前脂肪细胞的研究报道，更无利用鸡的端粒酶逆转录酶(chTERT)和端粒酶RNA (chTR)建立鸡永生化前脂肪细胞的报道。
发明内容
本发明是要解决原代鸡前脂肪细胞不能无限传代、异质性、不同来源的细胞存在遗传背景差异等导致研究难以获得稳定可靠的结果的问题而提供一种建立永生化的鸡前脂肪细胞的方法。本发明一种建立鸡永生化前脂肪细胞的方法按以下步骤进行一、克隆chTERT的全长编码区序列首先利用RNA提取试剂盒提取4日龄AA肉鸡鸡胚组织总RNA，采用反转录试剂盒将提取的鸡胚组织总RNA进行反转录得到鸡胚组织cDNA，分别设计三对扩增引物，以鸡胚组织cDNA为模板，分三段PCR扩增chTERT的全部编码区序列chTERT_Tl、chTERT_T2和chTERT-T3，将三段扩增产物分别经I %琼脂糖凝胶电泳检测及胶回收试剂盒进行回收、纯化，设计PCR扩增引物P7并利用重叠延伸PCR的方法将chTERT-Tl和chTERT_T2两个片段拼接起来，得到 chTERT-TIT2，将 chTERT_TlT2 连接至 pMD18_TSimple 载体，将 chTERT_T3连接至PMD18-T载体，然后将两种连接产物分别转化TOPlO感受态细胞，进行阳性克隆子的筛选与鉴定，将鉴定结果为阳性的菌液分别扩培并提取质粒DNA得到PMD18TS-T1T2与PMD18T-T3，然后对pMD18TS-TlT2质粒进行SalI-NcoI双酶切鉴定，对pMD18T_T3质粒进行SalI-NcoI和SalI-XhoI双酶切鉴定，酶切鉴定无误后将质粒送交测序公司进行测序，验证目的基因的正确性，将测序正确的PMD18TS-T1T2质粒和pMD18T_T3质粒分别进行SalI-NcoI双酶切，分别回收chTERT-TlT2片段与pMD18T_T3载体片段，将回收得到的chTERT-TlT2 片段与 pMD18T_T3 载体片段连接，得到 pMD18T_chTERT ；二、克隆鸡端粒酶RNA基因chT R 利用AA肉鸡基因组DNA为模板，以P8和P9为引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，然后采用胶回收试剂盒进行回收、纯化，获得chTR的基因序列，将chTR与TA克隆载体pMD18-T进行连接，将连接产物转化TOPlO感受态细胞，然后进行阳性克隆子的筛选与鉴定，将鉴定结果为阳性的菌液进行扩培并提取质粒DNA得到pMD18T-chTR,然后对pMD18T-chTR质粒进行BglII-Cla I双酶切鉴定，酶切鉴定无误后将质粒送交测序公司进行测序，验证目的基因chTR的正确性；三、构建逆转录病毒表达载体分别对pMD18T_chTERT和病毒载体pLXRN进行SalI-XhoI双酶切，分别回收chTERT和pLXRN的线性DNA片段并连接，构建了表达chTERT基因的逆转录病毒载体pLXRN-chTERT,分别对 pMD18T_chTR 和 pLPCX 进行 BglII-Cla I 双酶切，分别回收 chTR 和PLPCX的线性DNA片段并连接，构建了表达chTR基因的逆转录病毒载体pLPCX_chTR，将构建好的表达chTERT基因的逆转录病毒载体pLXRN-chTERT和表达chTR基因的逆转录病毒载体pLPCX-chTR送交测序公司进行测序，再次验证目的基因克隆和载体构建的正确性；四、包装制备逆转录病毒采用转染试剂将步骤三中制备的表达chTERT基因的逆转录病毒载体pLXRN-chTERT和表达chTR基因的逆转录病毒载体pLPCX-chTR分别与被膜蛋白载体PVSV-G共转染包装细胞GP2-293，培养细胞，在24h、48h和72h收集细胞上清，过滤去除细胞碎片后加入病毒浓缩试剂，离心浓缩病毒，得到了分别表达chTERT基因的逆转录病毒和表达chTR基因的逆转录病毒，测定两种逆转录病毒的滴度，_80°C保存备用；五、逆转录病毒的感染和筛选培养原代鸡前脂肪细胞，按照5X105cellS/ml的细胞密度铺于培养皿中，用步骤四制备的表达chTERT基因的逆转录病毒感染原代鸡前脂肪细胞，感染48h后加入含有400 μ g/ml G418的选择培养基筛选表达chTERT基因的阳性细胞，对表达chTERT基因的阳性细胞换液培养6个月可获得永生化鸡前脂肪细胞系ICPA-I ;或者先用步骤四制备的表达chTERT基因的逆转录病毒感染原代鸡前脂肪细胞，感染48h后加入含有400 μ g/mlG418的选择培养基筛选表达chTERT基因的阳性细胞，筛选结束后将表达chTERT基因的阳性细胞重新铺板，加入步骤四制备的表达chTR基因的逆转录病毒，感染48h后加入含有2. 5 μ g/ml嘌呤霉素的选择培养基筛选表达chTERT基因和chTR基因的阳性细胞，对表达chTERT基因和chTR基因的阳性细胞传代培养2至3代，即可获得永生化鸡前脂肪细胞系ICPA-2 ；其中步骤一中PCR扩增ChTERT-Tl片段所用上游引物Pl为5’-AAGTCGACCGTGGGGCCCGCTGCACGGCAG-3’，下游引物 P2 为 5 ’-GCTCTGACTGGATAACTGCTGGAAGCAGATGGGCCGGGG-3 ’，步骤一中 PCR 扩增 chTERT-T2 所用上游引物 P3 为 5 ’-TTCCAGCAGTTATCCAGTCAGAGCGAAGTCATC-3’，下游引物 P4 为 5’ -CCATACGCAGTCATTCACTCTCATCTTCCACATC-3’，步骤一中 PCR 扩增chTERT-T3 所用上游引物 P5 为 5’ -GCCATAACAAATGCCGGTTCTTTAAAAACGTG-3’，下游引物 P6为 5’-CGCTCGAGAGACCTTCATCCCTTAGTCCAG-3’，步骤一中重叠延伸 PCR 扩增 chTERT_TlT2 片段所用上游引物P7为5’ -GTCGACTTGTGGGGTCCGCTGCAC-3’，下游引物为P4 ；其中步骤二中PCR扩增鸡端粒酶RNA基因chTR所用上游引物P8为5’_ACGCGTCGACACGCGTGGCGGGTGGAAGGC-3’，下游引物 P9 为 5’ -CCGCTCGAGGCGTGTGGGAGCGACGCCGTC-3’。发明效果本发明一种建立鸡永生化前脂肪细胞的方法通过导入chTERT基因(或先后导入chTERT基因和chTR基因)激活了鸡前脂肪细胞自身的端粒酶活性，能够迅速、有效的建立永生化的鸡前脂肪细胞，所建立的永生化鸡前脂肪细胞成功越过了复制衰老，获得了永生性，并且该永生化鸡前脂肪细胞保持了与原代鸡前脂肪细胞十分相近的表型，保持了细胞 运动的接触抑制和细胞增殖的密度限制，体外利用油酸诱导能够分化形成脂滴，并能够冻存和长期保存。
图I是具体实施方式
一中利用Sal I、Xho I限制性内切酶对pLXRN-chTERT逆转录病毒表达载体质粒进行双酶切后1%琼脂糖凝胶电泳检测图片，其中，M为DNA MarkerDL10000，I为双酶切后的产物，2为pLXRN-chTERT逆转录病毒表达载体质粒；图2是具体实施方式
一中利用Bgl II、Cla I限制性内切酶对pLPCX-chTR逆转录病毒表达载体质粒进行双酶切后2%琼脂糖凝胶电泳检测图片，其中，M为DNA MarkerDL5000,1为双酶切后的产物，2为pLPCX-chTR逆转录病毒表达载体质粒；图3是具体实施方式
一中永生化鸡前脂肪细胞系ICPA-I和ICPA-2中chTERT基因的表达检测图，其中，I为ICPA-1，2为ICPA-2，3为CPA，4为pLXRN，5为β-actin ;图4是具体实施方式
一中永生化鸡前脂肪细胞系ICPA-I和ICPA-2中chTR基因的表达检测图，其中，I为ICPA-1，2为ICPA-2，3为CPA，4为pLPCX ；图5是具体实施方式
一中永生化鸡前脂肪细胞系ICPA-1、ICPA-2的生长曲线，其中，—为 ICPA-I，为 ICPA-II为 CPA_1，~^为 CPA-2 ；图6是具体实施方式
一中永生化鸡前脂肪细胞系ICPA-I在累积群体倍增数为22 (PD22)时的亚汇合形态学图；图7是具体实施方式
一中永生化鸡前脂肪细胞系ICPA-I在累积群体倍增数为22 (PD22)时的汇合形态学图；图8是具体实施方式
一中永生化鸡前脂肪细胞系ICPA-2在累积群体倍增数为6 (roe)时的亚汇合形态学图；图9是具体实施方式
一中永生化鸡前脂肪细胞系ICPA-2在累积群体倍增数为6 (roe)时的汇合形态学图；图10是具体实施方式
一中感染pLXRN病毒空载体的对照鸡前脂肪细胞在累积群体倍增数为2(ro2)时的形态学图11是具体实施方式
一中原代培养的鸡前脂肪细胞的形态学图；图12是具体实施方式
一中为I代鸡前脂肪细胞的形态学图；图13是具体实施方式
一中为3代鸡前脂肪细胞的形态学图；图14是具体实施方式
一中永生化鸡前脂肪细胞系ICPA-I、ICPA-2端粒酶活性的检测结果图；其中，Positive为2000个Hela细胞所具有的端粒酶活性，ICPA-1为单独感染chTERT病毒获得的永生化鸡前脂肪细胞的 端粒酶活性、ICPA-2为先后感染chTERT病毒和chTR病毒获得的永生化鸡前脂肪细胞的端粒酶活性，chTR为单独感染chTR病毒的鸡前脂肪细胞的端粒酶活性，PLXRN为感染pLXRN病毒空载体的鸡前脂肪细胞的端粒酶活性，PLPCX为感染pLPCX病毒空载体的鸡前脂肪细胞的端粒酶活性，带有HT标记为热失活后的样品；MTC为端粒酶阴性对照，NTC为无模板对照；图15是具体实施方式
一中永生化鸡前脂肪细胞系ICPA-I在群体倍增数为29 (PD29)时的衰老检测图；图16是具体实施方式
一中原代鸡前脂肪细胞在群体倍增数为8 (PD8)时的衰老检测图；图17是具体实施方式
一中永生化鸡前脂肪细胞系ICPA-2在群体倍增数为13 (PD13)时的衰老检测图；图18是具体实施方式
一中感染pLXRN病毒空载体的鸡前脂肪细胞在群体倍增数为2(ro2)时的衰老检测图；图19是具体实施方式
一中对永生化鸡前脂肪细胞ICPA-I进行体外油酸诱导分化图；图20是具体实施方式
一中对永生化鸡前脂肪细胞ICPA-2进行体外油酸诱导分化图；图21是具体实施方式
一中对永生化鸡前脂肪细胞ICPA-I进行油红氧染色的结果图；其中，I为经过油酸诱导的ICPA-I细胞进行油红氧染色的结果图，2为未经过油酸诱导的ICPA-I细胞进行油红氧染色的结果图；图22是具体实施方式
一中对永生化鸡前脂肪细胞ICPA-2进行油红氧染色的结果图；其中，I为经过油酸诱导的ICPA-2细胞进行油红氧染色的结果图，2为未经过油酸诱导的ICPA-2细胞进行油红氧染色的结果图；图23是具体实施方式
一中对永生化鸡前脂肪细胞ICPA-I进行油红氧提取比色的结果图，其中，I为经过油酸诱导的ICPA-I细胞进行油红氧提取后在510nm下的比色值，2为未经油酸诱导的ICPA-I细胞进行油红氧提取后在510nm下的比色值。
具体实施例方式具体实施方式
一本实施方式建立鸡永生化前脂肪细胞的方法按以下步骤进行一、克隆chTERT的全长编码区序列首先利用RNA提取试剂盒提取4日龄AA肉鸡鸡胚组织总RNA，采用反转录试剂盒将提取的鸡胚组织总RNA进行反转录得到鸡胚组织cDNA，分别设计三对扩增引物，以鸡胚组织cDNA为模板，分三段PCR扩增chTERT的全部编码区序列chTERT-Tl、chTERT_T2和chTERT-T3，将三段扩增产物分别经I %琼脂糖凝胶电泳检测及胶回收试剂盒进行回收、纯化，设计PCR扩增引物P7并利用重叠延伸PCR的方法将chTERT-Tl和chTERT_T2两个片段拼接起来，得到 chTERT-T IT2，将 chTERT-T IT2 连接至 pMD18_TSimple 载体，将 chTERT_T3连接至PMD18-T载体，然后将两种连接产物分别转化TOPlO感受态细胞，进行阳性克隆子的筛选与鉴定，将鉴定结果为阳性的菌液分别扩培并提取质粒DNA得到PMD18TS-T1T2与PMD18T-T3，然后对pMD18TS-TlT2质粒进行SalI-NcoI双酶切鉴定，对pMD18T_T3质粒进行SalI-NcoI和SalI-XhoI双酶切鉴定，酶切鉴定无误后将质粒送交测序公司进行测序，验证目的基因的正确性，将测序正确的PMD18TS-T1T2质粒和pMD18T_T3质粒分别进行SalI-NcoI双酶切，分别回收chTERT-TlT2片段与pMD18T_T3载体片段，将回收得到的chTERT-TlT2 片段与 pMD18T_T3 载体片段连接，得到 pMD18T_chTERT ；二、克隆鸡端粒酶RNA基因chTR 利用AA肉鸡基因组DNA为模板，以P8和P9为引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，然后采用胶回收试剂盒进行回收、纯化，获得chTR的基因序列，将chTR与TA克隆载体pMD18-T进行连接，将连接产物转化TOPlO感受态细胞，然后 进行阳性克隆子的筛选与鉴定，将鉴定结果为阳性的菌液进行扩培并提取质粒DNA得到pMD18T-chTR，然后对pMD18T-chTR质粒进行Bgl II-Cla I双酶切鉴定，酶切鉴定无误后将质粒送交测序公司进行测序，验证目的基因chTR的正确性；三、构建逆转录病毒表达载体 分别对pMD18T_chTERT和病毒载体pLXRN进行SalI-XhoI双酶切，分别回收chTERT和pLXRN的线性DNA片段并连接，构建了表达chTERT基因的逆转录病毒载体pLXRN-chTERT，分别对 pMD18T-chTR 和 pLPCX 进行 Bgl II-Cla I 双酶切，分别回收 chTR 和pLPCX的线性DNA片段并连接，构建了表达chTR基因的逆转录病毒载体pLPCX-chTR，将构建好的表达chTERT基因的逆转录病毒载体pLXRN-chTERT和表达chTR基因的逆转录病毒载体pLPCX-chTR送交测序公司进行测序，再次验证目的基因克隆和载体构建的正确性；四、包装制备逆转录病毒采用转染试剂将步骤三中制备的表达chTERT基因的逆转录病毒载体pLXRN-chTERT和表达chTR基因的逆转录病毒载体pLPCX-chTR分别与被膜蛋白载体PVSV-G共转染包装细胞GP2-293，培养细胞，在24h、48h和72h收集细胞上清，过滤去除细胞碎片后加入病毒浓缩试剂，离心浓缩病毒，得到了分别表达chTERT基因的逆转录病毒和表达chTR基因的逆转录病毒，测定两种逆转录病毒的滴度，_80°C保存备用；五、逆转录病毒的感染和筛选培养原代鸡前脂肪细胞，按照5X105cellS/ml的细胞密度铺于培养皿中，用步骤四制备的表达chTERT基因的逆转录病毒感染原代鸡前脂肪细胞，感染48h后加入含有400 μ g/ml G418的选择培养基筛选表达chTERT基因的阳性细胞，对表达chTERT基因的阳性细胞换液培养6个月可获得永生化鸡前脂肪细胞系ICPA-I ;或者先用步骤四制备的表达chTERT基因的逆转录病毒感染原代鸡前脂肪细胞，感染48h后加入含有400 μ g/mlG418的选择培养基筛选表达chTERT基因的阳性细胞，筛选结束后将表达chTERT基因的阳性细胞重新铺板，加入步骤四制备的表达chTR基因的逆转录病毒，感染48h后加入含有2. 5 μ g/ml嘌呤霉素的选择培养基筛选表达chTERT基因和chTR基因的阳性细胞，对表达chTERT基因和chTR基因的阳性细胞传代培养2至3代，即可获得永生化鸡前脂肪细胞系ICPA-2 ；其中步骤一中PCR扩增chTERT-Tl片段所用上游引物Pl为5’-AAGTCGACCGTGGGGCCCGCTGCACGGCAG-3’，下游引物 P2 为 5’-GCTCTGACTGGATAACTGCTGGAAGCAGATGGGCCGGGG-3’，步骤一中 PCR 扩增 chTERT-T2 所用上游引物 P3 为 5 ’-TTCCAGCAGTTATCCAGTCAGAGCGAAGTCATC-3’，下游引物 P4 为 5’ -CCATACGCAGTCATTCACTCTCATCTTCCACATC-3’，步骤一中 PCR 扩增chTERT-T3 所用上游引物 P5 为 5’ -GCCATAACAAATGCCGGTTCTTTAAAAACGTG-3’，下游引物 P6为 5’-CGCTCGAGAGACCTTCATCCCTTAGTCCAG-3’，步骤一中重叠延伸 PCR 扩增 chTERT_TlT2 片段所用上游引物P7为5’ -GTCGACTTGTGGGGTCCGCTGCAC-3’，下游引物为P4 ；其中步骤二中PCR扩 增鸡端粒酶RNA基因chTR所用上游引物P8为5’_ACGCGTCGACACGCGTGGCGGGTGGAAGGC-3’，下游引物 P9 为 5’ -CCGCTCGAGGCGTGTGGGAGCGACGCCGTC-3’。本实施方式效果本发明一种建立鸡永生化前脂肪细胞的方法通过导入chTERT基因(或先后导入chTERT基因和chTR基因)激活了鸡前脂肪细胞自身的端粒酶活性，能够迅速、有效的建立永生化的鸡前脂肪细胞，所建立的永生化鸡前脂肪细胞成功越过了复制衰老，获得了永生性，并且该永生化鸡前脂肪细胞保持了与原代鸡前脂肪细胞十分相近的表型，保持了细胞运动的接触抑制和细胞增殖的密度限制，体外利用油酸诱导能够分化形成脂滴，并能够冻存和长期保存。本实施方式步骤一中的chTERT基因的全长编码区序列为GenBank中发表的原鸡端粒酶逆转录酶(chTERT)mRNA序列NM_001031007，其序列如Seq ID No 1所示，本实施方式步骤二中的chTR基因序列为GenBank中发表的原鸡端粒酶RNA(chTR)序列NR_001594，其序列如Seq ID No 2所不； 本实施方式步骤一中提取4日龄AA肉鸡鸡胚组织总RNA的试剂盒为购买自OMEGA公司的OMEGA E. Z. N. A. Total RNA Kit II，具体操作步骤参照说明书；步骤一中使用的反转录试剂盒为购买自Promega公司的Promega ImProm-II,具体操作步骤参照说明书；步骤一中使用的胶回收试剂盒为购买自Axygen公司的AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒,具体操作步骤参照说明书；本实施方式中的大肠杆菌TOPlO感受态细胞购买自哈尔滨海基公司；本实施方式中的转化方法为热激法；质粒DNA提取使用的试剂盒购买自Axygen公司的AxyPrep质粒DNA小量提取试剂盒；AA肉鸡购买自哈尔滨益农禽业有限公司；本实施方式中的pLXRN和pLPCX逆转录病毒表达载体、pVSV-G被膜蛋白载体、GP2-293病毒包装细胞购买自Clontech公司；本实施方式中pMD18-T Simple载体和pMD18_T载体购买自TaKaRa公司；本实施方式中细胞端粒酶活性检测试剂盒购买自Chemicon公司的TRAPEZERTTelomerase Detection Kit,具体操作步骤参照说明书；本实施方式中的细胞衰老检测试剂盒为碧云天公司的细胞衰老半乳糖苷酶染色试剂盒，具体操作步骤参照说明书；本实施方式所用的完全培养基成分为DMEM/F12添加了 100units/ml的青霉素G钠，100 μ g/ml的链霉素和10%的胎牛血清，其中DMEM/F12购买自Gibco公司，胎牛血清购买自TBD公司。本实施方式所用的选择培养基成分为完全培养基添加了终浓度为400 μ g/ml的G418或者完全培养基添加了终浓度为2. 5 μ g/ml Puromycin,其中G418和Puromycin购买自Clontech公司。本实施方式步骤四中包装制备chTERT和chTR逆转录病毒的具体步骤如下(I)提取逆转录病毒载体 pLXRN-chTERT、pLPCX-chTR、pLXRN 和 pLPCX 的高纯质粒，_20°C冻存；(2)选择罗氏FuGENE HD转染试剂进行细胞转染，具体步骤按照说明书操作；(3)转染前12 24h将GP2-293细胞接种在25cm2细胞培养瓶中，待细胞生长至80%汇合时，配制转染混合液进行转染，转染后8 10小时吸出培养基，加入3ml完全培养基，分别在24h、48h和72h收集细胞上清； (4) 500 X g、4°C离心10分钟，或经0.45 μ m滤器(低蛋白结合)过滤，去除细胞碎片;(5)将所有病毒上清转移至50ml离心管中，按照I体积病毒液加入4体积浓缩试剂的比例加入Retro-X Concentrator病毒浓缩试剂,轻轻混勻，置于4°C孵育过夜；(6) 1500父8、4。(离心4511^11;(7)移除上清，不要搅动管壁，用原体积O. 5 1%的DMEM/F12培养基轻轻的再悬浮病毒沉淀，按感染用量将浓缩病毒分装到单独的EP管中以免反复冻融，最后将管冻存于-80°C备用；其中，步骤(3)中的转染混合液配制方法为(I)质粒DNA :逆转录病毒载体5 μ g，pVSV-G被膜蛋白载体5 μ g ;(2) FuGENE HD 转染试剂25 μ I ;(3) DMEM/F12培养基加至终体积500 μ I。本实施方式步骤四中测定逆转录病毒滴度的具体步骤如下(I)测定滴度前一天准备好ΝΙΗ3Τ3细胞将细胞铺于6孔板中，密度为每孔O. 5 I X IO5个细胞，每孔加2ml完全培养基；(2)准备20ml完全培养基并加入浓度为4mg/ml的聚凝胺60 μ I ;(3)按如下方法准备6组10倍病毒稀释液①加I. 35ml步骤(2)中制备的培养基到6个I. 5ml EP管中；②加150 μ I要测定滴度的病毒液到I管中，混合；③从I管中转移150 μ I病毒稀释液到2管中，混合，再转移150 μ I稀释液到下一个管中连续稀释；(4)感染NIH 3Τ3细胞分别将6组10倍稀释的病毒液各取Iml加入到步骤(I)中6孔板的I至6孔中；(5)感染24h后，使细胞在抗生素筛选浓度下培养一周；(6)病毒的滴度等于含有克隆的最高稀释度下的克隆数量X稀释倍数如在IO6稀释倍数下存在4个克隆可表示为4X 106cfu/ml。本实施方式步骤五中测定鸡前脂肪细胞的最佳药物筛选浓度和最佳细胞铺板密度的具体步骤如下A药物最佳筛选浓度的测定(I)将2X IO5的原代鸡前脂肪细胞铺于6孔板中，每孔加入2ml完全培养基，并加入终浓度为 O，50，100，200，400，800 μ g/ml 的 G418，或加入终浓度为 0，1，2· 5,5,7. 5，10 μ g/ml的Puro (嘌呤霉素)；(2)培养细胞10 14天，每四天更换一次选择培养基(或更频繁)；(3)每两天检查一次细胞活力；选择在5天内使得大量细胞死亡、在两周内杀死全部细胞的最低浓度作为该药物的最佳筛选浓度；B细胞最佳铺板密度的测定(I)按照 5 X IO6,1 X IO6, 5 X IO5, 2 X IO5,1 X IO5, 5 X IO4 的细胞密度将细胞铺于 6
孔板中，每孔加入2ml最佳浓度的选择培养基；(2)培养细胞5 14天，每四天更换一次选择培养基；(3)每两天检查一次细胞活力；选择细胞大量死亡之前(大约5天)汇合度达到80%的铺板密度作为该细胞的最佳铺板密度，测定结果见表I :表I
权利要求
1.一种建立鸡永生化前脂肪细胞的方法，其特征在于建立鸡永生化前脂肪细胞的方法按以下步骤实现 一、克隆ChTERT的全长编码区序列 首先利用RNA提取试剂盒提取4日龄AA肉鸡鸡胚组织总RNA，采用反转录试剂盒将提取的鸡胚组织总RNA进行反转录得到鸡胚组织cDNA，分别设计三对扩增引物，以鸡胚组织cDNA为模板，分三段PCR扩增chTERT的全部编码区序列chTERT_Tl、chTERT_T2和chTERT-T3，将三段扩增产物分别经1%琼脂糖凝胶电泳检测及胶回收试剂盒进行回收、纯化，设计PCR扩增引物P7并利用重叠延伸PCR的方法将chTERT-Tl和chTERT_T2两个片段拼接起来，得到 chTERT-TlT2，将 chTERT_TlT2 连接至 pMD18_T Simple 载体，将 chTERT_T3连接至PMD18-T载体，然后将两种连接产物分别转化TOPlO感受态细胞，进行阳性克隆子的筛选与鉴定，将鉴定结果为阳性的菌液分别扩培并提取质粒DNA得到PMD18TS-T1T2与PMD18T-T3，然后对pMD18TS-TlT2质粒进行SalI-NcoI双酶切鉴定，对pMD18T_T3质粒进行SalI-NcoI和SalI-XhoI双酶切鉴定，酶切鉴定无误后将质粒送交测序公司进行测序，验证目的基因的正确性，将测序正确的PMD18TS-T1T2质粒和pMD18T_T3质粒分别进行SalI-NcoI双酶切，分别回收chTERT-TlT2片段与pMD18T_T3载体片段，将回收得到的chTERT-TlT2 片段与 pMD18T_T3 载体片段连接，得到 pMD18T_chTERT ； 二、克隆鸡端粒酶RNA基因chTR 利用AA肉鸡基因组DNA为模板，以P8和P9为引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，然后采用胶回收试剂盒进行回收、纯化，获得chTR的基因序列，将chTR与TA克隆载体pMD18-T进行连接，将连接产物转化TOPlO感受态细胞，然后进行阳性克隆子的筛选与鉴定，将鉴定结果为阳性的菌液进行扩培并提取质粒DNA得到pMD18T-chTR，然后对pMD18T-chTR质粒进行Bgl II -Cla I双酶切鉴定，酶切鉴定无误后将质粒送交测序公司进行测序，验证目的基因chTR的正确性； 三、构建逆转录病毒表达载体 分别对pMD18T-chTERT和病毒载体pLXRN进行SalI-XhoI双酶切，分别回收chTERT和PLXRN的线性DNA片段并连接，构建了表达chTERT基因的逆转录病毒载体pLXRN-chTERT，分别对pMD18T-chTR和pLPCX进行Bgl II -Cla I双酶切，分别回收chTR和pLPCX的线性DNA片段并连接，构建了表达chTR基因的逆转录病毒载体pLPCX-chTR，将构建好的表达chTERT基因的逆转录病毒载体pLXRN-chTERT和表达chTR基因的逆转录病毒载体pLPCX-chTR送交测序公司进行测序，再次验证目的基因克隆和载体构建的正确性； 四、包装制备逆转录病毒 采用转染试剂将步骤三中制备的表达chTERT基因的逆转录病毒载体pLXRN-chTERT和表达chTR基因的逆转录病毒载体pLPCX-chTR分别与被膜蛋白载体pVSV_G共转染包装细胞GP2-293，培养细胞，在24h、48h和72h收集细胞上清，过滤去除细胞碎片后加入病毒浓缩试剂，离心浓缩病毒，得到了分别表达chTERT基因的逆转录病毒和表达chTR基因的逆转录病毒，测定两种逆转录病毒的滴度，-80°C保存备用； 五、逆转录病毒的感染和筛选 培养原代鸡前脂肪细胞，按照5X105cellS/ml的细胞密度铺于培养皿中，用步骤四制备的表达chTERT基因的逆转录病毒感染原代鸡前脂肪细胞，感染48h后加入含有400 μ g/mlG418的选择培养基筛选表达chTERT基因的阳性细胞，对表达chTERT基因的阳性细胞换液培养6个月可获得永生化鸡前脂肪细胞系ICPA-I ;或者先用步骤四制备的表达chTERT基因的逆转录病毒感染原代鸡前脂肪细胞，感染48h后加入含有400 μ g/ml G418的选择培养基筛选表达chTERT基因的阳性细胞，筛选结束后将表达chTERT基因的阳性细胞重新铺板，加入步骤四制备的表达chTR基因的逆转录病毒，感染48h后加入含有2. 5 μ g/ml嘌呤霉素的选择培养基筛选表达chTERT基因和chTR基因的阳性细胞，对表达chTERT基因和chTR基因的阳性细胞传代培养2至3代，即可获得永生化鸡前脂肪细胞系ICPA-2 ； 其中步骤一中PCR扩增chTERT-Tl片段所用上游引物Pl为5’ -AAGTCGACCGTGGGGCCCGCTGCACGGCAG-3’，下游引物 P2 为 5’ -GCTCTGACTGGATAACTGCTGGAAGCAGATGGGCCGGGG-3’，步骤一中 PCR 扩增 chTERT-T2 所用上游引物 P3 为 5 ’-TTCCAGCAGTTATCCAGTCAGAGCGAAGTCATC-3’，下游引物 P4 为 5’ -CCATACGCAGTCATTCACTCTCATCTTCCACATC-3’，步骤一中 PCR 扩增chTERT-T3 所用上游引物 P5 为 5’ -GCCATAACAAATGCCGGTTCTTTAAAAACGTG-3’，下游引物 P6为 5’-CGCTCGAGAGACCTTCATCCCTTAGTCCAG-3’，步骤一中重叠延伸 PCR 扩增 chTERT_TlT2 片段所用上游引物P7为5’ -GTCGACTTGTGGGGTCCGCTGCAC-3’，下游引物为P4 ； 其中步骤二中PCR扩增鸡端粒酶RNA基因chTR所用上游引物P8为5 ’-ACGCGTCGACACGCGTGGCGGGTGGAAGGC-3’，下游引物 P9 为 5’ -CCGCTCGAGGCGTGTGGGAGCGACGCCGTC-3’。
2.根据权利要求I所述的一种建立鸡永生化前脂肪细胞的方法，其特征在于步骤一中PCR扩增chTERT的编码区序列chTERT-Tl的反应体系为50 μ L，由下列成分组成
3.根据权利要求I所述的一种建立鸡永生化前脂肪细胞的方法，其特征在于步骤一中PCR扩增chTERT的编码区序列chTERT-T2的反应体系为50 μ L，由下列成分组成
4.根据权利要求I所述的一种建立鸡永生化前脂肪细胞的方法，其特征在于步骤一中PCR扩增chTERT的编码区序列chTERT-T3的反应体系为50 μ L，由下列成分组成
5.根据权利要求I所述的一种建立鸡永生化前脂肪细胞的方法，其特征在于步骤一中利用重叠延伸PCR的方法将chTERT-Tl与chTERT-T2的PCR扩增产物连接获得chTERT-TlT2,反应体系为50 μ L，由下列成分组成
6.根据权利要求I所述的一种建立鸡永生化前脂肪细胞的方法，其特征在于步骤二中PCR扩增鸡端粒酶RNA基因chTR的反应体系为50 μ L，由下列成分组成
7.根据权利要求I所述的一种建立鸡永生化前脂肪细胞的方法，其特征在于步骤一中PMD18TS-T1T2质粒和pMD18T_T3质粒分别进行SalI-NcoI双酶切反应体系如下成分用量 pMD18TS-TlT2 质粒或 pMD丨 8T-T3 质粒(^L 限制性核酸内切酶Sail 限制性核酸内切酶NcolI μIOxTbuffer3μL 0.1% BSA2ill 无菌水7pL 酶切反应条件37°C水浴，反应lh。
8.根据权利要求I所述的一种建立鸡永生化前脂肪细胞的方法，其特征在于步骤一中PMD18T-T3质粒、步骤三中pMD18T-chTERT质粒和步骤三中pLXRN病毒载体质粒分别进行SalI-XhoI双酶切反应体系如下成分用量 pMD18T-T3 质粒或 pMD18T-chTERT 质粒 6μ1, 或pLXRN病毒载体质粒限制性核酸内切酶SallI μ 限制性核酸内切酶JftoIΙμΙ IOx H buffer2‘uL 无囷水IOpL 酶切反应条件37°C水浴，反应lh。
9.根据权利要求I所述的一种建立鸡永生化前脂肪细胞的方法，其特征在于步骤二中pMD18T-chTR质粒、步骤三中pMD18T-chTR质粒和步骤三中pLPCX病毒载体质粒分别进行Bgl II -Cla I双酶切反应体系如下 成分用量pMD18T-chTR质粒或pLPCX病毒载体质粒6μ 限制性核酸内切酶BgfllIpL 限制性核酸内切酶ClalΙμIOx H buffer2μΙ. 无菌水iOpL 酶切反应条件37°C水浴，反应lh。
全文摘要
一种建立鸡永生化前脂肪细胞的方法，本发明涉及建立鸡永生化前脂肪细胞的方法。本发明是要解决原代鸡前脂肪细胞不能无限传代、异质性、不同来源的细胞存在遗传背景差异等导致研究难以获得稳定可靠的结果的问题。一、克隆鸡端粒酶逆转录酶基因chTERT；二、克隆鸡端粒酶RNA基因chTR；三、构建逆转录病毒表达载体；四、包装制备逆转录病毒；五、永生化鸡前脂肪细胞系ICPA-1和永生化鸡前脂肪细胞系ICPA-2的获得。本发明应用于建立鸡永生化前脂肪细胞领域。
文档编号C12N15/867GK102876717SQ201210420889
公开日2013年1月16日 申请日期2012年10月29日 优先权日2012年10月29日
发明者王伟, 李辉, 闫晓红, 王宁 申请人:东北农业大学