专利名称：冬虫夏草中国被毛孢合成乙酸的酶、基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种来自“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢的参与乙酰辅酶A出发合成代谢乙酰基-酰基载体蛋白的脂肪-酰基辅酶A合酶(Acyl-coenzyme A synthetase),编码这个酶的基因及其应用，乙酰基-酰基载体蛋白可再经过水解生成乙酸。
背景技术：
冬虫夏草(Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc.)是冬虫夏草菌寄生在鱗翅目(Lepidoptera)蝙蝠蛾科昆虫(Hepialus armoricanus Oberthur)幼虫上的子座及幼虫尸体上的复合体(包括子座和虫体)。冬虫夏草是一类珍惜的传统真菌药材资源，具有代谢产物和生物活性多样的特点，在生物医药领域展现出巨大的应用和发展前景。冬虫夏草以其多种药用功效广泛、明显而备受关注，在世界范围内备受推崇。中医认为，冬虫夏草入肺肾二经，既能补肺阴，又能补肾阳，主治肾虚，阳痿遗精，腰膝酸痛，病后虚弱，久咳虚弱，劳咳痰血，自汗盗汗等，是唯一的一种能同时平衡、调节阴阳的中药。现代药理学已证实，冬虫夏草具有免疫调节、抗菌、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖血脂、性激素样作用等广泛的生物活性。冬虫夏草菌是一种子囊菌，在其生活史中具有分生孢子阶段(无性型)和子囊孢子阶段(有性型)。而在人工培养、液体发酵等实际生产中使用的是无性阶段的冬虫夏草菌，因而冬虫夏草无性型的鉴定非常重要。国内外学者在冬虫夏草资源调查、无性型确证、活性成分分离分析和作用机理、开发应用方面做了大量工作。冬虫夏草中国被毛孢已被证明是冬虫夏草的无性型存在形式，具有与天然冬虫夏草相同的活性成分和药效。天然虫草具有严格的寄生性以及特殊的生态环境，故其产量很低，价格高昂。野生冬虫夏草由于受生长环境等因素制约，资源匮乏。由于近几年在人工栽培上进展不大，野生冬虫夏草代用品研究多集中在液体发酵上。利用液体深层发酵培养冬虫夏草菌丝体、提取物或发酵液，是解决冬虫夏草药源的一种有效途径。虫草发酵生产虫草替代品，既可有效保护虫草这一珍贵资源，又不受气候、地理环境和虫草寄生条件严格的限制，适合于工业化大规模生产。生产出的替代品如菌丝体其成分和药效也与天然虫草相似，因而国内外一直致力于虫草菌丝体的发酵培养。人工发酵培养冬虫夏草中国被毛孢得到的菌丝，经毒理、药理、植化研究，证明与天然虫草化学组成、药理作用基本一致，可代替天然虫草生产虫草制品，以弥补自然资源的短缺，通过对发酵条件的优化，菌丝体生物量和代谢产物的量均有明显提闻。近年来，随着天然产物化学和现代色谱技术的飞速发展，在对虫草产品研发中已逐步由虫草原料或粗提物的直接利用转向更深层次的功能性代谢产物研究。国内外已对虫草代谢产物做了大量的研究，代谢产物主要包括核苷、多糖、多肽、留醇等几大类化合物，其中嘌呤类核苷、虫草多糖、甘露醇等具有代表性的功能性代谢产物在生物合成、药理作用等方面的研究初见成效。不饱和脂肪酸是指分子中含有一个或多个双键的脂肪酸，其熔点较饱和脂肪酸低。不饱和脂肪酸是构成体内脂肪的一种脂肪酸，人体必需的脂肪酸，不饱和脂肪酸根据双键个数的不同，分为单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸二种。多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated Fatty Acids, PUFAs)相对饱和脂肪酸来说具有更多的功效,它可以降低血中胆固醇和甘油三酯，调节心脏功能，降低血液黏稠度，改善血液微循环，提高脑细胞的活性，增强记忆力和思维能力，增强人体防御系统的功能等，此外它还可以排除人体内多余的“垃圾”，也就是由于摄人了过量的饱和脂肪酸形成的多余脂肪，从而达到减肥的目的。因此，其潜在的医用药用价值受到了世界的广泛关注，引起了食品、医药甚至化妆品等行业的高度重视。1999 年 Yung-Sheng 引克隆了高山被抱霉(Mortiere Uaalpina)的Λ 6 和Λ 12脂肪酸脱氢酶基因并在酿酒酵母中进行了表达。2004年，Dyer等人将桐树中的Λ 3去饱和酶转入酵母，成功地获得了产亚麻酸的酵母菌。2007年Maal1-Amiri等人将藻青菌(Cyanobacterium)的Λ 12去饱和酶转入马铃薯,成功检测到马铃薯脂肪酸成分发生了明显变化。2008年，Hao等人将卷枝毛霉的Λ 6去饱和酶转人转基因烟草中，成功获得了高产Y-亚麻酸的菌株。此外，还有许多脂肪酸去饱和酶相关的基因被克隆并转化应用。由于大部分去饱和酶为膜结合蛋白，其分离纯化十分困难，已经分离纯化并鉴定的去饱和酶屈指可数，而绝大多数的研究是围绕去饱和酶基因及其表达调控来进行的。目前，所应用的不饱和脂肪酸生产菌以枯草芽孢杆菌为主，而作为重要合成代谢不饱和脂肪酸的冬虫夏草菌，还只停留在代谢产物成分分析和功效的研究上，对冬虫夏草菌不饱和脂肪酸合成代谢途径中相关基因和蛋白的研究还很少见。
发明内容
本发明目的在于针对以上存在的不足和需要解决的技术问题，对“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢合成代谢乙酸的酶及其编码基因进行深入研究，提供了“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢参与乙酰辅酶A出发合成代谢乙酰基-酰基载体蛋白的酶、编码基因及其应用。本发明采用的技术方案是:一种参与乙酰辅酶A出发合成代谢乙酰基-酰基载体蛋白的脂肪-酰基辅酶A合酶，与SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.3所示序列具有90%以上同源性。由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.3所示氨基酸序列的肽蛋白的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该肽蛋白的片段或肽蛋白变体与前述氨基酸序列同源性在90%以上，均属于本发明保护范围之列。具体的所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。优选的，所述脂肪-酰基辅酶A合酶氨基酸序列如SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.3所示(分别记为UnsA1,UnsA2蛋白);该酶可催化乙酰辅酶A和酰基-载体蛋白制备相应的乙酰基-酰基载体蛋白，乙酰基-酰基载体蛋白再经过水解酶的作用生成乙酸。本发明述脂肪-酰基辅酶A合 酶来自“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢。由乙酰辅酶A合成代谢获得对应乙酰基-酰基载体蛋白、乙酰基-酰基载体蛋白水解获得乙酸的路径如下所示(HS-R中的R为酰基载体蛋白Acyl-carrier protein):
权利要求
1.一种参与乙酰辅酶A合成代谢乙酰基-酰基载体蛋白的脂肪-酰基辅酶A合酶，与SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.3所示序列具有90%以上同源性。
2.如权利要求1所述的脂肪-酰基辅酶A合酶，其特征在于所述脂肪-酰基辅酶A合酶的氨基酸序列如SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.3所示。
3.如权利要求1或2所述的脂肪-酰基辅酶A合酶，其特征在于该酶来自“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢。
4.如权利要求1或2所述的脂肪-酰基辅酶A合酶在生物催化制备乙酸中的应用。
5.编码权利要求1或2所述脂肪-酰基辅酶A合酶的基因。
6.如权利要求5所述的基因，其特征在于所述基因的核苷酸序列如SEQID N0.2或SEQID N0.4 所示。
7.如权利要求5所述的基因在构建能够生物催化乙酰辅酶A制备乙酰基-酰基载体蛋白的基因工程菌中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种来自“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢参与从乙酰辅酶A出发合成代谢乙酰基-酰基载体蛋白的酶，编码这个酶的基因及其应用。所述脂肪-酰基辅酶A合酶的氨基酸序列与SEQ ID No.1或SEQ ID No.3所示的蛋白具有90%以上同源性。本发明从原理上对乙酰辅酶A合成乙酰基-酰基载体蛋白的代谢途径进行了详细研究，提供了“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢参与乙酰辅酶A出发合成代谢乙酰基-酰基载体蛋白的酶及其编码基因，本发明所提供的核苷酸序列的克隆DNA可以用来通过转导、转化、结合转移的方法转入工程菌中，通过调节乙酰基-酰基载体蛋白生物合成基因的表达，赋予宿主脂肪-酰基辅酶A合酶的高表达性，为扩大乙酸的产量提供了有效途径，具有重大应用前景。
文档编号C12N15/54GK103074311SQ201210424658
公开日2013年5月1日 申请日期2012年10月30日 优先权日2012年10月30日
发明者郑裕国, 柳志强, 吴晖, 李邦良, 许静, 林善, 许峰, 薛亚平, 袁水金, 王鸿艳 申请人:浙江工业大学, 杭州中美华东制药有限公司