专利名称：一种1,4-β-D-木聚糖酶突变体的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程和酶工程领域，具体内容涉及耐热性提高的l，4-13-D-木聚糖酶突变体。
背景技术：
木聚糖酶(endo-1, 4-β-xylanases, EC 3.2. 1.8)以内切方式水解木聚糖分子中的β -1, 4-糖苷键，生成低聚木糖和木糖，是半纤维素水解酶系中最关键的水解酶之一，在工业上具有重要的应用价值。自上世纪80年代木聚糖酶开始工业应用以来，木聚糖酶的应用领域不断扩大，目前已经在饲料、制浆造纸、食品、能源等行业中得到广泛应用。随着木聚糖酶的应用范围进一步拓展，工业上对其现有性能提出了更高的要求，如长时间内保持 活性稳定，在极端环境中保持高的活性(极端温度或者PH值等)或者可以接受不同的底物(包括非天然底物)。其中酶的热稳定性对于工业应用来说十分重要，而且高温条件下，酶的反应速度更快，能缩短反应周期，节约成本，也有利于避免反应过程中被其他微生物污染。随着蛋白质工程技术和分子生物学的发展，运用定向进化和理性设计的手段对酶分子进行人工进化和改造已成为当前酶工程领域研究的热点。到目前为止，已有许多学者运用这项技术成功的改造了各种各样的酶，取得了令人瞩目的进展(Zhao，2007，Biotechnogy and Bioengineering 98 (2)，271-275)。其中易错 PCR(error-prone PCR)、DNA改组(DNA shuffling)、半理性设计等已成为酶的分子改造中常用的手段，大大加速了蛋白质的进化过程(Lehmann and ffyss, 2001 Current Opinion in Biotechnology12(4)，371-375)。
发明内容
本发明的目的在于采用定向进化技术同时结合基于序列比对的半理性设计方法对来源于Geobacillus stearothermophiIus的1，4_ β-D-木聚糖酶XT6进行分子改造,获得热稳定性提高的木聚糖酶突变体。为达到上述目的，本发明使用多轮易错PCR方法、DNA改组技术对1，4-β- _木聚糖酶ΧΤ6基因进行突变，再通过高通量筛选方法将正突变检出，同时使用半理性设计方法确定部分潜在热稳定相关位点，再通过定点突变方法得到热稳定相关突变体。本发明的具体实施方法为来源于G. stearothermophiIus (Genbank登录号为Z29080)的木聚糖酶 XT6 由 379 个氨基酸组成(Lapidot, Mechaly et al.，1996Journal of Biotechnogy 51 (3), 259-264)(见 SEQ IDN0.1)。为迅速得到 XT6 全基因序列并提高其在大肠杆菌中的表达量，以利于对XT6酶分子的改造，根据已报道的XT6基因序列信息(Gat, Lapidot et al. , 1994 Applied and Environmental Microbiology60(6)，1889-1896)，采用基于PCR的全基因合成方法合成了木聚糖酶XT6全基因序列。同时根据大肠杆菌密码子偏好性对其DNA序列进行优化(在线软件DNAWorks，http://helixweb. nih. gov/dnaworks/,优化合成的的木聚糖酶XT6基因序列为SEQ ID NO. 2),功能正常的酶蛋白在大肠杆菌BL21-DE3中过量表达Zhang, Peiet al. , 2009 Chinese Journalof Applied and Environmental Biology 15 (2)，271-275)。米用易错 PCR 方法、DNA 改组技术对其进行随机突变，以PET 28a (+)载体构建高效突变库，再将含有突变基因的质粒转入表达宿主E. coli BL21-DE3中，挑选单克隆于96孔板中表达蛋白。离心重悬后，取部分菌液加入1%浓度木聚糖底物反应适当时间后，以DNS法终止反应，测定酶活性。同时，另取部分菌液热处理一定时间，测定残余活性。残余活性高于对照的菌株转接到新的96孔培养板中，进行重复筛选。将筛选得到的残余活性高于对照的菌株，送上海英骏生物技术有限公司测序，获得突变体DNA序列信息。详细方案见实施例2。同时采用基于序列比对的半理性设计方法获得热稳定突变体((Lehmann, Loch etal. , 2002 Proteinengineering 15 (5), 403-411)。具体做法为，首先将XT6氨基酸序列与其 他不同来源的17条木聚糖酶氨基酸序列进行比对，初步确定有可能影响酶稳定性的位点，通过定点突变得到各个位点的单点突变体，测定其热失活半衰期，并与野生型比较，得到酶热稳定性的突变体F360L。详细方案见实施例6。经上述对构建的突变文库筛选以及半理性设计方法，获得20个热稳定性提高的突变体，分别为 IOE11、05D03、09D05、08A07、05R)3、04D08、04F06、04H09、08G01、06B01、04D03、03B11、04H12、02E04、06H07、F360L、FAM、FAMG, FTAMG 和 FC06T，序列信息见 SEQ IDNO. 3-N0. 22，其特征如下
IOEll :该酶的第53位的苯丙氨酸突变为酪氨酸(DNA序列由TTT变为TAT)。05D03 :该酶的第257位的丙氨酸突变为缬氨酸(GCA变为GAT)、第271位的蛋氨酸突变为异亮氨酸(ATG变为ΑΤΑ)。09D05 :该酶的第121位的苏氨酸突变为异亮氨酸(ACC变为ATC)、第364位的甘氨酸突变为天冬氨酸(GGC变为GAC)。08Α07 :该酶的第271位的蛋氨酸突变为异亮氨酸(ATG变为ΑΤΑ)。05F03 :该酶的257位的丙氨酸突变为缬氨酸(GCA变为GTA)、第271位的蛋氨酸突变为异亮氨酸(ATG变为ΑΤΑ)、第364位的甘氨酸突变为天冬氨酸(GGC变为GAC)。04D08 :该酶的第53位的苯丙氨酸突变为酪氨酸(TTT变为ΤΑΤ)、第73位的赖氨酸突变为异亮氨酸(AAA变为ΑΤΑ)、第257位的丙氨酸突变为缬氨酸(GCA变为GTA)、第271位的蛋氨酸突变为异亮氨酸(ATG变为ΑΤΑ)。04F06 :该酶的第53位的苯丙氨酸突变为酪氨酸(TTT变为ΤΑΤ)、第364位的甘氨酸突变为天冬氨酸(GGC变为GAC)、第380位的赖氨酸突变为苏氨酸(AAA变为ACA)。04Η09 :该酶的第53位的苯丙氨酸突变为酪氨酸(TTT变为ΤΑΤ)、第257位的丙氨酸突变为缬氨酸(GCA变为GTA)、第271位的蛋氨酸突变为异亮氨酸(ATG变为ΑΤΑ)、第380位的赖氨酸突变为异亮氨酸(AAA变为ΑΤΑ)。08G01 :该酶的第53位的苯丙氨酸突变为酪氨酸(TTT变为ΤΑΤ)、第113位的谷氨酸突变为天冬氨酸(GAA变为GAT)、第257位的丙氨酸突变为缬氨酸(GCA变为GTA)、第271位的蛋氨酸突变为异亮氨酸(ATG变为ΑΤΑ)。06Β01 :该酶的第213位的苏氨酸突变为异亮氨酸(ACT变为ATT)、第257位的丙氨酸突变为亮氨酸(GCA变为TTA)、第271位的蛋氨酸突变为异亮氨酸(ATG变为ΑΤΑ)、第364位的甘氨酸突变为天冬氨酸(GGC变为GAC)。04D03 :该酶的第26位的赖氨酸突变为异亮氨酸(AAA变为ΑΤΑ)、第53位的苯丙氨酸突变为酪氨酸(TTT变为ΤΑΤ)、第257位的丙氨酸突变为缬氨酸(GCA变为GTA)、第271位的蛋氨酸突变为异亮氨酸(ATG变为ΑΤΑ)、第364位的甘氨酸突变为天冬氨酸(GGC变为GAC )。03Β11 :该酶的第138位的谷氨酸突变为天冬氨酸(GAA变为GAC)、第257位的丙氨酸突变为缬氨酸(GCA变为GTA)、第271位的蛋氨酸突变为异亮氨酸，(ATG变为ΑΤΑ)、第364位的甘氨酸突变为天冬氨酸(GGC变为GAC)。04Η12 :该酶的第53位的苯丙氨酸突变为酪氨酸(TTT变为ΤΑΤ)、第116位的脯氨酸突变为苏氨酸(CCG变为ACG)、第257位的丙氨酸突变为缬氨酸(GCA变为GTA)、第271位的蛋氨酸突变为异亮氨酸(ATG变为ΑΤΑ)。02Ε04 :该酶的第17位的天冬酰胺突变为赖氨酸(AAC变为ΑΑΑ)、第53位的苯丙氨酸突变为酪氨酸(TTT变为ΤΑΤ)、第257位的丙氨酸突变为缬氨酸(GCA变为GTA)、第271位的蛋氨酸突变为异亮氨酸(ATG变为ΑΤΑ)。06Η07 :该酶的第53位的苯丙氨酸突变为酪氨酸(TTT变为ΤΑΤ)、第73位的赖氨酸突变为异亮氨酸(AAA变为ΑΤΑ)、第121位的苏氨酸突变为异亮氨酸(ACC变为ATC)、第219位的缬氨酸突变为丙氨酸(GAT变为GCT )、第257位的丙氨酸突变为缬氨酸(GCA变为GTA)、第271位的蛋氨酸突变为异亮氨酸(ATG变为ΑΤΑ)、第364位的甘氨酸突变为天冬氨酸(GGC变为GAC)、第380位的赖氨酸突变为天冬酰胺(AAA变为AAC).
F360L :该酶的第361位的苯丙氨酸突变为亮氨酸(TTT变为ΤΤΑ)。FAM :该酶的第53位的苯丙氨酸突变为酪氨酸(TTT变为ΤΑΤ)、第257位的丙氨酸突变为缬氨酸(GCA变为GTA)、第271位的蛋氨酸突变为异亮氨酸(ATG变为ΑΤΑ)。FAMG :该酶的第53位的苯丙氨酸突变为酪氨酸(TTT变为ΤΑΤ)、第257位的丙氨酸突变为缬氨酸(GCA变为GTA)、第271位的蛋氨酸突变为异亮氨酸(ATG变为ΑΤΑ)、第364位的甘氨酸突变为天冬氨酸(GGC变为GAC)。FTAMG :该酶的第53位的苯丙氨酸突变为酪氨酸(TTT变为ΤΑΤ)、第121位的苏氨酸突变为异亮氨酸(ACC变为ATC)、第257位的丙氨酸突变为缬氨酸(GCA变为GTA)、第271位的蛋氨酸突变为异亮氨酸(ATG变为ΑΤΑ)、第364位的甘氨酸突变为天冬氨酸(GGC变为GAC )。FC06T :该酶的第17位的天冬酰胺突变为赖氨酸(AAC变为ΑΑΑ)、第26位的赖氨酸突变为异亮氨酸(AAA变为ΑΤΑ)、第53位的苯丙氨酸突变为酪氨酸(TTT变为ΤΑΤ)、第73位的赖氨酸突变为异亮氨酸(AAA变为ΑΤΑ)、第113位的谷氨酸突变为天冬氨酸(GAA变为GAT)、第121位的苏氨酸突变为异亮氨酸(ACC变为ATC)、第138位的谷氨酸突变为天冬氨酸(GAA变为GAC)、第219位的缬氨酸突变为丙氨酸(GAT变为GCT)、第257位的丙氨酸突变为缬氨酸(GCA变为GTA)、第271位的蛋氨酸突变为异亮氨酸(ATG变为ΑΤΑ)、第361位的苯丙氨酸突变为亮氨酸(TTT变为ΤΤΑ)、第364位的甘氨酸突变为天冬氨酸(GGC变为GAC)、第380位的赖氨酸突变为天冬酰胺(AAA变为AAC)。将上述突变体的基因连入载体pET 28a (+)，并在宿主细胞大肠杆菌Escherichiacoli BL21-DE3中表达，获得突变体酶蛋白。
相比野生型1，4- β -D-木聚糖酶ΧΤ6，本发明的20个突变体热稳定性明显提高，在75。C 的热失活半衰期(tl/2)分别提高了 2. 4,2. 5,2. 1,3. 1,5. 1,6. 7、8、8. 8,10. 4,9. 2、19. 9,13. 7,8. 5,10. 4,23,2. 3,7. 3、15、19和52倍，显示出在造纸制浆，生物能源等工业上
潜在的应用价值。
图1为包含所有已发现的热稳定相关突变位点的7个突变体不同温度下残余酶活的测定。图2为包含所有已发现的热稳定相关突变位点的7个突变体在不同温度下酶的反应速率测定。SEQ ID NO.1 为来源于 Geobacillus stearothermophiIus (Genebank 登录号为Z29080)的木聚糖酶XT6氨基酸序列，SEQ ID NO. 2为本发明优化的木聚糖酶基因XT6核苷·酸序列。SEQ ID NO. 3为突变体10E11的氨基酸序列。SEQ ID NO. 4为突变体05D03的氨
基酸序列。SEQ ID NO. 5为突变体09D05的氨基酸序列。SEQ ID NO. 6为突变体08A07的氨基酸序列。SEQ IDN0. 7为05F03的氨基酸序列。SEQ ID NO. 8为04D08的氨基酸序列。SEQID NO. 9为04R)6的氨基酸序列。SEQ ID NO. 10为04H09的氨基酸序列。SEQ ID NO. 11为08G01的氨基酸序列。SEQ ID NO. 12为06B01的氨基酸序列。SEQ ID NO. 13为04D03的氨基酸序列。SEQ ID NO. 14为03B11的氨基酸序列。SEQ IDN0. 15为04H12的氨基酸序列。SEQ ID NO. 16为02E04的氨基酸序列。SEQ ID NO. 17为06H07的氨基酸序列。SEQID NO. 18为F360L的氨基酸序列。SEQ ID NO. 19为FAM的氨基酸序列。SEQ ID NO. 20为FAMG的氨基酸序列。SEQ ID NO. 21为FTAMG的氨基酸序列。SEQ ID NO. 22为FC06T的氨基酸序列。
具体实施例方式以下结合实施实例对本发明做进一步说明，需要指出的是，本实施例仅用于解释本发明，而非对本发明范围的限制。实施例1易错PCR (error - prone PCR)方法构建木聚糖酶XT6突变文库
采用GeueMo]ph.tn RniKkim Mut:tgene.1f·: l.ut.以优化后的 XT6 (见 SEQ ID NO. 2)为
模板扩增1，4-β -D-木聚糖酶ΧΤ6基因，随机引入突变。所用引物为5'-TAGGAGGTCATATGAAAAATGCGGACAGCTATGCG-3'，
5' -ATACGCGGATCCCTATTTGTGATCAATGATCGCCCAATACGCCGGCTT-3'
反应条件为94° C预变性10min，94° C变性30s，60° C退火60s和72° C延伸2min，共25个循环，O. 8%琼脂糖电泳，试剂盒回收目的基因片段。按照NEB公司2007-2008产品目录说明书描述的方法，用Nde I和BamH III双酶切消化后，与经过相同酶切的pET 28a(+)载体(卡那霉素抗性基因)进行连接反应，反应条件为载体和片段按摩尔比1:3的比例混合，加入400个单位的T4连接酶，16° C过夜。电击法转入大肠杆菌DH10B，得到超过105个克隆的突变体库。实施例2木聚糖酶XT6突变体库的筛选将实施例1中突变库克隆收集后提取质粒，转入大肠杆菌表达菌株BL21-DE3，涂布含有卡那霉素的LB平板，培养12h。挑取单克隆于96孔板，每孔含有150 μ L TB培养基(含有50 μ g/mL卡纳霉素，ImMIPTG), 37° C，245rpm，震荡培养36h。96孔板复制器复制各单克隆于LB固体培养基平板，37° C培养12h后，4° C冰箱保存。用排枪轻轻吸出96孔板各孔中的细胞培养物，按相应位置分配于A板和B板的96孔板中，每块96孔板各孔中的培养物为70 μ L。4000rpm,4° C，离心lOmin，弃去上清，各孔中菌体细胞用30 μ L，50mM，pH 7.6的磷酸钠缓冲液重悬。A板直接加入50 μ L, 50mM, pH 7. 6的磷酸钠缓冲液配制的1%木聚糖底物，37° (，245印111，反应1.511，加入120 μ LDNS溶液，充分混匀后置于烘箱，显色，筛选酶活性高于野生型对照的突变体；Β板用保鲜膜封好，置于85° C烘箱，2h处理后迅速放置在-20° C，温度快速降至室温。加入50 μ L用50mM，pH 7. 6的磷酸钠缓冲液配制的l%xylan底物，37° C，245rpm，反应3h，加入120yL DNS溶液，加热显色。测定突变体残余活性，取残余活性比野生型XT6高的菌株到新的96孔培养板中，进行重复筛选。筛选到4个突变体，分别为10E11、05D03、09D05、08A07，残余活性是野生型对照的2_3倍，分别挑取单克隆送上海英骏生物技术公司测序。实施例3突变体和野生型热酶蛋白粗体物的制备和热稳定性的测定
3.1粗酶液制备和酶活测定方法
挑取筛选到的突变体单克隆于20mL 18(5011^/1^卡那霉素、1.01111 IPTG)、37° C培养并诱导36h后，6000rpm,离心IOmin收集菌体。弃去上清，12mL磷酸钠缓冲液(50mM,pH7. 6)
重悬菌体，超声波破碎细胞，提取酶蛋白粗提液。酶活测定10mL离心管中，反应体系为0. 2mL稀释的粗酶液(用磷酸盐缓冲液稀释50倍)，1. 8mL底物溶液(提前在50°C温浴30min)，50°C水浴，5min,再加入3mLDNS溶液终止反应，混匀后，沸水浴中煮沸5min，立即用冷水冷却至室温，540nm处测定吸光值。每个样品三个重复(Bailey, Bielyet al. , 1992 Journal of biotechnolgy 23 (3)，257-270)。酶活力单位定义在pH 7. 6,50°C条件下,每分钟产生Immol还原糖或者其相等物所需要的酶量为一个活力单位(U)。3. 2 XT6酶突变体热稳定性的测定
将蛋白浓度0. lmg/mL的粗酶液40mL置于容量250mL的PCR管，每个样品3个重复，用PCR仪在75 ° C处理不同的时间，然后将样品管放置于冰上冷却，4°C，12000rpm,离心25min，取适量处理后的酶液测定残余活性，测定方法见3.1。以未经过高温处理的酶液为参比，得到残余酶活百分比。以处理时间为X轴，残余酶活百分比的自然对数为Y轴，用origin75软件做散点图，添加趋势线，得到酶热处理时间与残余活性的线性方程，以残余50%的自然对数为3. 912023来计算得到相应的时间，此时间即为突变体的热失活半衰期tl/2。各突变体在pH 7.6,75° C条件下的热失活半衰期见表I。突变体10E11，05D03，09D05和08A07在75。C的热失活半衰期分别为野生型的2. 4,2. 5,2.1和3.1倍。将蛋白浓度0. lmg/ml的粗酶液300mL置于1. 5mL离心管中，每个样品3个重复，在pH 7. 6，不同温度下处理20min，迅速放置冰上冷却，4° C，12000rpm,离心25min，取适量酶液测定残余活性，参照实施案例3.1。在以未经过高温处理的酶液为参比，得到残余酶活百分比，结果见说明书附图2，与野生型比较，突变体10E11，05D03，09D05和08A07的热稳定性有显著提高，野生型木聚糖酶在72° C处理20min后，只剩下10%的活性，而4个突变体在相同条件下，仍能保持50%的残余活性。3. 3温度对酶突变体反应速率的影响
在pH 7.5条件下，测定木聚糖酶野生型和突变型在不同温度下的最大反应速率，酶的浓度为 O. lmg/mL，反应温度分别为 60° C，65° C，70° C，75° C，80° C，85° C，90° C，95° C。测定方法同3.1。以最大反应速率时的活性为100%，其他温度下测定的酶活与它的比值百分比为纵坐标，反应温度为横坐标，绘制酶活随反应温度变化的曲线。结果见说明书附图2。突变体1(^11，05003，09005和08八07在82° C具有最大反应速率，比野生型提高5。C。实施例4第二轮易错PCR突变文库的构建和筛选
4.1突变文库的构建 除以第一轮易错PCR筛选到的三个突变体IOEl1、0ro03、09D05提取质粒作第二轮易错PCR的模板外，随机突变体库的构建过程中，引物的选择，PCR反应条件，文库的构建同实施例I。结果得到超过105个克隆的随机突变体库。4. 2突变文库的筛选
将步骤4.1中构建得到的突变体转入大肠杆菌表达菌株BL21-DE3，筛选活性/热稳定正突变时以10E11、05D03、09D05为参照，热处理时间为150min，其余操作同实施例2，取活性/残余活性比突变型10E11、05D03、09D05、高的菌株到新的96孔培养板中，进行重复筛选。筛选到10个热稳定性提高的酶突变体，分别为05R)3、04D08、04R)6、04H09、08G01、06B01、04D03、03B11、04H12、02E04。挑取热稳定正突变体送于上海英骏生物技术有限公司测序。4. 3突变体热稳定性的测定
测定方法同实施例3. 2，结果(表I)表明，突变体05F03、04D08、04F06、04H09、08G01、06B01、04D03、03B11、04H12、02E04 在 75。C 的热失活半衰期是野生型的 5. 1,6. 7、8、8. 8、10. 4、9· 2、19· 9、13· 7、8· 5 和 10. 4 倍。实施例5XT6突变体基因DNA改组突变库的构建和筛选
5.1DNA改组突变库的构建
以筛选至Ij 的木聚糖酶 XT6 突变体 10Ell、0ro03、09D05、08A07、05F03、04D08、04F06、04H09、08G01、06B01、04D03、03B11、04H12、02E04 为模板，一对引物:
5' -GTGAGCGGATAACAATTCCC-3'，
5' -CCTCAAGACCCGTTTAGAGG-3'
分别扩增各突变体基因，反应条件为94° C预变性10min，94° C变性30s，60° C退火30s和72° C延伸2min，共25个循环，O. 8%琼脂糖电泳，试剂盒回收纯化目的基因。按照Stemmer的方法，DNase I将获得的DNA目的基因片段处理适当时间，回收5(Tl50bp的小片段(Stemmer, 1994 Proceedings of theNational Academy of Science of the UnitedStates of America 91 (22)，10747-10751)。经过无引物 PCR 和有引物 PCR，所用引物为:
5' -TAGGAGGTCATATGAAAAATGCGGACAGCTATGCG-3'，
5' -ATACGCGGATCCCTATTTGTGATCAATGATCGCCCAATACGCCGGCTT-3'
得到重组后的全长目的基因。DNA改组突变文库的构建方法同实施例1，获得超过105个克隆的突变体库。
5. 2 DNA改组突变库的筛选
筛选正突变以第二轮易错PCR中获得的热稳定性最高的突变体04D03为参照，热处理时间为240min，其余操作同实施例2，取残余活性比突变型04D03高的菌株到新的96孔培养板中，进行重复筛选。筛选到突变体06H07。送于上海英骏生物技术有限公司测序。5. 3突变体热稳定性的测定
测定方法同实施例3. 2，结果(表I)表明，突变体06H07热稳定性和野生型相比有很大的提高，在75° C条件下的热失活半衰期是野生型的23倍。实施例6基于序列比对的半理性设计
将木聚糖酶XT6氨基酸序列与蛋白质文库(SwissPort)中已知的FlO家族17个亲缘关系比较近的木聚糖酶氨基酸序列进行比对(表2)。在这17个不同来源的木聚糖酶氨基 酸序列中，9个木聚糖酶来源于嗜热菌，8个来自中温细菌。他们的氨基酸序列和木聚糖酶XT6相比，氨基酸相似度在40%-75%之间。序列比对所用软件为Clustal X。比对结果发现，木聚糖酶XT6氨基酸序列中Phe95, Ilel52, Tyr200, Asn262,Phe361和Ile376位的氨基酸在其同源木聚糖酶氨基酸序列相应位置占多数的氨基酸分别为Gly，Val, Phe, He, Leu和Val。定点突变方法改变这些位点，所用引物
XYL94-F 5' -GGCATGGATATTCGTGGTCACACCCTGGTGTGG-3'
XYL94-R 5' -CCACACCAGGGTGTGACCACGAATATCCATGCC-3'
XYL151-F 5/ -GAACGTTATAAGGATGATGTAAAGTACTGGGATGTAG-3'
XYL151-R : 5' -CTACATCCCAGTACTTTACATCATCCTTATAACGTTC-3'
XYL199-F 5' -GGCGATAACATTAAGTTATTCATGAATGACTACAATACCG-3'
XYL199-R 5/ -CGGTATTGTAGTCATTCATGAATAACTTAATGTTATCGCC-3'
XYL261-F 5/ -GCACTGGGCCTGGATATCCAAATTACCGAACTGG-3'
XYL261-R 5/ -CCAGTTCGGTAATTTGGATATCCAGGCCCAGTGC-3'
360-F 5/ -GCAAAGATGCGCCGCTTGTGTTTGGCCCGG-3'
360-R 5/ -CCGGGCCAAACACAAGCGGCGCATCTTTGC-3'
XYL375-F 5/ -CCGGCGTATTGGGCGGTCATTGATCACAAATAG-3'
XYL375-R 5/ -CTATTTGTGATCAATGACCGCCCAATACGCCGG-3'
PCR 条件为:10 X Buffer 5mL，引物(IOmM)各 6mL, dNTP( 2. 5mM)6mL, pfu( 2. 5U/mL) ImL,质粒10ng，超纯水补足50mL，条件95° C预变性30s，95° C变性30s，55° C退火lmin，68° C延伸7min，共12个循环。PCR产物用ImL DpnI处理，37° C处理lh。PCR产物IOmL化学法转入E. coli DH5a。送于上海英骏生物技术有限公司测序。测序正确后，提取质粒转入表达菌株E. coliBL21-DE3。提取突变体酶蛋白，测定其在75° C下的热稳定性。测定方法同实施例3. 2。结果得到热稳定性提高的突变体F360L，在75° C的热失活半衰期为10. 5min，是野生型的2. 3倍(表3)。
实施例7突变位点组合构建XT6新突变体7.1突变体FAM的构建
定点突变方法将突变体05D03的53位的苯丙氨酸突变为酪氨酸，构建突变体FAM，所用的引物如下
52-F:5' -GATGCTGAAGCGTCATTATAACTCAATTGTGGCGG-3',52-R:5/ -CCGCCACAATTGAGTTATAATGACGCTTCAGCATC-3'
PCR条件以及操作同实施例6，得到新突变体FAM。 7. 2突变体FAMG的构建
定点突变法将突变体FAM的364位的甘氨酸突变为天冬氨酸，构建突变体FAMG。所用的引物如下
363-F:5' -GCGCCGTTTGTGTTTGACCCGGATTACAAAGTGAAGC-3',
363-R:5' -GCTTCACTTTGTAATCCGGGTCAAACACAAACGGCGC-3'
PCR条件以及后续操作同实施例6，得到突变体FAMG。
7. 3突变体FTAMG的构建
定点突变法将突变体FAMG的121位的苏氨酸突变为异亮氨酸，构建突变体FTAMG，所用的引物如下
I20-F:5, -CCGATGGTGAACGAGATCGATCCGGTGAAACGTG-3'，
120-R:5/ -CACGTTTCACCGGATCGATCTCGTTCACCATCGG-3'
PCR条件以及后续操作同实施例6，得到突变体FTAMG。7. 4突变体FC06T的构建
定点突变法将突变体06H07的17位的天冬酰胺突变为赖氨酸，26位的赖氨酸突变为异亮氨酸，113位的脯氨酸突变为苏氨酸，138位的谷氨酸突变为天冬氨酸，361位的苯丙氨酸突变为亮氨酸，构建突变体FC06T，所用的引物如下
16-F 5/ -GCATATTAGCGCCCTGAAAGCGCCACAGCTGG-3'
16-R 5/ -CCAGCTGTGGCGCTTTCAGGGCGCTAATATGC-3'
25-F 5/ -CAGCTGGACCAACGGTACATAAATGAATTTACTATTGGTGCG-3'
25-R 5/ -CGCACCAATAGTAAATTCATTTATGTACCGTTGGTCCAGCTG-3/
112-F 5/ -GGTTCTTCCTTGACAAAGATGGAAAACCGATGGTG-3'
112-R 5/ -CACCATCGGTTTTCCATCTTTGTCAAGGAAGAACC-3'
137-F 5/ -CTGCTGAAACGCTTGGACACCCACATCAAAACC-3'
137-R 5/ -GGTTTTGATGTGGGTGTCCAAGCGTTTCAGCAG-3'
360-F 5/ -GCAAAGATGCGCCGCTTGTGTTTGGCCCGG-3'
360-R 5/ -CCGGGCCAAACACAAGCGGCGCATCTTTGC-3'
PCR条件以及后续操作同实施例6，得到突变体FC06T。7. 5XT6突变体热稳定性测定
木聚糖酶突变体FAM，FAMG, FTAMG, FC06T热稳定性测定方法同3. 2，测定结果表明FAM, FAMG, FTAMG, FC06T在75° C条件下的热失活半衰期分别是野生型的7. 3、14. 8、19. 4和52倍(表I) ；FTAMG, FC06T经20min热处理后测定残余活性，78° C时，野生型残余活性低于1%，而突变体FTAMG仍能保持20%活性，FC06T仍能保持50%的活性，当温度达到80° C时，FTAMG的残余活性低于5%，而突变体FC06T的残余活性为30%。温度对酶突变体反应速率的影响测定同3. 3，突变体FTAMG，FC06T在87° C具有最大反应速率，比野生型提高10° C。结果见说明书附图2。
表I突变体在75° C热失活半衰期
权利要求
1.一种1，4-β-D-木聚糖酶突变体，其特征在于以SEQ ID NO.1所示的1，4-β-D-木聚糖酶ΧΤ6氨基酸序列为基础，经突变后具有以下突变特征的氨基酸序列将其第271位的蛋氨酸突变为异亮氨酸。
2.—种1，4-β -D-木聚糖酶突变体，其特征在于将权利要求1所述的突变体的第257位的丙氨酸突变为缬氨酸。
3.—种1，4-β -D-木聚糖酶突变体，其特征在于将权利要求1所述的突变体的第257位的丙氨酸突变为缬氨酸且第364位的甘氨酸突变为天冬氨酸。
4.一种1，4-β -D-木聚糖酶突变体，其特征在于将权利要求1所述的突变体的第213位的苏氨酸突变为异亮氨酸、第257位的丙氨酸突变为亮氨酸且364位的甘氨酸突变为天冬氨酸。
5.一种1，4-β -D-木聚糖酶突变体，其特征在于将权利要求1所述的突变体的第138位的谷氨酸突变为天冬氨酸、第257位的丙氨酸突变为缬氨酸且第364位的甘氨酸突变为天冬氨酸。
6.如权利要求1或2或3或4或5所述的一种1，4-β-D-木聚糖酶突变体，其特征在于，将突变体的基因连入PET 28a(+)载体，并在宿主细胞大肠杆菌EscherichiacoliBL21-DE3中表达，获得突变体酶蛋白。
全文摘要
本发明属于基因工程和酶工程技术领域，具体涉及1,4-β-D-木聚糖酶突变体。本发明使用易错PCR方法、DNA改组技术对该酶基因进行突变，再通过高通量筛选方法将正突变检出。并结合基于序列比对的半理性设计方法确定部分潜在热稳定相关位点，再通过定点突变方法得到热稳定相关突变体。经上述突变文库构建、筛选以及半理性设计方法，获得5个热稳定性显著提高的突变体，其热失活半衰期比野生型提高2-52倍，显示出在造纸制浆、生物能源等工业上潜在的应用价值。
文档编号C12N15/70GK102994478SQ20121042629
公开日2013年3月27日 申请日期2010年5月31日 优先权日2010年5月31日
发明者吴中柳, 张志刚, 刘艳 申请人:中国科学院成都生物研究所