专利名称：一株具有降胆固醇能力的嗜热链球菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株具有降胆固醇能力的嗜热链球菌及其应用。
背景技术：
胆固醇是动物组织细胞所不可缺少的重要物质，尤以脑及神经组织中最为丰富，不仅参与形成细胞膜，而且是合成胆汁酸、维生素D及留体激素的原料，胆固醇在体内有着广泛的生理作用。但是，现在随着人们生活水平的提高，高胆固醇含量膳食的摄入也逐渐增多，但随之而来的负面影响却是动脉粥样硬化、冠心病、高血压等心脑血管疾病的发病率不断提高。高脂血症是动脉粥样硬化和冠心病的主要原因，每年动脉粥样硬化、冠心病、高血压等心脑血管疾病的发病率不断提高。目前，心血管疾病已成为引起人类死亡的主要杀手，血清中的胆固醇则被认为是诱发冠心病、动脉粥样硬化等心血管疾病的重要因素。因此，降低血清中胆固醇的水平直接关系到人类的健康，人体胆固醇浓度与膳食脂质摄入之间有着 密切的关系，因此降低食品中的胆固醇关系到人类的健康与长寿。目前，降胆固醇的药物有(I)主要降总胆固醇兼低密度脂蛋白的药物主要是他汀类和胆汁酸螯合剂，如洛伐他汀、辛伐他汀，消胆胺、降胆宁，主要是竞争抑制合成胆固醇的限速酶和加速胆汁酸的利用等；(2)降甘油三酯兼极低密度脂蛋白的药物烟酸类和苯氧酸类，能降低甘油三酯在肝中合成；抑制低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)及极低密度脂蛋白胆固醇(VLDL-C)的合成，减少高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的分解；(3)综合调脂类主要是一些中药制剂。这些药物或多或少的有不良反应，最常见的是胃肠道副反应。因此，寻找一种能够长期使用而且无不良反应的食品或者保健食品是研究工作者和患者所期盼的。国外研究表明，许多乳酸菌在体内和体外都有降低胆固醇的功效。美国和国内的营养和医学专家推荐食物胆固醇的摄入量标准为不超过250 300mg/d ·人。随着人民生活水平的提高和膳食营养的增加，胆固醇的摄入量很容易超标。因此研究不限饮食、不影响食品风味、经济实用的降低食品及人体血清胆固醇水平的方法已成为当前重要的研究课题。乳酸菌大量存在于酸乳及其它相关发酵乳制品中。20世纪70年代，科学家先后通过对大量饮用酸乳等发酵乳制品的非洲Massai人血清胆固醇的研究，对新生儿的研究，对常饮酸乳的美国人的调查以及直接对酸乳的研究等，均发现乳酸菌具有降低人体血清胆固醇的作用。大量临床试验证实，服用乳酸菌及其相关制品对降低血清胆固醇水平有很好的效果。国内外的学者普遍认为，乳酸菌去除胆固醇的机制有以下几种(I)与胆固醇共沉淀作用；
(2)乳酸菌的同化作用(菌体的吸收)(3)胆固醇掺入菌体细胞膜；(4)菌体产生胆固醇氧化酶或其他酶系，直接在体外使胆固醇降解。本研究旨在筛选降胆固醇能力强、能够耐酸、耐胆盐、并能够在肠道存活的乳酸菌。乳酸菌是一种可以分解糖类产生乳酸的厌氧、兼性厌氧、无芽孢革兰氏阳性菌。乳酸菌中的嗜热链球菌被认为是“公认安全性(GRAS)”成分，广泛用于生产重要的乳制品发酵，如酸奶和奶酪。其对机体具有重要的生理功能在其生长代谢过程中能产生半乳糖苷酶降低乳糖不耐症的发生，产生的乳酸降低肠道pH，促进肠蠕动防止病原菌定植，抑制病原菌的生长；发酵过程中产生胞外多糖(Exopolysaccharide, EPS),增加酸奶粘度；缩短酸奶的凝乳时间等等。但大多数乳酸菌不能耐受胃酸和肠道中的胆盐，作为能够降低胆固醇的乳酸菌必须通过人体的胃肠道，才能发挥降胆固醇的作用。发明人根据这些特点对乳酸菌进行分离，从而筛选出一株性能优越的微生态制剂生产菌种。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一株具有降胆固醇能力的嗜热链球菌及其应用，并提供了一种具有降胆固醇能力的嗜热链球菌制剂。本发明是通过以下技术方案实现的一株具有降胆固醇能力的嗜热链球菌，其分类命名为嗜热链球菌BLST·(Streptococcus thermophilusBLST),已于2012年07月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为:CCTCC NO M 2012282。所述嗜热链球菌的菌种生物学特性如下该菌种的细胞大小通常为(0. 4 μ πΓΟ. 7 μ m) X (I. O μ πΓ6. Oum),球状，部分散在、对生，前期为链状，染色均匀，无荚
膜，无鞭毛，能运动；培养基上的菌落圆形，表面乳白色，革兰氏阳性，接触酶阴性，0/F发酵试验产酸；能利用葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、半乳糖产酸，生长温度最高值为42 45°C，10°C以下不生长。经试验证明，所述嗜热链球菌具有降胆固醇的作用，所以该菌株可以作为或用于制备降胆固醇的药物或保健品。具体应用时，可以培养嗜热链球菌BLST，得发酵产物，即为降胆固醇的保健品，该发酵产物也能够作为制备降胆固醇的药物或保健品的原料。所述培养嗜热链球菌BLST的具体过程如下( i )菌种选用嗜热链球菌BLST ；(ii)斜面培养将冻干粉菌种接种于固体斜面培养基上，在37 °C 42 °C培养26 30h ；(iii) 一级种子培养取培养好的斜面，在无菌条件下接种用接种取两环于50mL IOOmL种子液体培养基中，在37°C 42°C条件下，静置培养20 24h，制得一级种子液；(iv)扩大培养以3%的接种量，将一级种子液接于500mL IOOOmL种子液体培养基中，在37 42°C条件下，静置培养20 24h，制得二级种子液；(V)发酵罐培养以3%的接种量，将二级种子液接于液体发酵培养基中，于37 42 °C条件下，静置培养30 36h ；(vi)收集发酵产物待步骤(V )的发酵液的pH值降到4. 5以下，收集发酵液；(Vii)发酵结束后，立即将发酵液12000转/min离心，得菌泥，向菌泥加保护剂，真空冻干，粉碎得菌粉；所述保护剂的组成及用量为脱脂奶粉20%，蔗糖8%，甘油1%，均为相对于菌泥质量的百分数；上述步骤(iii)、(iv)、(V)中所述种子液体培养基配方为葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L、乙酸钠5g/L、柠檬酸铵2g/L、磷酸氢二钾5g/L、硫酸镁0. 5g/L、硫酸锰0. 2g/L、吐温-801mL/L，使用时，调节pH至6. O 6. 5，在115°C条件下灭菌20min ;步骤(ii )所述固体斜面培养基为上述种子液体培养基中添加I. 5 2. 0%的琼脂粉。一种具有降胆固醇能力的嗜热链球菌制剂，其特征在于菌制剂百奥脂乐是由以下原料组成的山楂58 62% (商品名称山楂，实验室浓缩烘干；生产厂家泰安绿地大药房)，灵芝孢子粉6 10% (商品名称灵芝孢子粉，实验室破壁处理；生产厂家泰安凤凰灵芝生物科技有限公司)，红曲米粉I. O 2. 0% (商品名称红曲米粉；生产厂家山东巨野晨农天然产物有限公司)，低聚果糖18 22% (商品名称低聚果糖；生产厂家郑州弘益泰化工产品有限公司)，低聚木糖4 6% (商品名称低聚木糖；生产厂家山东龙力生物科技有限公司)，嗜热链球菌BLST 2X 108cfu/g，植物乳杆菌LP-112X 108cfu/g (该菌株命名为Lactobacillus plantarum，已 于2010年06月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCCNO M 2010150，记载在中国专利申请CN201010240725. X中)，各组分按质量百分比；嗜热链球菌和植物乳杆菌以菌粉的形式加入，菌粉质量要根据冻干菌粉的活菌数来计算，加入冻干菌粉后各组分的质量分数之和不足100%时，由奶粉(商品名称奶粉；生产厂家内蒙古伊利实业集团股份有限公司)补足至100%，制备时，将各组分混合均匀即可。所述植物乳杆菌是以菌粉的形式加入和存在的，其制备方法记载在中国专利申请CN201010240725. X 中。所述嗜热链球菌BLST是以菌粉的形式加入和存在的，制备菌粉的具体过程同上。本发明的具有降胆固醇能力的嗜热链球菌，为经过筛选得到的菌种，其降胆固醇能力强，效果好，可以用于制备降胆固醇的药物或保健品。本发明的具有降胆固醇能力的嗜热链球菌制剂(称为百奥脂乐)，比单一的中药组方、合生元效果显著，比市售国药准字号产品降脂宁、血脂康效果显著，是一个降低总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)效果很好的产品，此产品的原料皆为药食两用的，无毒副作用，无不良反应，是高血脂患者可以长期服用的最佳
女口
广叩ο
一株具有降胆固醇能力的嗜热链球菌，其分类命名为嗜热链球菌BLST(Streptococcus thermophilusBLST),已于2012年07月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO M 2012282，保藏地址为中国武汉武汉大学，邮编430072。图I :四株菌在降胆固醇培养基中发酵40h后的效果图，其中，(a):菌株BJLY发酵前后降胆固醇效果图；(b):菌株LP发酵前后降胆固醇效果图；(c):菌株R3发酵前后降胆固醇效果图；(d)菌株BLST发酵前后降胆固醇效果图。图2 :菌株BLST和R3降胆固醇培养基中发酵40h后计数平板示意图，其中，(a)菌株R3接到降胆固醇的培养基中，37°C发酵40h后，用平板稀释计数法计数，稀释度为IO6上37°C培养48h的乳酸菌生长情况，从图中可以看出在IO6上乳酸菌未见菌落生长；(b):菌株R3稀释度为IO7乳酸菌未见菌落生长；(c):菌株BLST接到降胆固醇的培养基中发酵40h后计数，稀释度为106，37°C培养48h后未见菌落生长；(d)菌株BLST稀释度为107，37°C培养48h后未见菌落生长；图3 (a):菌株BLST降胆固醇培养基中发酵40h后，镜检涂片；图3 (b):菌株BLST吸附胆固醇后用无水乙醇处理后，镜检涂片；试验结果表明菌体在胆固醇培养基中显微镜下未见游离的菌体，菌体外包裹着胆固醇，都与胆固醇结合形成一个个大的颗粒，在平板计数时菌体从外界吸收不到营养而未生长。经无水乙醇处理后，胆固醇溶解，露出菌体。这说明菌体与胆固 醇有吸附作用。图4:吸附胆固醇后转入新鲜培养基中培养40h后镜检涂片；试验结果表明将吸附胆固醇的菌体接入新鲜的未加胆固醇的培养基中，胆固醇可以释放到培养基中露出菌体，这可能是菌体细胞膜能够调节膜内外浓度差的作用。图5 :各试验组对试验大鼠采食的影响。图6 :各试验组对试验大鼠体重的影响。图7 :各试验组TC比较图。图8 :各实验组TG比较图。图9 :各试验组HDL-C的比较图。图10 :各实验组LDL-C的比较图。图11 :各实验组TC比较。图12 :各实验组TG比较图。图13 :各实验组对HDL-C比较图。图14各实验组LDL-C比较图。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明。实施例一、菌种的分离鉴定随着人们生活水平的提高，高胆固醇含量膳食的摄入也逐渐增多，随之带来的高脂血症、冠心病、动脉粥样硬化等心血管疾病已经严重危害到人体健康。人体内胆固醇获得的途径有外源摄取和内源合成，如何减少外源摄取胆固醇摄入量、降低人体血清胆固醇水平的研究越来越受到广泛关注。除了限制饮食外，国内外的科学家研究表明，乳酸菌具有降低人体血清胆固醇的作用，采用益生菌来降低胆固醇无毒无副作用、可长期安全食用，是解决人类心血管疾病的一条新途径。I材料与方法I. I试验材料酸奶、泡菜购自泰安市中百超市。基础培养基MRS培养基，筛选培养基MRS加入2%碳酸钙。体外降胆固醇培养基用无水乙醇将固态胆固醇(真空干燥箱干燥至恒重)和猪胆盐溶解，配成质量浓度为15mg/mL的胆固醇酒精溶液(含4. 5%的猪胆盐)，将胆固醇酒精溶液和新鲜配制的MRS溶液按1:14的比例配成约含O. 1%胆固醇MRS培养基(含O. 3%的猪胆盐)，115°C高压蒸气灭菌20min，冷却后置4°C冰箱备用。试验仪器电子天平、水浴锅、微波炉、双目显微镜、高速冷冻离心机等。I. 2试验方法I. 2. I菌种的分离、筛选、培养。无菌取分离物(酸奶、泡菜)lg，加入到盛有IOOmL灭菌生理盐水中，震荡摇匀，然后用接种环蘸取溶液于MRS碳酸钙琼脂平板划线接种，在37 V培养箱中恒温培养24h，再挑取有钙圈的菌落继续划线，37 °C培养箱中恒温培养24h，挑取钙圈明显的单菌落保存到试管斜面上，做革兰氏染色，镜检。
I. 2. 2种子液制备将上述步骤I. 2. I分离、筛选的菌种斜面，用接种环分别刮取两环于50-100mLMRS基础培养基中，37°C培养24h，得发酵液，备用。I. 2. 3耐酸试验用HCl将生理盐水的pH值调至I. 8，115°C，灭菌20min。分别取种子液ImL分别加入已灭菌pH值I. 8的生理盐水，37°C条件下培养20min，取样测定活菌数，以最初的接入的菌液作为对照，计算其30min后的存活率。I. 2. 4耐胆盐试验基础培养基中添加O. 3%的猪胆盐，灭菌，接种量为2%，37°C培养Ih后计数，以种子液的活菌数为起始菌数，计算其存活率。I. 2. 4模拟人工胃液试验种子液按2% (v/v)接种于模拟胃液中，在37°C条件下培养，分别在30min取样，平板菌落计数，以种子液作为对照，将计数结果取对数。人工胃液配制依照中国药典2010版附录。I. 2. 6模拟人工肠液试验种子液按2% (v/v)接种于模拟肠液中，在37°C条件下培养0h、0. 5h、Ih取样，平板菌落计数，以种子液作为对照，将计数结果取对数。人工肠液配·制依照中国药典2010版附录。I. 2. 7降胆固醇能力筛选将各菌株活化2 3次，分别接种到MRS培养基中，37°C培养24h，按2%(V/V)接种量接种于降胆固醇筛选培养基中，摇匀后立即取样2mL，4000rpm离心5min，取上清液用邻苯二甲醛比色法，测定胆固醇含量，37°C静置培养40h后，用同样方法测定上清中胆固醇含量，并计算培养基中胆固醇的清除率，重复试验三次求平均值。I. 2. 8胆固醇含量测定采用直接离心邻苯二甲醛法(0ΡΑ法)。I. 2. 9胆固醇脱除率的计算胆固醇的脱除率(％)=胆固醇降解量/发酵前胆固醇含量X 100%。I. 2. 10菌种鉴定试验(生化试验)按GB/T4789. 35-2010，伯杰氏细菌鉴定手册，配制糖发酵培养基，将纯培养菌分别穿刺接种，同时进行氧化及触酶试验，产酸产气等试验，37°C培养 2d。2结果与分析2. I形态观察从酸奶中分离纯化的5株乳酸菌和从泡菜中分离纯化的22株乳酸菌经37 °C，24h培养均生长出乳白色、隆起、边缘整齐的小菌落，但需氧培养的菌落明显小于厌氧法。革兰氏染色为阳性，球菌、链球菌及杆菌。2. 2耐酸试验结果对分离纯化的27株乳酸菌进行耐酸试验，有6株表现出来良好的耐酸性，BLS3菌株的耐酸性最好，在pH值I. 8的生理盐水中30min其存活率达到了20. 5%, BLST和BLP5次之，分别为9. 2%和5. 6%,其余的3菌株都在2%以上。2. 3耐胆盐试验结果将分离纯化好的菌株以2%的接种量接种到含O. 3%的猪胆盐的培养基，37°C培养Ih后计数，其存活率结果表明有5株乳酸菌有较好的耐胆盐能力，其中BLST耐胆盐能力最好存活率为56. 8%，其次为BLS3、BLP2、BLP5、BLP8，其存活率分别为43. 5%, 40. 2%, 38. 4%, 30. 7%。结合这几株的耐酸和耐胆盐试验结果，确定BLS3、BLST, BLP5三个株菌作为后备菌种，进行下一步的试验筛选。2. 4模拟人工胃液试验三株菌的模拟人工胃液试验的结果见表I。表I三株菌的耐受人工胃液试验结果(单位lg cfu/mL)
权利要求
1.一株具有降胆固醇能力的嗜热链球菌，其特征在于其分类命名为嗜热链球菌BLST (Streptococcus thermophilus BLST),已于 2012 年 07 月 11 日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCN0 M 2012282。
2.权利要求I所述的具有降胆固醇能力的嗜热链球菌在作为或制备降胆固醇的药物或保健品中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于应用时，培养嗜热链球菌BLST，得发酵产物，即为降胆固醇的保健品，或该发酵产物能够作为制备降胆固醇的药物或保健品的原料。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于培养的具体过程如下 (i )菌种选用嗜热链球菌BLST ； (ii)斜面培养将冻干粉菌种接种于固体斜面培养基上，在37°C 42°C培养26h 30h ； (iii)一级种子培养取培养好的斜面，在无菌条件下接种，用接种环取两环于50mL IOOmL种子液体培养基中，在37°C 42°C条件下，静置培养20h 24h，制得一级种子液； (iv)扩大培养以3%的接种量，将一级种子液接于500mL IOOOmL种子液体培养基中，在37°C 42°C条件下，静置培养20h 24h，制得二级种子液； (V)发酵罐培养以3%的接种量，将二级种子液接于液体发酵培养基中，于37°C 42 °C条件下，静置培养30h 36h ； 上述步骤(iii)、(iv)、(v)中所述种子液体培养基配方为葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L、乙酸钠5g/L、柠檬酸铵2g/L、磷酸氢二钾5g/L、硫酸镁0. 5g/L、硫酸锰0. 2g/L、吐温_801mL/L，使用时，调节pH至6. O 6. 5，在115°C条件下灭菌20min ；步骤(ii )所述固体斜面培养基为上述种子液体培养基中添加I. 5 2. 0%的琼脂粉。
5.一种具有降胆固醇能力的嗜热链球菌制剂，其特征在于菌制剂百奥脂乐是由以下原料组成的山楂56 61%，灵芝孢子粉6 9%，红曲米粉I. O I. 5%，低聚果糖18 22%， 低聚木糖4 6%，嗜热链球菌BLST 2X 108cfu/g，植物乳杆菌LP-112X 108cfu/g，各组分按质量百分比； 所述嗜热链球菌和植物乳杆菌以菌粉的形式加入，加入菌粉后各组分的质量分数之和不足100%时，由奶粉补足至100% ； 所述嗜热链球菌BLST，已于2012年07月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO M 2012282。
6.根据权利要求5所述的具有降胆固醇能力的嗜热链球菌制剂，其特征在于所述嗜热链球菌BLST是以菌粉的形式存在的，制备菌粉的具体过程如下 (i )菌种选用嗜热链球菌BLST ； (ii)斜面培养将冻干粉菌种接种于固体斜面培养基上，在37°C 42°C培养26h 30h ； (iii)一级种子培养取培养好的斜面，在无菌条件下用接种环取两环于50mL IOOmL种子液体培养基中，在37°C 42°C条件下，静置培养20h 24h，制得一级种子液； (iv)扩大培养以3%的接种量，将一级种子液接于500mL IOOOmL种子液体培养基中，在37°C 42°C条件下，静置培养20h 24h，制得二级种子液；(V )发酵罐培养以3%的接种量，将二级种子液接于液体发酵培养基中，于37°C ·42 °C条件下，静置培养30h 36h ； (vi)收集发酵产物待步骤(V)的发酵液的pH值降到4. 5以下，收集发酵液； (vii)发酵结束后，立即将发酵液12000rpm离心，得菌泥，向菌泥加保护剂，真空冻干，粉碎得菌粉；所述保护剂的组成及用量为脱脂奶粉20%，蔗糖8%，甘油1%，均为相对于菌泥质量的百分数； 上述步骤(iii)、(iv)、(v)中所述种子液体培养基配方为葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L、乙酸钠5g/L、柠檬酸铵2g/L、磷酸氢二钾5g/L、硫酸镁O. 5g/L、硫酸锰O. 2g/L、吐温_801mL/L，使用时，调节pH至6. O 6. 5，在115°C条件下灭菌20min ；步骤(ii )所述固体斜面培养基为上述种子液体培养基中添加I. 5 2. 0%的琼脂粉。··
全文摘要
本发明公开了一株具有降胆固醇能力的嗜热链球菌，其分类命名为嗜热链球菌BLST(Streptococcus thermophilus BLST)，已于2012年07月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNOM 2012282。经试验证明，本发明的嗜热链球菌具有降胆固醇的作用，所以该菌株可以作为或用于制备降胆固醇的药物或保健品。具体应用时，可以培养嗜热链球菌BLST，得发酵产物，即为降胆固醇的保健品，该发酵产物也能够作为制备降胆固醇的药物或保健品的原料。本发明还提供了一种具有降胆固醇能力的嗜热链球菌制剂，菌制剂百奥脂乐是由以下原料组成的山楂，灵芝孢子粉，红曲米粉，低聚果糖，低聚木糖，嗜热链球菌BLST菌粉，植物乳杆菌LP-11菌粉。
文档编号C12N1/20GK102899276SQ20121043926
公开日2013年1月30日 申请日期2012年11月7日 优先权日2012年11月7日
发明者单宝龙, 谷巍, 程秀芳, 翟延庆, 王丛丛, 刘虹, 李丹, 谢莉敏 申请人:山东宝来利来生物工程股份有限公司