专利名称：一种弧形凹陷小孔的pdms聚合物芯片的制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及聚合物芯片的加工，制作，修饰及其应用领域，特别提供了一种弧形凹陷小孔的PDMS聚合物芯片的制备方法及应用。
背景技术：
组织工程学是近年来兴起的一门新兴学科。它是应用生命科学和工程学的原理与技术，在正确认识哺乳动物的正常及病理两种状态下结构与功能关系的基础上，研究、开发用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态生物替代物。组织工程的核心就是建立细胞与生物材料的三维空间复合体，即具有生命力的活体组织，用以对病损组织进行形态、结构和功能的重建并达到永久性替代。三维培养是利用各种方法及材料，使细胞呈空间立体方式生长，更接近于体内生长模式，形成类似体内组织的结构，发挥 其功能。软骨组织由于缺乏血液系统，损伤后自身修复能力差，而软骨细胞在体外进行单层贴壁培养的过程中，会发生去分化现象，使软骨细胞由典型的多边形细胞向纤维样细胞分化，其分泌II型胶原的特征开始向分泌I型胶原的功能转化并逐步丧失分泌聚集蛋白聚糖(Aggrecan)的功能。近年来利用制作弧形凹陷微结构形成三维细胞结构来研究细胞行为和功能越来越被人所关注。现在报道的微结构形成三维细胞结构一方面可为体外培养细胞提供与其组织来源相似甚至相同的细胞生长微环境和细胞联系，从而既有利于各类细胞的分化定向诱导，又有利于细胞分化表型的维持和增殖；另一方面可望在体外构建与各类组织、器官相应的细胞三维生长类似物或等同物。而其应用领域也涉及干细胞分化，胰岛细胞功能再生、体外器官重建等诸多方面。随着生物医学领域的需求，制作弧形凹陷微结构方法也在飞速发展，主要的方法有冰刻蚀，软刻蚀、电子束刻蚀，原位合成法，气动技术等(I、Park, J.Y. ;Hwang, C. M. ;Lee, S. -H., Ice-lithographic fabrication of concave microwells anda microfluidic network. Biomedical Microdevices 2008，11(I)，129-133 ;2、Xu，Y. ;Xie, F. ; Qiuj T. ;Xie，L ; Xing, W. ; Cheng, J. , Rapid fabrication of a microdevice withconcave microwells and its application in embryoid body formation. Biomicrofluidics2012，6(1)，016504)。尽管上述方法现在已经发展的较为成熟，但仍有很多因素限制了其更加广泛的应用软刻蚀、电子束刻蚀等技术修饰的精度高，但其需要专业化的昂贵仪器并且操作复杂；原位合成法虽然操作简单，但其用于原位合成的分子价格昂贵并且合成的体系有时会用到大量有机试剂；气动方式技术简单、快速、成本低廉，但所需要的通道模板是要求带有小孔结构的通透模板，制作方法繁琐、操作复杂。综上所述，发明一种简单、快速、易于操作、环境友好、易于集成，可控性强、并且价格低廉的制作弧形的凹陷小孔的PDMS聚合物芯片的方法具有十分重要意义的
发明内容
本发明的目的在于提供一种弧形凹陷小孔的PDMS聚合物芯片的制备方法及应用，以解决以往制作工艺中存在的操作复杂、价格昂贵等问题。本发明提供了一种弧形凹 陷小孔的PDMS聚合物芯片的制备方法，该方法的具体步骤如下 ( I)利用光蚀刻技术制作含有多个小孔的SU-8聚合物模板；(2)对SU-8聚合物模板进行85-90摄氏度加热5_10分钟进行热熔，使小孔的形状由直角形变为凹陷型；(3)对热熔后的SU-8聚合物模板进行整体的紫外曝光60-90秒；(4)将未固化PDMS聚合物溶液(单体与固化剂配比为10 :1)倾倒入SU-8聚合物模板上，80-90摄氏度加热固化PDMS聚合物溶液20-40分钟，剥离固化PDMS聚合物芯片，得到PDMS聚合物反模芯片；(5)将未固化PDMS聚合物溶液(单体与引发剂配比为10 :1)倾倒入上述的PDMS聚合物反模芯片上，80-90摄氏度加热固化PDMS聚合物溶液20-40分钟，剥离固化PDMS聚合物芯片，得到具有凹陷小孔的PDMS聚合物芯片。本发明提供的弧形凹陷小孔的PDMS聚合物芯片的制备方法，所述的制作方法的光刻蚀形式。本发明提供的弧形凹陷小孔的PDMS聚合物芯片的制备方法，所述的聚合物为PDMS聚合物或可以用于软刻蚀的聚合物。本发明提供的弧形凹陷小孔的PDMS聚合物芯片的制备方法，该方法中所形成的微米级别的凹孔，该微孔的宽度和结构为设计固定，可通过显影的时间调节小孔的深度，可通过热熔的时间调节小孔的形状。凹陷形小孔的深度通过调节乳酸乙酯显影SU-8聚合物模板的时间来控制，时间为5-10分钟，显影时间越长，小孔的深度越大。凹陷形小孔的曲率形状通过在加热板调节热熔的加热时间来控制，加热时间为5-10分钟，热熔时间越长，小孔的曲率越大。本发明还提供了弧形凹陷小孔的PDMS聚合物芯片的应用，使用本发明提供的方法制作弧形的凹陷小孔的PDMS聚合物芯片，对此芯片进行灭菌，表面修饰后的可以用于形成软骨细胞微球并对其进行细胞的三维培养，例如以具有微米弧形凹陷小孔结构的PDMS芯片表面形成软骨三维细胞小球及其表现维持，研究的方法将进行修饰后微米凹陷小孔结构的PDMS芯片为底层，接种软骨细胞悬液，在重力的条件下，软骨细胞会自发的形成三维微球，培养后能保持三维结构，通过免疫荧光染色，软骨细胞的II型胶原和蛋白多糖显现T闻表达。本发明提供的以制作弧形的凹陷小孔的PDMS聚合物芯片方法，用于形成软骨细胞三维结构并长期培养，软骨三维细胞能保持特定的功能。同时，本方法还为不具备专业刻蚀设备及技术的实验室提供了一种具有应用潜力的表面修饰平台。本发明提供的以SU-8为模板的快速制作弧形凹陷小孔PDMS聚合物芯片的方法，其优点在于I、无需昂贵的刻蚀设备；2、操作简单、快速；；3、实验成本低廉
4、不涉及有机试剂，环境友好；5、可与其它技术集成化。
图I为制作形成软骨三维微球及其表型维持的PDMS聚合物芯片的方法的流程图；图2为制作形成软骨三维微球及其表型维持的PDMS聚合物芯片的方法的原理与流程图；图3为制作形成软骨三维微球及其表型维持的PDMS聚合物芯片接种大鼠软骨细胞的培养3天的生长增殖情况，其中A图为明场条件下软骨细胞三维微球的培养3天的增殖照片，B图为软骨细胞三维微球培养三天直径的统计，C图为软骨细胞微球培养三天后直 径的分布统计。；图4为大鼠软骨细胞分别在孔板和弧形凹陷小孔的TOMS聚合物芯片培养三天后免疫表达II型胶原的荧光照片；图5为大鼠软骨细胞分别在孔板和弧形凹陷小孔的TOMS聚合物芯片培养三天后免疫表达蛋白多糖的荧光照片。
具体实施例方式下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。实施例I利用光刻蚀技术制作SU-8聚合物模板，模板为20 X 20的圆形小孔，模板的结构为圆柱形。如图I所示，将SU-8光刻蚀胶涂于干净的玻璃片上，95摄氏度加热I小时后；放上设计好的掩膜在紫外下曝光60秒后；95摄氏度加热15分钟，显影5分钟，在80°C下加热固化2小时；完全曝光90秒。将未固化的PDMS (10 :1)倾倒在SU-8聚合物模板上，并同时在80°C下加热20分钟。装置冷却后，剥离上层PDMS芯片形成反模。将未固化的PDMS(10 :1)倾倒于PDMS聚合物反模芯片上，并同时在80°C下加热20分钟，装置冷却后，剥离上层PDMS聚合物可形成弧形的弧形凹陷小孔的PDMS聚合物芯片。实施例2在弧形的凹陷小孔的PDMS聚合物芯片上进行大鼠软骨细胞三维培养的原理与流程图如图2所示。弧形的凹陷小孔的PDMS聚合物芯片首先进行灭菌处理，紫外照射过夜，然后使用1%的PF-127溶液进行表面修饰8小时，接种软骨细胞悬浮液，软骨细胞在重力的作用下，会沉淀到芯片表面的小孔底部，自发的形成三维细胞团。实施例3基于以SU-8为模板的快速制作弧形凹陷小孔PDMS聚合物芯片用于大鼠软骨细胞的三维培养，亚型与功能的保持。图3显示了大鼠软骨细胞在弧形的凹陷小孔的PDMS聚合物芯片培养三天的生长情况，细胞间的连接越来越紧密，成团趋势明显。这证明了本方法弧形的凹陷小孔的PDMS聚合物芯片可形成三维的细胞结构。图4显示了小鼠软骨细胞在弧形的凹陷小孔的PDMS聚合物芯片培养三天后进行II型胶原的免疫荧光染色，对照组为在孔板中培养的二维大鼠软骨细胞，在三维培养条件下，II型胶原在大鼠的软骨细胞的表达明显。图5显示了小鼠软骨细胞在弧形的凹陷小孔的PDMS聚合物芯片培养三天后进行蛋白多糖的免疫荧光染色的照片，对照组为在孔板中培养的二维大鼠软骨细胞，在三维培养条件下，蛋白多糖在大鼠的软骨细胞的表达明显。这证明了本方法制作的弧形的凹陷小孔的PDMS聚合物芯片培养大鼠软骨细胞后可以保持软骨细胞的去分化的功能。
权利要求
1.ー种弧形凹陷小孔的PDMS聚合物芯片的制备方法，其特征在于该方法的具体步骤如下 (1)利用光蚀刻技术制作含有多个小孔的SU-8聚合物模板； (2)对SU-8聚合物模板进行热熔，使小孔的形状由直角形变为凹陷型； (3)对热熔后的SU-8聚合物模板进行整体的紫外曝光； (4)将未固化PDMS聚合物溶液倾倒入SU-8聚合物模板上，加热固化PDMS聚合物溶液，剥离固化PDMS聚合物芯片，得到PDMS聚合物反模芯片； (5)将未固化PDMS聚合物溶液倾倒入上述的PDMS聚合物反模芯片上，加热固化PDMS聚合物溶液，剥离固化PDMS聚合物芯片，得到具有凹陷小孔的PDMS聚合物芯片。
2.按照权利要求I所述弧形凹陷小孔的PDMS聚合物芯片的制备方法，其特征在于所述步骤(2)中，热熔的条件为85-90摄氏度加热5-10分钟。
3.按照权利要求I所述弧形凹陷小孔的TOMS聚合物芯片的制备方法，其特征在于所述步骤(3)中，紫外曝光时间为60-90秒。
4.按照权利要求I所述弧形凹陷小孔的PDMS聚合物芯片的制备方法，其特征在于所述步骤(4)和(5)中，未固化PDMS聚合物溶液为PDMS单体与固化剂配比为10 :1。
5.按照权利要求I所述弧形凹陷小孔的PDMS聚合物芯片的制备方法，其特征在于所述步骤(4)和(5)中，加热固化的条件为80-90摄氏度加热固化20-40分钟。
6.按照权利要求I所述弧形凹陷小孔的PDMS聚合物芯片的制备方法，其特征在于所述步骤(2)中，凹陷形小孔的曲率形状通过在加热板调节热熔的加热时间来控制，加热时间为5-10分钟，热熔时间越长，小孔的曲率越大。
7.按照权利要求I所述弧形凹陷小孔的PDMS聚合物芯片的制备方法，其特征在于所述步骤(2)中，凹陷形小孔的深度通过调节乳酸こ酯显影SU-8聚合物模板的时间来控制，时间为5-10分钟，显影时间越长，小孔的深度越大。
8.权利要求I所述方法制备的弧形凹陷小孔的PDMS聚合物芯片的应用，其特征在于该芯片用于形成软骨细胞微球并对其进行细胞的三维培养及其表性的維持。
9.按照权利要求8所述的应用，其特征在于先对弧形凹陷小孔的PDMS聚合物芯片进行修饰，以修饰后的芯片为底层，接种软骨细胞悬液，在重力的条件下，软骨细胞会自发的形成三维微球，培养后能保持三维结构，通过免疫荧光染色，软骨细胞的II型胶原和蛋白多糖显现了高表达。
10.按照权利要求9所述的应用，其特征在于所述的修饰方法为将弧形凹陷小孔的PDMS聚合物芯片用水和PBS清洗。
全文摘要
一种弧形凹陷小孔的PDMS聚合物芯片的制备方法及应用，该方法的步骤为利用软蚀刻技术制作PDMS通道芯片模板；制作PDMS薄膜，将上述的PDMS通道芯片模板，与PDMS薄膜封接后，与玻璃片封接，底部用金属管连接气体，对整个装置进行表面修饰；将未固化后的PDMS聚合物溶液倒入上述的装置，通入气体，加热固化PDMS聚合物溶液，剥离PDMS芯片即可；表面修饰后的PDMS芯片可以用于细胞的三维培养，该方法无需昂贵的刻蚀设备，具有操作简单、快速，实验成本低廉，不涉及有机试剂，环境友好，可与其它技术集成化的优点。
文档编号C12M3/00GK102978110SQ20121043964
公开日2013年3月20日 申请日期2012年11月6日 优先权日2012年11月6日
发明者秦建华, 石杨, 姜雷, 张旭 申请人:中国科学院大连化学物理研究所