可溶性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)、制备它们的方法、它们的用途和包含它们的药物组合物的制作方法

专利名称：：可溶性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)、制备它们的方法、它们的用途和包含它们的药物组合物的制作方法
技术领域：
：本发明一般性地涉及在中性条件下具有活性的(neutral-active)可溶的透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)、其中的部分，特别是透明质酸酶结构域。更特别地，本发明涉及化学修饰、药物组合物、表达质粒、制造方法和治疗方法，其中将透明质酸酶糖蛋白和其结构域以及编码核酸分子应用于在疾病治疗中糖胺聚糖的治疗性的修饰以及增加直径小于200纳米的其它注射分子在动物中的扩散。
背景技术：
：糖胺聚糖(GAGs)是胞外基质(ECM)中复杂的线性多糖。GAG的特征为重复的二糖结构，二糖结构由N-取代的氨基己糖和糖醛酸组成[透明质酸(HA)、硫酸软骨素(CS)、软骨素(C)、硫酸皮肤素(DS)、硫酸乙酰肝素(HS)、肝素(H)]或由N-取代的氨基己糖和半乳糖组成[硫酸角质素(KS)]。除了HA之外,所有均共价结合于核心蛋白(coreproteins)。GAG连同它们的核心蛋白在结构上被称为蛋白多糖(PGs)。透明质酸(HA)主要发现于哺乳动物的结缔组织、皮肤、软骨中以及滑液中。透明质酸也是眼睛玻璃体的主要组成成分。在结缔组织中，与透明质酸相关的水合作用的水产生了组织之间的空间，从而为细胞运动和增殖创造了有利的环境。透明质酸在与细胞运动有关的生物学现象中发挥关键作用，这些细胞运动包括快速发育(rapiddevelopment)、再生、修复、胚胎发生、胚胎发育、伤口愈合、血管生成和肿瘤发生(Toole1991CellBiol.Extracell.Matrix,Hay(ed),PlenumPress,NewYork,1384-1386；Bertrandetal.1992Int.J.Cancer52:1-6;Knudsonetal,1993FASEBJ.7:1233-1241)。此夕卜，透明质酸水平与肿瘤入侵(tumoraggressiveness)有关(Ozelloetal.1960CancerRes.20:600-604；Takeuchietal.1976,CancerRes.36:2133-2139;Kimataetal.1983CancerRes.43:1347-1354)。HA发现于许多细胞的胞外基质中，尤其是软结缔组织中。已发现HA具有多种生理学功能，诸如在水和血浆蛋白质的动态平衡方面(LaurentTCetal(1992)FASEBJ6:2397-2404)。HA的产生增加了细胞繁殖，并可能在有丝分裂中发挥作用。这已在运动(locomotion)和细胞迁移中得到启示。HA似乎在细胞调控、发育和分化中发挥作用(Laurentetal,supra)。HA已经被用于临床医学中。它的组织保护特性和流变特性已经证明可用于眼科手术中，以在白内障手术中保护角膜内皮。血清HA在肝病和各种炎症病症如类风湿性关节炎中具有诊断作用。由HA的积聚引起的间质水肿可引起各种器官的功能紊乱(Laurentetal,supra)。透明质酸蛋白质相互作用也参与胞外基质或“基质(groundsubstance)”的结构。透明质酸酶是一组中性和酸性活性酶，在整个动物界都能被发现。透明质酸酶在底物特异性和作用机制方面有所变化。有3大类透明质酸酶I.哺乳动物类型透明质酸酶(EC3.2.I.35)，其是内-β-N-乙酰氨基己糖苷酶，以四糖和己糖作为主要的终产物。它们具有水解和转糖苷酶活性，能够降解透明质酸和硫酸软骨素(CS)，尤其是C4-S和C6-S。2.细菌透明质酸酶(EC4.2.99.I)降解透明质酸，并不同程度地降解CS和DS。它们是内-β-N-乙酰氨基己糖苷酶，它们通过β消去反应发挥作用，主要产生二糖终产物。3.来自水蛭、其它寄生虫和甲壳类动物的透明质酸酶(EC3.2.1.36)，其是内葡糖醛酸酶，通过水解β1-3键产生四糖和己糖终产物。哺乳动物透明质酸酶可以进一步分为两组中性活性(neutralactive)和酸性活性(acidactive)酶。在人基因组中有六种透明质酸酶样基因HYAL1、HYAL2、HYAL3、HYAL4、HYALPl和PH20/SPAM1。HYALPl是假基因，HYAL3对任何已知的底物都没有显示出具有酶活性。HYAL4是软骨素酶(chondroitinase)，对透明质酸缺少活性。HYALl是原型酸性活性酶，PH20是原型中性活性酶。酸性活性透明质酸酶，诸如HYALl和HYAL2在中性pH中缺少催化活性。例如，HYALl在体外pH4.5以上无催化活性(FrostetalAnalBiochemistry,1997)。HYAL2是酸性活性酶，在体外具有非常低的比活性。透明质酸酶样(hyalimmidase-like)酶也可以表征为那些通过糖基磷脂酰肌醇锚锁定到质膜上的酶，诸如人HYAL2和人PH20(Danilkovitch-Miagkova,etal.ProcNatlAcadSciUSA.2003Apr15;100(8):4580-5,Phelpsetal.,Science1988)，和那些为可溶性的酶，诸如人HYALl(Frostetal,BiochemBiophysResCommun.1997Jul9;236(I):10-5)。然而，种与种之间是有变化的例如牛PH20非常松散地附着到质膜，而不通过憐脂酶敏感性的锚(phospholipasesensitiveanchor)被锚定(Lalancetteetal,BiolReprod.2001Aug;65(2):628-36)。牛透明质酸酶的这一独特特征使得可以使用可溶性牛睾丸透明质酸酶作为提取物用于临床应用(Wyd^eK:、Hyahw)。其它种的PH20是脂锚定的酶，其在不应用去污剂或脂肪酶的情况下是不具可溶性的。例如，人PH20通过GPI锚被锚定到质膜。已经尝试制备不会引入脂类锚的人PH20DNA构建物，但得到的是无催化活性的酶，或者不可溶的酶(ArmingetalEurJBiochem.1997AugI;247(3):810-4)发现天然存在的猕猴精子透明质酸酶既可以是可溶性的，又可以是膜结合形式的。64kDa膜结合形式在PH7.O时具有酶活性，而54kDa形式仅在pH4.O时具有活性(Cherretal，DevBiol.1996Apr10;175(I):142-53)。因此，可溶性形式的PH20在中性条件下缺乏酶活性。软骨素酶是在整个动物界都能发现的酶。这些酶通过内切糖苷酶反应降解糖胺聚糖。已知的软骨素酶的具体例子包括软骨素酶ABC(来自普通变形杆菌(Proteusvulgaris)；日本专利特开号6-153947，T.Yamagata,H.Saito,0.Habuchi,andS.Suzuki,J.Biol.Chem.,243,1523(1968),S.Suzuki,H.Saito,T.Yamagata,K.Anno,N.Seno,Y.Kawai,andT.Furuhashi,J.Biol.Chem.,243,1543(1968));软骨素酶AC(来自肝素黄杆菌(Flavobacteriumheparinum);T.Yamagata,H.Saito,O.Habuchi,andS.Suzuki,J.Biol.Chem.,243,1523(1968));软骨素酶ACII(来自Arthrobacteraurescens;K.Hiyama,andS.Okada,J.Biol.Chem.,250,1824(1975),K.HiyamaandS.Okada,J.Biochem.(Tokyo),80,1201(1976));透明质酸酶ACIII(来自黄杆菌某种Hp102;HirofumiMiyazono,HiroshiKikuchi,KeiichiYoshida,KiyoshiMorikawa,andKiyochikaTokuyasu,Seikagaku,61,1023(1989));软骨素酶B(来自肝素黄杆菌;YM.MichelacciandC.P.Dietrich,Biochem.Biophys.Res.Commun.,56,973(1974),Y.M.MichelacciandC.P.Dietrich,Biochem.J.,151,121(1975),KenichiMaeyama,AkiraTawada,AkikoUeno,andKeiichiYoshida,Seikagaku,57,1189(1985));软骨素酶C(来自黄杆菌某种Hp102;HirofumiMiyazono,HiroshiKikuchi,KelichiYoshida,KiyoshiMorikawa,andKiyochikaTokuyasu,Seikagaku,61,1023(1939))和类似物。糖蛋白由共价结合到一个或多个碳水化合物部分的多肽链组成。有两大类糖蛋白，其具有通过N-糖苷键或O-糖苷键偶联到它们的组成蛋白质上的碳水化合物。N-连接和O-连接的聚糖分别通过天冬酰胺-N-乙酰-D-葡萄糖胺和丝氨酸(苏氨酸)-N-乙酰-D-半乳糖胺连接附着到多肽上。复合的N-连接寡糖不含有末端甘露糖残基。它们只含有末端N-乙酰葡糖胺、半乳糖和/或唾液酸残基。杂合寡糖含有末端甘露糖残基以及末端N-乙酰葡糖胺、半乳糖和/或唾液酸残基。对于N连接的糖蛋白，在内质网中的肽合成期间，寡糖前体被附着到天冬酰胺的氨基基团上。寡糖部分继而由一系列特异性酶进行加工，剔除和增加糖组成部分。该加工在内质网中进行，并在通过顺面、中间和反面高尔基体的过程中继续被加工。发明概述本文提供了可溶性的、中性活性的透明质酸酶糖蛋白家族的成员，特别地，提供了人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白(本文中也称为sHASEGPs)。本文中提供的sHASEGP是sHASEGP家族成员，本文中命名为sHASEGP。本文也提供了可溶性的透明质酸酶结构域及其应用。本发明基于这样的发现，即，通过导入人PH20cDNA的缺少一个狭窄区域(narrowregion)的核酸，可以在哺乳动物表达系统中高产量地产生中性活性的透明质酸酶活性，所述狭窄区域编码羧基末端的氨基酸。也提供了对sHASEGP的额外的修饰，以利用非天然的前导肽增加分泌。本发明还提供了方法，其通过用聚乙二醇掩蔽蛋白质和对天然的糖基化进行翻译后修饰来修饰sHASEGP，以延长它的半衰期。先前已经尝试过生产分泌的中性活性的人sHASEGP，但都是失败的。其结果表明，将人sHASEGP多肽截短不但导致中性酶活性丧失，还导致在哺乳动物表达系统中细胞不能分泌重组蛋白质(Arming,etalEurJBiochem1997AugI;247(3):810-4)。产生中性活性的分泌型sHASEGP对于透明质酸酶的商业生产和治疗应用是至关重要的，本文中公开的发明了克服这些挑战。本发明还包括具有催化活性的人sHASEGP糖蛋白，其中，该sHASEGP具有至少一个N-连接糖部分。本文中描述的研究证明，人PH20需要N-连接的聚糖以获得催化活性，而牛和蜂毒透明质酸酶在没有这样的N-连接聚糖的情况下仍具有活性。无N-连接部分的人透明质酸酶结构域是不具有催化活性的。因此，不像蜂毒HASEGP，其可以在大肠杆菌中产生，经典的重组DNA技术不能产生具有催化活性的人sHASEGP。本发明包括用于产生N-连接的sHASEGP糖蛋白多肽的方法和细胞，其通过使用能够引入所述N-连接糖部分的细胞来进行，或通过在sHASEGP多肽上引入所述N-连接部分来进行。还公开了鉴定适当地糖基化的sHASEGP的方法。本发明也提供了具有催化活性的超-唾液酸化的sHASEGP(Super-SialatedsHASEGP)糖蛋白。相比起天然发生的非唾液酸化的牛和羊睾丸sHASEGPs、超-唾液酸化sHASEGPs具有更大的血清半衰期，因此对于酶稳定性和用作静脉内药物是优选的。本发明提供了用于制备超-唾液酸化sHASEGPs、组合物的方法及其应用方法。本发明也提供了由天然GPI锚定缺陷型sHASEGP的拼接变体(splicevariants)编码的蛋白质。本发明还提供了sHASEGP的组合物，其包括携带有金属离子的可溶性sHASEGP糖蛋白，其中，该金属离子是钙、镁或钠。sHASEGPs在所述离子存在的条件下具有最佳活性。也提供了含有所述的金属离子和sHASEGP的制剂。本发明也提供对sHASEGP所作的修饰，以进一步延长半衰期。提供了利用聚合物诸如聚乙二醇和葡聚糖对sHASEGP的化学修饰。这样的修饰使得sHASEGP不会从循环和免疫系统中清除出去，作为甘露糖的糖基化受体和脱唾液酸糖蛋白。本发明还提供了方法，用来连接到特定的功能基团诸如糖基化位点、带正电荷的氨基酸和半胱氨酸。本文也提供了用于鉴定可调节sHASEGP的活化、表达或活性的效应子(effectors)例如包括小分子在内的化合物和诸如pH、温度和离子强度的条件的分析方法。在示范性的分析方法中，评价了受测化合物对sHASEGP透明质酸酶结构域切割已知底物的能力的影响，所述的已知底物通常是糖胺聚糖或蛋白聚糖。调节透明质酸酶结构域的活性的试剂，一般是化合物，特别是小分子，是调节sHASEGP的活性的候选化合物。透明质酸酶结构域也可以被用于产生具有活性扰乱功能的透明质酸酶特异抗体。本文中提供的透明质酸酶结构域包括但不限于，具有被截短的C-末端部分的N-末端糖基水解酶结构域，其在体外显示出催化活性。也提供了编码蛋白质和透明质酸酶结构域的核酸分子。提供了编码可溶性透明质酸酶结构域或其催化活性部分的核酸分子和那些编码全长sHASEGP的核酸分子。编码透明质酸酶结构域的核酸和下游核酸如SEQIDNo.6所描述；sHASEGP的透明质酸酶结构域如SEQIDNo.I(氨基酸35-464)所描述。全长sHASEGP的蛋白质序列和编码核酸序列如SEQIDNo.I和6所描述。本发明也提供了这样的核酸分子，其沿着sHASEGP的编码核酸的全长或沿着全长的至少70%、80%或90%与此sHASEGP编码核酸杂交，提供了编码透明质酸酶结构域或其中的部分的核酸分子。杂交通常是在至少低、通常至少中等、常常是高的严紧(stringency)条件下完成。分离的核酸片段是DNA，包括基因组DNA或cDNA，或是RNA，或可以包括其他组分，诸如蛋白质核酸(proteinnucleicacid)或其他核苷酸类似物。分离的核酸可以包括额外的组分，诸如异源或天然的启动子，以及其它的转录和翻译调控序列，这些基因可以被连接至其他基因，诸如报告基因或其他指示基因(indicatorgenes)或编码指示物的基因。本发明也提供了分离的核酸分子，其包括与编码sHASEGP或其部分的核苷酸序列互补的分子的序列。本发明也提供了其片段或寡核苷酸，其可以被用作探针或引物，包含至少约10、14、16个核苷酸，一般少于1000个核苷酸或少于或等于100个核苷酸，如SEQIDNO.6(或其互补物)所述；或包含至少大约30个核苷酸(或其互补物)；或包含沿着它们的全长(或其至少约70、80或90%)与任意此种片段或寡核苷酸杂交的寡核苷酸。片段的长度与使用它们的目的和/或感兴趣的基因组的复杂程度有关。通常，探针和引物包含少于约50、150或500个核苷酸。本发明也提供了包含本文中提供的任何核酸分子的质粒。也提供了含有所述质粒的细胞。这样的细胞包括但不限于，细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞、植物细胞、昆虫细胞和动物细胞。本发明也提供了增强的哺乳动物表达系统，其应用了能够有效分泌sHASEGP的信号前导肽(signalleaders)。这样的有效促分泌的前导肽氨基酸序列以及与sHASEGP形成的融合蛋白的例子参见SEQIDNos.43和46。本发明也提供了用于产生sHASEGP的方法，其通过将上述细胞在sHASEGP可被细胞表达的条件下培养，并回收表达的sHASEGP多肽或糖蛋白而进行。用于分离编码其它sHASEGPs的核酸的方法也被提供。本发明也提供了sHASEGP多肽表达于其表面的细胞，通常是真核细胞，诸如哺乳动物细胞和酵母细胞。这样的细胞被用于药物筛选分析，以鉴定可调节sHASEGP多肽的活性的化合物。这些分析方法包括体外结合分析、基于转录的分析，在其中，由sHASEGP直接或间接-例如通过活化原生长因子(pro-growthfactors)-介导的信号转导得到评测。本发明也提供了由这样的核酸分子编码的肽。包括在那些多肽中的是sHASEGP透明质酸酶结构域，或具有氨基酸变化的多肽，而特异性和/或透明质酸酶活性基本上未变化。特别地，提供了基本上纯的哺乳动物sHASEGP糖蛋白，其包括分泌型中性催化活性。本发明也包括透明质酸酶催化结构域，并且还可以包括其他结构域。sHASEGP可以形成同型二聚体，也可以与一些其他蛋白诸如膜结合蛋白形成异型二聚体。本发明也提供了基本上纯化的糖蛋白，包括与sHASEGP具有至少60%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的氨基酸序列，其中，百分同一'I"生应用标准算法和缺口罚值(gappenalties)来确定,缺口罚值使百分同一'I"生最大化。sHASEGP的拼接变体，特别是那些具有催化活性透明质酸酶结构域的变体在本文中被考虑到。在其他实施方案中，提供了基本上纯化的多肽，其包括sHASEGP多肽的透明质酸酶结构域或其催化活性部分，但不包含SEQIDNo.I中描述的整个氨基酸序列。属于此列的多肽，包括与SEQIDNo.I或3具有至少70%、80%、85%、90%、95%或100%序列同一性的氨基酸序列。在特定的实施方案中，提供了编码真核生物透明质酸酶糖蛋白的核酸，命名为sHASEGP。特别地，所述核酸包括在SEQIDNo.6中描述的核苷酸序列，特别地，SEQIDNO.6的核苷酸106-1446所描述的核苷酸序列，或其中编码具有催化活性的多肽的部分核苷酸序列。本发明也提供了这样的核酸分子，其在至少低严紧性、通常中等严紧性、更经常地为高严紧性的条件下与SEQIDNO.6或其简并型(degenerates)杂交。在一种实施方案中，分离的核酸片段在高严紧性的条件下，与包含SEQIDNo:6(或其简并型)所述的核苷酸序列的核酸分子杂交。全长sHASEGP描述于SEQIDNo.I中，并由SEQIDNO.6或其简并型编码。本发明也提供了sHASEGP的透明质酸酶结构域的突变蛋白，特别是这样的突变蛋白，其中，透明质酸酶结构域的游离Cys残基(即，不与透明质酸酶结构域中的任何其它Cys残基形成二硫键)被另一氨基酸取代基所取代，通常，尽管不是必须的，是被保守的氨基酸取代基或不会消除活性的取代基所取代，还提供了这样的突变蛋白，其中，特定的糖基化位点被去除。sHASEGP多肽，包括但不限于其拼接变体，以及编码sHASEGPs及其结构域、衍生物和类似物的核酸在本文中被提供。也提供了单链分泌型的透明质酸酶糖蛋白，其具有在功能上与通过激活信号肽形成sHASEGP而产生的N-末端相等价的N-末端。在sHASEGP的N82、N166、N235、N254、N368、N393、N490处具有7个潜在的N-连接糖基化位点，如SEQIDNO:I中所例示。在半胱氨酸残基C60-C351和半胱氨酸残基C224至C238之间形成二硫键，从而形成核心的透明质酸酶结构域。然而，在羧基末端，额外的半胱氨酸对于中性酶催化活性是被要求的，这样，在SEQIDNo.I中，从氨基酸36到Cys464的sHASEGP构成了最小化的活性人sHASEGP透明质酸酶结构域。因此，N-连接糖基化位点N-490对于适当的sHASEGP活性并不是必需的。sHASEGP的N-连接糖基化作用对于它们的催化活性和稳定性是至关重要的。尽管改变修饰糖蛋白的聚糖的类型会对蛋白质的抗原性、结构折叠、溶解性和稳定性产生巨大的影响，然而大部分的酶并不被认为为了最佳酶活性而需要糖基化作用。就此而言，sHASEGPs因而是独特的，去除N-连接糖基化作用可能导致透明质酸酶活性几乎完全失活。N-连接聚糖的存在对于产生活性的sHASEGP是至关重要的。本发明包括了适于将至关重要的N-连接糖基化残基引入sHASEGP的蛋白质表达系统。此外，本发明也包括在能够引入N-连接聚糖的提取物存在的条件下，引入去糖基化的sHASEGP多肽。在本发明的一个方面，描述了用唾液酸化(sialation)加帽的复杂糖基化作用，而用游离甘露糖残基加帽的其它糖基化作用也被考虑到。优选地，唾液酸残基被发现于sHASEGP的N-连接糖基化作用的末端残基中。N-连接的寡糖分为几个主要的类型(甘露寡糖(oligomannose)、复合的、杂合的、硫酸化的)，它们都通过在-Asn-Xaa-Thr/Ser-序列(其中Xaa不是Pro)中的Asn残基的酰胺氮附着于(Man)3-GlcNAc-GlcNAc-核心。已经报道过凝集蛋白C在-Asn-Xaa-Cys-位点的糖基化作用。在测序期间，N-连接位点常常可由“空白(blank)”循环的出现而间接指示出来。可以在由PNGaseF释放寡糖之后，进行阳性鉴定，PNGaseF将糖基化Asn转变为Asp。PNGaseF进行释放之后，N-连接的寡糖可以用Bio-GelP_6层析进行纯化，对寡糖收集物进行制备型高pH阴离子交换层析(HPAEC)(Townsendetal.，(1989)Anal.Biochem.182，1-8)。某些寡糖异构体可以用HPAEC分离。在HPAEC层析谱中海藻糖残基将较早地变换洗脱位置，而其他唾液酸残基将会增加滞留时间。其寡糖结构已知的糖蛋白(例如牛胎球蛋白、α-I酸性糖蛋白、卵白蛋白、RNAseB、转铁蛋白)被同时进行处理，这将方便寡糖峰的指认。收集到的寡糖可以用成分分析和甲基化连接分析的组合方法进行表征(ffaegheetal.,(1983)CarbohydrRes.123，281-304.),利用NMR光谱术来测定端基异构构造(anomericconfigurations)(VanHalbeek(1993)inMethodsEnzymol230)。本发明也提供了sHASEGP的制剂。sHASEGPs可以配制成冻干的形式和稳定化的溶液。含有特定的金属离子诸如钙、镁或钠的制剂，可以用于在中性PH时获得最佳活性。除了稳定化的溶液制剂外，缓慢释放的制剂也被考虑到，其可以用于延长去除糖胺聚糖的过程。还提供了试剂盒，其提供了带有sHASEGP的预先包装好的注射器，以便在眼内外科操作和其他小体积操作中给予小体积的sHASEGP。本发明也提供了可离体用于人工再生技术程序(artificialreproductivetechnologyprocedures)的平衡盐制剂(Balancedsaltformulations)。本发明也提供了将sHASEGP用于去除糖胺聚糖的方法。sHASEGP通过降解糖胺聚糖，在间隙中打开通道，使得尺寸小于500nm的分子得以扩散。取决于剂量和制剂，这些通·道可保持24-48小时。此种通道可以被用来协助外源添加的分子的扩散，所述外源添加的分子例如流体、小分子、蛋白质、核酸和基因治疗载体和其他尺寸小于500nm的分子。sHASEGPs也可以被用于去除过量的糖胺聚糖，诸如在缺血再灌注、炎症、动脉硬化、水肿、癌症、脊髓损伤和其他形式的创伤之后出现的那些糖胺聚糖。在一些情况下，sHASEGP可以通过静脉灌输被全身性地传送。当局部位置不能到达时，可能是有好处的，例如心脏或脑或在播散性肿瘤的情况下，其中，疾病是全身性的。相对于缺少末端唾液酸的天然透明质酸酶，超唾液酸化的sHASEGP可优选用于增加血清半衰期和分布。在某些情形中，诸如在脊髓损伤、青光眼和妆容处理的情形中，优选进行持续的传送。在其他适应症中，优选单次短期作用剂量(singleshortactingdose)。暂时地去除糖胺聚糖可以被用来增强将溶液和药物传送入间质空间。这对于麻醉剂的扩散是有用的，对于治疗性流体、分子和蛋白质的给药也是有用的。在sHASEGP存在的条件下，分子的皮下给药和肌内给药也帮助它们更快地分布于全身。当静脉内途径不能被利用或需要分子更快地进行全身性传送时，此种方法是非常有用的。其他大分子诸如因子VIII——其在皮下给药时的生物利用度很差——的传送可以通过与sHASEGP—起注射来完成，从而增加它们的可利用度。也提供了使用sHASEGP来酶促地去除卵母细胞周围的卵丘(积云)基质(cumulusmatrix)。使用提取得到的透明质酸酶的不含毒性污染物的纯化sHASEGP来去除卵丘基质，可使得卵母细胞以更强的存活能力被更温和地收回。而且，sHASEGP可以在不使用携带病毒和其他病原体诸如可传递的海绵状脑病的牛提取物或其他生物体的情况下进行制备。用于眼内用途的小体积的sHASEGP的注射，也可以应用于较小的空间。SHASEGPs可以被注射入眼睛的眼睛前房，以去除在手术期间被施用的过量的粘弹性底物。sHASEGP的眼内注射也可以被用于降低青光眼中的眼内压、溶解玻璃体聚集物或“漂浮物”、清除玻璃体出血，用于治疗黄斑变性、促进糖尿病视网膜病变中的玻璃体视网膜脱离、用于与其他酶相混合来促进角膜经矫正镜片的再塑。将会认识到，在一些情况下，sHASEGP诸如聚乙二醇化的sHASEGP的持续长时间的使用会是有利的。sHASEGP与其他物质组成的联合制剂(co-formulations)也被考虑用作注射笔(injectablepens)，以用于少量的或快速的皮下给药。可以被配制的例子诸如胰岛素和其他流体。本发明的方法包括，在给予其他治疗性分子之前、同时或之后，给予sHASEGP多肽或含有sHASEGP的药物组合物。sHASEGP可以在与其他治疗分子的给药位点不同的位点给药，或sHASEGP可以在与其他治疗分子的给药位点相同的位点给药。因此，本发明提供了命名为sHASEGP的真核细胞分泌型中性活性透明质酸酶糖蛋白家族、以及其功能结构域，特别是其透明质酸酶(或催化)结构域、突变蛋白和其他衍生物和类似物。也提供了编码sHASEGPs的核酸。此外，还提供了所述sHASEGP的制剂和所述sHASEGP在治疗疾病中的治疗用途和作为组织修饰酶的用途。附图简述图I是sHASEGP载体HZ24的载体图。发明详述A.定义除非另外指出，本文所使用的技术和科学术语与本发明所属
技术领域：
技术人员的常规理解具有相同的含义。除非另外指出，在本文的全部公开内容中所引用的所有专利、专利申请、公开的申请和出版物、Genbank序列、网址和其他公开材料通过弓I用方式将其整体并入本文。如果对于本文中的术语有许多定义，以这部分中的定义为主。当引用URL或其他此种标识或编址时，应该理解的是，此种标识可以变化，因特网上的特定信息可以来来往往，但是通过搜索因特网可以找到等同的信息。因此，所述的引用证明了信息是可利用的且是公开传播的。如本文中所使用的，除非另外指出，任何保护基团、氨基酸和其他化合物的缩写依据它们的常规用法、标识缩写或IUPAC-IUBCommissiononBiochemicalNomenclature(参见(1972)Biochem.11:942-944)。如本文中所使用的，真核透明质酸酶是指各种不同家族的糖胺聚糖内切氨基葡萄糖苷酶，其中，透明质酸酶中的谷氨酸残基通过酸-碱催化机制水解透明质酸和硫酸软骨素的β_1，4键。特别感兴趣的是哺乳动物的sHASEGP，包括人来源的sHASEGP。本领域技术人员将认识到，一般来说，在多肽的非实质性区域的单个氨基酸替代基本上不改变生物学活性(参见如Watsonetal.,(1987)MolecularBiologyoftheGene,4thEdition,TheBenjamin/CummingsPub.co.,p.224)。如本文中所使用的，膜锚定sHASEGP(membraneanchoredsHASEGP)是指膜锚定的透明质酸酶家族，其具有本文中描述的共同结构特征。如本文中所使用的,可溶性透明质酸酶(solublehyaluronidase)是指在生理条件下具有溶解性的多肽。可溶性HASEGP例如可以通过它分配进入加温到37°C的TritonX-114溶液的水相而被辨别(BordieretaljBiolChem.1981Feb25;256(4):1604-7)。另一方面，脂锚定HASEGP(LipidanchoredHASEGP)将分配进入富含去污剂的相，但在用磷脂酶C处理后，将分配进入缺乏去污剂的相或水相中。因此，在对例如“sHASEGP”进行引用时，包括了由sHASEGP基因家族编码的所有糖蛋白，包括但不限于:人sHASEGP、小鼠sHASEGP，或从任何其他来源获得的等同分子，其或者合成制备而得，或者显示出同样的活性。示范性的sHASEGP和/或其结构域的编码核酸分子序列和编码的氨基酸序列描述于例如SEQIDN0:4中。该术语也包括具有氨基酸替代的sHASEGP，所述替代基本上不改变每一成员的活性，该术语也包含其拼接变体(splicevariants)0合适的替代，包括——尽管不一定是——氨基酸的保守替代，是本领域技术人员已道的，并且这样的替代可以在不消除所得分子的生物活性诸如催化活性的情况下进行。如本文中所使用的，在本文中无论什么时候被引用时，sHASEGP都包括至少一个或所有或任何组合的下述物质由SEQIDNO.6中阐述的核苷酸序列编码的多肽，或由包括编码SEQIDNo.I的氨基酸1-509的核苷酸的核苷酸序列编码的多肽；由在低、中等或高严紧型条件下与SEQIDNO.6中所述的核苷酸序列杂交的核苷酸序列编码的多肽；包括SEQIDNo.I的氨基酸1-509所述的氨基酸序列的多肽；包括与SEQIDNo.I中所述的氨基酸序列或SEQIDNo.4中的氨基酸1-448的序列具有至少约60%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列的多肽。特别地，提供了sHASEGP多肽，其具有SEQIDNo.4所示的透明质酸酶结构域。该多肽是单链多肽或双链多肽。本发明也提供了保留有透明质酸酶活性的其更小的部分。sHASEGPs的透明质酸酶结构域在尺寸上和构成上有所变化，可以包括在表面环(surfaceloops)上的插入和缺失。因此,对于本文的目的,催化结构域是sHASEGP的一部分，如本文中所定义，并且与先前已被鉴定的其他透明质酸酶样序列(hyaluronidaselikesequences)诸如HYALI、HYAL2、HYAL3的结构域相同源；然而，还未发现，分离的单链形式的人透明质酸酶结构域能在体外测定中发挥功能。对活性而言所必需的天冬氨酸和谷氨酸残基存在于保守的基序(motifs)中。如本文中所使用的，“可溶性sHASEGP的中性透明质酸酶结构域(neutralhyaluronidasedomainofasolublesHASEGP)”是指sHASEGP的β-1,4内切氨基葡萄糖苷酶结构域，其在中性PH中显示出透明质酸酶活性，在所述的条件下是可溶性的，并且与透明质酸酶糖基-水解酶家族结构域具有同源性和共同的结构特征，但在羧基末端含有额外的序列，这对于中性条件下的活性是必需的。因此，它至少是在标准的体外分析评价中显示出透明质酸酶活性并保留可溶性的结构域的最小化的部分。本文中所考虑的是这样的透明质酸酶结构域和其催化活性部分。本发明也提供了截短形式的透明质酸酶结构域，包括其最小的片段，它以单链形式发挥催化作用。在本文中无论什么时候被引用，sHASEGP的透明质酸酶结构域都包括下述多肽中的至少一个或所有或任何组合或催化活性部分包括SEQIDNo.I所述的氨基酸序列的N-连接糖蛋白多肽；由在低、中等或高严紧型条件下与SEQIDNO.6中所述的核苷酸序列杂交的核苷酸序列编码的多肽；包括SEQIDNo.I中所述的氨基酸序列的多肽；包括与SEQIDNo.I中所述的氨基酸序列具有至少约70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一1注的氨基酸序列的多肽，和/或由sHASEGP的拼接变体编码的多肽的透明质酸酶结构域。因此，对于本文的目的，透明质酸酶结构域是sHASEGP的一部分，如本文中所定义，并且与其他sHASEGP的结构域同源。对于透明质酸酶家族的更大的分类的酶，sHASEGP催化结构域享有高度的氨基酸序列同一性。对于活性所必需的Asp和Glu残基存在于保守基序中。至于活性形式，是指在体内和/或体外具有活性的形式。如本文中所描述的，透明质酸酶结构域也能以可溶的分泌的糖蛋白的形式存在。本文已经显示，至少在体外，单链形式的sHASEGP和其催化结构域或酶活性部分(通常C-末端截短)显示出透明质酸酶活性。因此，本文中提供的是分离形式的sHASEGP的透明质酸酶结构域，以及它们在体外药物筛选分析中的应用，所述体外药物筛选分析用于鉴定调节其活性的试剂。如本文中所使用的，sHASEGP的催化活性结构域是指中性活性的内切氨基葡萄糖苷酶结构域，如通过针对糖胺聚糖底物的体外活性所限定的。感兴趣的sHASEGPs包括那些在体内和体外对硫酸软骨素和硫酸软骨素蛋白聚糖(CSPG’s)具有活性的sHASEGPs;和那些对透明质酸具有活性的sHASEGPs。如本文中所使用的，人sHASEGP是由存在于人基因组中的核酸诸如DNA编码的sHASEGP，包括所有的等位基因变体和保守变异，只要它们不是在其他哺乳动物中发现的变体就可以。如本文中所使用的，编码sHASEGP的透明质酸酶结构域或其催化活性部分的核酸可解释为只编码所述单链透明质酸酶结构域或其活性部分的核酸，该核酸不编码作为连续序列的sHASEGP的其他相邻部分。如本文中所使用的，“疾病(disease)”或“紊乱(disorder)”指由例如感染或遗传缺陷引起的生物体中的病理状态，并表征为可检测的症状。如本文中所使用的，拼接变体(splicevariant)是指对基因组核酸诸如DNA的初级转录物进行不同的加工而产生的变体，通过所述的不同的加工可以产生一种以上类型的mRNA。本文中提供了sHASEGPs的拼接变体。如本文中所使用的，sHASEGP蛋白的透明质酸酶结构域是指显示出中性内切氨基葡萄糖苷酶活性的sHASEGP透明质酸酶结构域。因此，它至少是蛋白质的最小的部分，其显示出用标准的体外分析所评价的内切氨基葡萄糖苷酶活性。示范性的人透明质酸酶结构域包括SEQIDNo.4所述的氨基酸序列的至少一个足以显示出内切氨基葡萄糖苷酶活性的部分。本发明也考虑了这样的核酸分子，其编码在体外透明质酸酶分析中具有内切氨基葡萄糖苷酶活性的多肽，并且与全长的sHASEGP多肽透明质酸酶结构域具有至少70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，或其沿着它们的全长或沿着全长的至少约70%、80%或90%与编码透明质酸酶结构域的核酸杂交，特别是在中等，通常为高严紧的条件下杂交。对于透明质酸酶结构域，在N-末端区域的残基可能对活性是至关重要的，但不是充分的。本文显示，sHASEGP的透明质酸酶结构域是具有催化活性的。因此，为了具有活性，透明质酸酶结构域通常需要N-末端氨基酸；C-末端部分可以被截短，直到最后的半胱氨酸残基还需要额外的氨基酸来获得最佳活性。通过用评价催化切割的体外分析来测试多肽的透明质酸酶活性，可以被截去的数量可以经验性地被确定。因此，本发明考虑了透明质酸酶结构域特别是单链结构域的较小部分，其保留透明质酸酶活性。这样的较小的形式一般是透明质酸酶结构域的C-端截短形式。透明质酸酶结构域在尺寸和构成上有所变化，包括在表面环中的插入和缺失。这样的结构域显示出保守的结构，包括至少一个结构特征，诸如质子供体，和/或内切氨基葡萄糖苷酶的透明质酸酶结构域的其他特征。因此,对于本文目的,透明质酸酶结构域是sHASEGP的一个单链部分，如本文中所述，但在它的结构特征和序列类似性或同源性的保留方面与其他透明质酸酶样序列的透明质酸酶结构域具有同源性。作为单链，该糖蛋白显示出透明质酸酶活性。如本文中所使用的，同源性是指约大于25%的核酸序列同一注，诸如25%、40%、60%、70%、80%、90%或95%。如果有必要的话，百分同源性将被明确说明。术语“同源性(homology)”和“同一性(identity)”常常交换使用。总之，将序列进行联配比对，以便获得最高级别的匹配。(参见如ComputationalMolecularBiology,Lesk,A.Μ.，ed.，OxfordUniversityPress,NewYork,1988；Biocomputing:InformaticsandGenomeProjects,Smith,D.W.，ed.，AcademicPress,NewYork,1993；ComputerAnalysisofSequenceData,Part/，Griffin,A.M.，andGriffin,H.G.，eds.，HumanaPress,NewJersey,1994；SequenceAnalysisinMolecularBiology,vonHeinjejG.,AcademicPress,1987和SequenceAnalysisPrimer,Gribskov,M.andDevereuxjJ.,eds.,MStocktonPress,NewYork,1991；CarilloetAl.(1988)etal.(1988)SlamJAppliedMath48):1073)。依照序列同一性，保守氨基酸的数目通过标准的联配算法程序而被确定，其中使用由各供应商设立的默认缺口罚值。基本上同源的核酸分子将通常沿着感兴趣的核酸分子的全长或沿着全长的至少约70%、80%或90%，在中等严紧度或高严紧度的条件下发生杂交。本发明也考虑了这样的核酸分子，其包含了简并密码子来替代杂交核酸分子中的密码子。两种核酸分子是否具有至少例如80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%“同一性”的核苷酸序列，可以使用已知的计算机算法诸如“FASTA”程序来确定，使用例如Pearsonetal(1988)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA85]:2444中的默认参数(其它程序包括GCG程序包(Devereux,J.，etal,NucleicAcidsResearch12:387(1984)),BLASTP,BLASTN,FASTA(Atschul,[S.][F.,][ETAL,JMOLECBIOL215]:403(1990)；GuidetoHugeComputers,MartinJ.Bishop,[ED.,!AcademicPress,SanDiego,1994,[CARILLOETA/·](1988)SIAMJAppliedMath48:1073)。例如，美国国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)数据库的BLAST功能可以被用于确定同一性。其他商业的或公用的程序包括DNASTAR〃MEGALIGN〃PROGRAM(Madison,WI)和威斯康星大学GeneticsComputerGroup(UWG)〃Gap〃程序(MadisonWI))。蛋白质和/或核酸分子的百分同源性或同一性可以例如通过使用GAP计算机程序来比较序列信息而得以测定，GAP计算机程序例如Needlemanetal.(1970),JMolBiol.48:443,按照SmithandffatermanAdv.Appl.Math(1981)2:482的修改。简言之，GAP程序将相似性定义为，相似的联配符号(即，核苷酸或氨基酸)的数目除以两条序列中较短的一条中的符号总数。GAP程序的默认参数可以包括(I)一元比较阵列(unarycomparisonmatrix)(对于同一的情况，所包含的值为1，对于非同一的情况，值为0)和Gribskovetal(1986)Nucl.AcidsRes.14:6745的加权比较阵列(weightedcomparisonmatrix),如SchwartzandDayhoff,eds.,AtlasOfProteinSequenceAndStructure,NationalBiomedicalResearchFoundation,pp.353-358(1979)描述;(2)每一缺口的罚值为3.0，每一缺口中的每一符号的附加罚值为O.10;和(3)末端缺口无罚值。因此，如本文中所使用的，术语“同一性”代表了受测和参考多肽或多核苷酸之间的比较。如本文中所使用的，术语“至少90%同一性”是指相对于参考多肽的90至99.99的百分同一性。90%或更高水平的同一性表明这样一个事实，示例性地假设100个氨基酸长的受测和参考多核苷酸被比较的话，在受测多核苷酸中不超过10%(即100个中的10个)的氨基酸与参考多肽的氨基酸不同。在受测和参考多核苷酸之间，可以进行类似的比较。这样的差异可以体现为在全长的氨基酸序列中随机分布的点突变，或可以它们可以聚集在变化长度的一个或多个位置，最高可至所允许的最大值，例如10/100的氨基酸差异(约90%同源性)。差异可以定义为核酸或氨基酸的替代或缺失。在同源性或同一性的水平超过约85-90%时，结果应该不依赖于程序和缺口参数设置。这样的高水平的同一性可以很容易进行评估，通常不需要依靠软件。如本文中所使用的，引物是指包含2个或更多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的寡核苷酸，通常大于3个，由所述引物可以启动引物延伸产物的合成。有助于合成的实验条件包括存在核苷三磷酸和用于聚合反应和延伸的试剂，诸如DNA聚合酶，以及合适的缓冲液、温度和pH。如本文中所使用的，动物包括任何动物，诸如但不限于山羊、牛、鹿、绵羊、啮齿类动物、猪和人。非人动物是指除了人之外的被考虑到的动物。所提供的sHASEGPs来自任何来源，动物、植物、原核生物和真菌。大部分的sHASEGP来源于动物，包括哺乳动物来源。如本文中所使用的，遗传疗法涉及将异源核酸例如DNA转移到哺乳动物特别是人的某些细胞，即靶细胞，所述动物具有此疗法所要解决的紊乱或症状。核酸例如DNA以这样的方式导入所选择的靶细胞，即，使得该异源核酸例如DNA被表达并且所编码的治疗性产物由此产生。可选择地，异源核酸，例如DNA，可以以某方式介导编码治疗性产物的DNA的表达，或它可以编码某产物，例如肽或RNA，其以某方式直接或间接地介导治疗性产物的表达。遗传疗法也可以被用来传送编码某基因产物的核酸，其替代缺陷的基因，或补充由导入有所述核酸的哺乳动物或细胞产生的基因产物。导入的核酸可以编码治疗化合物，诸如其生长因子抑制剂，或其肿瘤坏死因子或抑制剂，诸如受体，这些治疗化合物一般情况下不产生于哺乳动物宿主中，或不以治疗上有效的量或不在治疗上有用的时间产生。在导入到病痛的宿主的细胞中之前，编码治疗性产物的异源核酸例如DNA可以被修饰，以增强或改变该产物或其表达。遗传疗法也可以涉及传送基因表达的抑制剂或阻抑物或其他调节物。如本文中所使用的，异源核酸是这样的核酸，该核酸和(如果DNA是编码RNA)蛋白质在正常情况下不由表达所述异源核酸的细胞在体内产生，或者异源核酸介导内源性核酸例如DNA的表达或编码改变内源性核酸例如DNA的表达的调节物，所述介导或改变是通过影响转录、翻译或其他可调节的生物化学过程来实现的。异源核酸，例如DNA，也可以称为外源核酸，例如DNA。本领域技术人员将其识别为或考虑为对于表达它的细胞来说是异源的或外来的任何核酸例如DNA，均包括在本文的异源核酸之内；异源核酸包括外源性加入的核酸，其也被内源性表达。异源核酸的例子包括，但不限于编码可追踪的标记蛋白的核酸，所述的可追踪的标记蛋白例如赋予药物抗性的蛋白；编码治疗上有效的物质的核酸，所述的治疗上有效的物质例如抗癌剂、酶和激素；和编码其他类型的蛋白例如抗体的核酸，例如DNA。由异源核酸编码的抗体可以分泌或表达在已经导入有该异源核酸的细胞的表面。通常，异源核酸在遗传上对于导入它的细胞来说不是内源性的，但是已经从别的细胞获得或通过合成制备得到。一般地，尽管不是必需的，这样的核酸编码的RNA和蛋白质在正常情况下不由表达它的细胞产生。如本文中所使用的，治疗上有效的产物是由异源核酸——通常是DNA——编码的产物，一旦将该核酸导入到宿主中后，产物被表达，可缓解或消除作为遗传疾病或获得性疾病的表现的症状，或者该产物治愈该疾病。如本文中所使用的，糖蛋白基本上由透明质酸酶结构域组成的这一叙述是指，仅仅多肽的sHASEGP部分是透明质酸酶结构域或其催化活性部分。该多肽可以任选地——并且一般将包括——额外的非sHASEGP衍生的氨基酸序列。如本文中所使用的，结构域(domain)是指分子例如糖蛋白或编码核酸的某部分，其在结构上和/或功能上不同于该分子的其他部分。如本文中所使用的,透明质酸酶(hyaluronidase)是指催化糖胺聚糖的水解的酶。为了清楚起见，引用透明质酸酶时，是表示所有的形式，特定的形式将被特别地指出。对于本文的目的，透明质酸酶结构域包括膜结合的和可溶形式的sHASEGP蛋白。如本文中所使用的，核酸包括DNA、RNA和其类似物，包括蛋白核酸(proteinnucleicacids,PNA)和其混合物。核酸可以是单链或双链的。当指探针或引物时-其用可检测的标记诸如荧光或放射性标记任选地标记，通常考虑单链分子。这样的分子通常是这样的长度，即，其使得在探察或起动一个文库时它们的靶标是统计上独特的或低拷贝数的(通常小于5，一般小于3)。一般地，探针或引物含有与感兴趣的基因互补或相同的至少14、16或30个连续的序列。探针和引物的长度可以是10、20、30、50、100或更多的核苷酸。如本文中所使用的，编码sHASEGP片段或部分的核酸是指仅编码所述的sHASEGP片段或部分，但不编码sHASEGP的其他相邻部分的核酸。如本文中所使用的，异源核酸与调节或效应(effector)核苷酸序列，例如启动子、增强子、转录和翻译终止位点和其他信号序列的有效连接(operativelinkage)是指此种核酸例如DNA和此种核苷酸序列之间的关系。例如，异源DNA与启动子的有效连接是指DNA和启动子之间的一种物理关系，依据这样的关系，此种DNA的转录由RNA聚合酶从启动子处启动，所述RNA聚合酶特异性地识别、结合并转录阅读框中的DNA。因此，有效连接或操作性地结合是指，核酸例如DNA与调节和效应核苷酸序列例如启动子、增强子、转录和翻译终止位点或其他信号序列之间的功能关系。例如，DNA与启动子之间的有效连接是指DNA和启动子之间的物理和功能关系，依据这样的关系，此种DNA的转录由RNA聚合酶从启动子开始启动，所述RNA聚合酶特异性识别、结合并转录DNA。为了优化表达和/或体外转录，可能有必要去除、添加或改变克隆的5’非翻译部分，以消除多余的、潜在不合适的选择性翻译起始(即，起始)密码子或其他序列，这样密码子或其他序列或在转录水平或在翻译水平干扰或减少表达。可选择地，共有的核糖体结合位点(参见如KozakJ.Biol.Chem.266:19867-19870(1991))可以紧挨着起始密码子的5’端插入，从而可以增强表达。对此种修饰的愿望(或需要)可以经验性地被确定。如本文中所使用的，与RNA的至少一部分相互补的序列，称为反义寡核苷酸，是指这样的序列，其与RNA充分互补，能与RNA杂交，一般是在中等或高严紧型条件下杂交，形成稳定的双螺旋；在双链sHASEGP反义核酸的情况下，可以测试双螺旋DNA(或dsRNA)的单链，或可以分析三股螺旋的形成。杂交的能力取决于互补的程度和反义核酸的长度。一般地，杂交核酸越长，它能够容纳的与sHASEGP的编码RNA的错配越多，并且依然能形成稳定的双螺旋(或三股螺旋，如果可能的话)。通过使用标准的程序去测定杂交复合体的熔点，本领域技术人员可以确定错配的可容忍程度。至于本文目的，只要所得到的蛋白质显示有透明质酸酶活性，氨基酸替代可以在任何的sHASEGPs和其透明质酸酶结构域进行。所考虑的氨基酸替代包括保守性替代，例如表I中所述的那些，其不会消除蛋白水解活性。如本文中所描述的，也考虑了改变蛋白质的特性的替代，例如去除切割位点和其他此类位点。此类替代一般是非保守的，但会容易地被本领域技术人员完成。合适的氨基酸保守性替代是本领域技术人员已知的，一般可以在不改变所得分子的生物活性如酶活性的情况下进行。本领域技术人员将认识到，一般来说，在多肽的非必需区域进行的单个氨基酸的替代基本上不会改变生物学活性(参见如Watsonetal.MolecularBiologyoftheGene,4thEdition,1987,TheBenjamin/CummingsPub.CO.,p.224)。同样包括在该限定中的是，sHASEGP的催化活性片段，特别是单链透明质酸酶部分。可以进行的保守的氨基酸替代例如下面表I所述。表I原始残基保守性替代Ala(A)Gly;Ser,AbuArg(R)Lys,ornAsn(N)Gln；HisCys(C)SerGin(Q)AsnGlu(E)ASPGly(G)Ala；ProHis(H)Asn；GinHe(I)Leu；Val；Met；Nle；NvaLeu(L)；Val；Met；Nle；NvLys(K)Arg；Gin；GluMet(M)Leu；Tyr；Ile；NLeValOrnitineLys；ArgPhe(F)Met；Leu；TyrSer(S)ThrThr(T)SerTrp(W)TyrTyr(Y)Trp；PheVal(V)ILE；Leu；Met；Nle;Nv。其他的替代也是允许的，并可以经验性地确定，或根据已知的保守替代来确定。如本文中所使用的，Abu是2-氨基丁酸；0rn是鸟氨酸。如本文中所使用的，本文中出现的各种氨基酸序列中的氨基酸是根据它们公知的三字母或一字母缩写来表示的。出现在各种DNA片段中的核苷酸，是用本领域常规使用的标准的单字母标识来表示的。如本文中所使用的，基于公开于本文中的核苷酸序列的探针或引物，包括SEQIDNO.6的至少10、14，通常至少16个连续的核苷酸序列，SEQIDNO.6的至少30、50或100个连续的核苷酸序列的探针。用于特定杂交的探针或引物的长度是感兴趣的基因组的复杂度的函数。如本文中所使用的，通过给予特定的药物组合物而导致的特定紊乱的症状的缓解是指归因为组合物的给予或与组合物的给予相关的任何的减轻，无论是永久的还是暂时的，持续的还是瞬时的。如本文中所使用的，反义多核苷酸是指合成的核苷酸碱基序列，其与mRNA或双链DNA的有义链相互补。有义和反义多核苷酸的混合物在合适的条件下导致两分子的结合或杂交。当这些多核苷酸与mRNA结合(杂交)时,蛋白质合成(翻译)的抑制发生。当这些多核苷酸结合到双链DNA时，RNA合成(转录)的抑制发生。所产生的翻译和/或转录的抑制作用抑制了有义链编码的蛋白质的合成。反义核酸分子通常含有足够数目的核苷酸来特异性地结合目标核酸，通常有至少5个连续的核苷酸，常常至少14或16或30个连续的核苷酸或修饰的核苷酸，与编码感兴趣的基因的核酸分子的编码区域相互补，例如与编码sHASEGP的单链透明质酸酶结构域的核酸互补。如本文中所使用的，阵列是指元素例如抗体的集合，其含有3个或更多的成员。可寻址阵列(addressablearray)是这样的阵列,在其中，阵列的成员一般可以通过在固相支持物上的位置而被鉴定。因此，一般而言，阵列的成员被固定在固相表面的离散的可鉴定的位点上。如本文中所使用的，抗体指免疫球蛋白，其是天然的或者部分或全部合成产生的，包括它们的保留有抗体特异性结合能力的任何衍生物。因此，抗体包括具有结合结构域的任何蛋白质，所述结合结构域与免疫球蛋白结合结构域同源或基本上同源。抗体包括任何免疫球蛋白的成员，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。如本文中所使用的，抗体片段是指抗体的任何衍生物，其小于全长抗体，保留了全长抗体的特异性结合能力的至少一部分。抗体片段的例子包括，但不限于Fab、Fab’、·F(AB)2、单链Fvs(scFV)、FV、dsFV双功能抗体和Fd片段。片段可以包括例如通过二硫桥连接在一起的多条链。抗体片段通常含有至少50个氨基酸，典型地含有至少200个氨基酸。如本文中所使用的，Fv抗体片段是由一个可变重链结构域(VH)和一个可变轻链结构域通过非共价相互作用联系在一起而组成。如本文中所使用的，dsFV是指具有工程制造的分子间二硫键的Fv。如本文中所使用的，F(AB)2片段是用胃蛋白酶在pH4.0_4.5消化免疫球蛋白而得到的抗体片段；它可以通过重组方法来表达，从而产生等同的片段。如本文中所使用的，Fab片段是用木瓜蛋白酶消化免疫球蛋白而得到的抗体片段；它们可以通过重组方法被表达，从而产生等同的片段。如本文中所使用的，scFVs是指含有以任何顺序通过多肽连接子共价联系在一起的可变轻链V和可变重链(VH)的抗体片段。该连接子的长度可以使两个可变结构域在基本上无干扰的情况下连接起来。所述的连接子包括(Gly-Ser)η残基,其中遍布着一些Glu或Lys残基，以增加溶解性。如本文中所使用的，人源化抗体是指经修饰而包括人氨基酸序列的抗体，这样，施用于人时不会引起免疫应答。制备此种抗体的方法是已知的。例如，为了产生此种抗体，表达单克隆抗体的杂交瘤或其他原核或真核细胞诸如大肠杆菌或CHO细胞,可以用重组DNA技术来改变以表达这样的抗体，在其中非可变区的氨基酸组成是基于人抗体。已经设计出计算机程序来鉴定这样的区域。如本文中所使用的,双功能抗体(diabodies)是二聚体的scFV;双功能抗体通常具有比scFVs短的肽连接子，且它们一般是二聚体化。如本文中所使用的，通过使用重组DNA方法的重组手段的生产，是指使用已知的分子生物学方法来表达由克隆DNA编码的蛋白质。如本文中所使用的，术语“评价(assessing)”旨在包括定量和定性测定，这是为了获得存在于样品中的sHASEGP或其结构域的活性的绝对值，也可为了获得表征活性的水平的指数、比率、百分比、视觉结果或其他值。评价可以是直接的或间接的，实际被检测的化学物质当然不必一定是蛋白质水解产物本身，可以例如是其衍生物或一些其他的物质。如本文中所使用的，生物活性是指化合物的体内活性或由于体内给予化合物、组合物或其他混合物而弓I起的生理应答。因此，生物活性包括此种化合物、组合物和混合物的治疗效果和药物学活性。生物活性可以采用被设计用来测试或应用此种活性的体外系统来观察。因此，对于本文的目的，荧光素酶的生物活性是它的加氧酶活性，一旦底物被氧化之后，便产生光。如本文中所使用的，功能活性是指多肽或其部分，其显示出一种或多种与全长蛋白质相关的活性。功能活性包括，但不限于生物活性、催化或酶活性、抗原性(结合多肽或与多肽竞争来结合抗多肽抗体的能力)、免疫原性、形成多聚体的能力、特异性地结合多肽的受体或配体的能力。如本文中所使用的，共轭物(conjugate)指本文中提供的包括一个或多个sHASEGP的化合物，其包括sHASEGP，特别是其单链透明质酸酶结构域和一种或多种靶向试剂(targetingagents)。这些共轭物包括由重组方法产生的那些共轭物,如融合蛋白；由化学方法产生的那些共轭物，例如通过化学偶联产生的，如通过偶联到巯基基团；以及那些由其他任何方法产生的，其中至少一个sHASEGP或其结构域通过连接子直接或间接地连接至Li革巴向试剂。如本文中所使用的，革巴向试剂是任何组成部分(moiety),例如蛋白质或其有效部分，其特异性地将该共轭物结合于细胞表面受体，这可以使该共轭物或其sHASEGP部分内在化。靶向试剂也可以是例如促进或帮助共轭物亲合分离或纯化、将共轭物附着到表面、或检测共轭物或含有共轭物的复合物的试剂。如本文中所使用的，抗体共轭物是指其中的靶向试剂是抗体的共轭物。如本文中所使用的，分子的衍生物或类似物是指从分子衍生而来的一部分或修饰形式的分子。如本文中所使用的，用于治疗特定疾病的化合物的有效量是指这样的量，其足以改善或以某方式减少与疾病相关的症状。这样的量可以以单次剂量被施给或可以依据疗程被施给，并因此产生效果。该数量可以治愈疾病，但通常，是为了改善疾病的症状而施用。反复的施用可能是为了获得理想的症状改善效果所必需的。如本文中所使用的，“等同的(equivalent)”,当用于两个核酸序列时，是指这两条在研究中的序列编码同样序列的氨基酸或等同的蛋白质。当“等同的”一词用于两个蛋白质或肽时，它是指这两个蛋白质或肽具有基本上相同的氨基酸序列，只有基本上不改变蛋白质或肽的活性或功能的氨基酸替代(例如但不限于保守替代，诸如上面表I所述的)。当“等同的”一词用于性质时，该性质不必以相同的程度存在(例如，两个肽对于相同类型的酶活性，可以显示出不同的速率)，但活性通常是基本上相同的。“互补的(Complementary)”，当用于两条核苷酸序列时，是指这两条核苷酸序列能够杂交，通常在相对的核苷酸之间具有小于25%、15%、5%或0%的错配。如果必要的话，互补的百分比将被指明。通常，所选择的这两个分子可以在高严紧的条件下杂交。如本文中所使用的，调节蛋白的活性或者基因或核酸的表达的试剂，降低或增加或者改变蛋白质的活性，或以某方式上调或下调或者改变核酸在细胞中的表达。如本文中所使用的，sHASEGP活性的抑制剂包括抑制或减少sHASEGP的产生、翻译后加工修饰、成熟或膜定位的任何物质，或者干扰或降低其蛋白水解效率一特别是在体外筛选分析中单链形式的蛋白的水解效率——的任何物质。如本文中所使用的，用于治疗或预防肿瘤性疾病的方法是指，任何的症状例如肿瘤、其转移、肿瘤的血管化作用或表征该疾病的其他参数被降低、改善、预防、置于缓解的状态、或维持在缓解的状态。也指肿瘤性疾病和转移的特征(hallmarks)可以通过该治疗而被消除、减少或预防。所述特征的非限制性的例子包括基底膜(basementmembrane)和附近的胞外基质不受控制的降解，内皮细胞迁移、分裂和组织成新的功能化毛细管，以及这样的功能化毛细管的维持。如本文中所使用的，共轭物的药学上可接收的盐、酯或其他衍生物包括任何的盐、酯或衍生物，它们可以由本领域技术人员使用已知的用于这样的衍生化作用的方法容易地制备得到，这样所产生的化合物能够施用于动物或人而基本上没有毒性效应，并且它们或者具有药物学活性或者是药物前体。如本文中所使用的，药物前体是指这样的化合物，其被体内施用之后，被代谢或转化为具有生物活性、药物学活性或治疗活性形式的化合物。为了产生药物前体，药物活性化合物被修饰，以便该活性化合物通过代谢过程被再生。药物前体可以被设计以改变药物的代谢稳定性或运送特征、以掩蔽副作用或毒性、以改善药物的风味，或者以改变药物的其他特征或性质。依据药物动力过程和体内药物代谢的知识，一旦知道了该药学活性化合物，本领域技术人员便可以设计该化合物的药物前体(参见如Nogrady(1985)MedicinalChemistryABiochemicalApproach,OxfordUniversityPress,NewYork,pages388-392)o如本文中所使用的，用本文中提供的筛选方法鉴定的药物，是指任何化合物，其是用作治疗剂或用作用于设计治疗剂的先导化合物的候选化合物。此类化合物可以是小分子，包括小的有机分子、肽、肽模拟物、反义分子或dsRNA，例如RNAi、抗体、抗体片段、重组抗体和其他此类化合物，其可以充当药物候选者或先导化合物。如本文中所使用的，肽模拟物(peptidomimetic)是这样的化合物,其模拟生物活性形式的特定肽的构象和某些立体化学特征。总的来说，肽模拟物被设计用来模拟化合物的某些期望的特性，但不模拟不想要的特性，诸如可导致生物活性构象丧失和键断裂的柔性。肽模拟物可以通过用生物等排物(bioisosteres)取代形成不想要的特性的某些基团或键，由生物活性化合物制备得到。生物等排物是本领域技术人员已知的。例如，亚甲基生物等排物CH2S已在脑啡肽类似物中被用作酰胺取代(参见如Spatola(1983)pp.267_357inChemistryandBiochemistryofAminoAcids,Peptides,andProteins,WeisteinjEd.volume7，MarcelDekkerjNewYork)。吗啡，可以口服给药，是内啡肽的肽模拟物化合物。对于本文的目的，环状肽被包括在肽模拟物之中。如本文中所使用的，启动子区域或启动子元件是指控制与之有效连接的DNA或RNA的转录的DNA或RNA片段。启动子区域包括特异性序列，其足以被RNA聚合酶识别、结合和起始转录。启动子区域的这一部分被称为启动子。此外，启动子区域包括调控RNA聚合酶的这种识别、结合和转录起始活性的序列。这些序列可以是顺式作用的，或可以对反式作用因子作出反应。依据调控的性质，启动子可以是组成型的或可以调控型的。被考虑用于原核生物的示范性启动子，包括噬菌体T7和T3启动子。如本文中所使用的，受体是指对于给定的配体具有亲和力的分子。受体可以是天然发生的或合成的分子。受体在本领域也可以指抗-配体(anti-ligands)。如本文中所使用的，受体和抗-配体是可互换的。受体可以在它们的未加以改变的状态下使用，或作为与其他物质的聚集体使用。受体可以直接地或通过特定的结合物质或连接物而间接地，共价地或非共价地或以物理接触的方式附着到结合组分上。受体的例子包括但不限于抗体、细胞膜受体表面受体和内在化受体(internalizingreceptors)、单克隆抗体和对诸如病毒、细胞或其他物质、药物、多核苷酸、核酸、肽、因子、凝集素、糖、多糖、细胞、细胞膜和细胞器上的特异性抗原决定簇具有活性的抗血清。受体的例子和使用此类受体的应用的例子，包括但不限于a)酶对微生物的存活至关重要的特定转运蛋白或酶，其可以充当抗生素[配体]选择的靶标；b)抗体抗体分子上的与感兴趣的抗原的表位相结合的配体结合位点的鉴定可以被研究；通过模拟抗原表位的序列的测定可以开发出疫苗，其中免疫原是基于一种或多种这样的序列，或可以开发出相关的诊断试剂或化合物，它们可以用于治疗例如自免疫疾病(auto-immunediseases)；c)核酸配体的鉴定,诸如蛋白质或RNA,结合位点；d)催化多肽聚合物,包括能够促进涉及将一种或多种反应物转化为一种或多种产物的化学反应的多肽；这样的多肽一般包括对至少一种反应物或反应中间产物具有特异性的结合位点，以及靠近该结合位点的功能活性，其中，该功能性能够通过化学的方法修饰被结合的反应物(参见美国专利5,215,899)；e)激素受体以高亲和力与受体相结合的配体的确定，可以用于开发激素替代疗法；例如，通过对结合此类受体的配体的鉴定可以开发出控制血压的药物；和f)鸦片受体在脑中结合鸦片受体的配体的确定，可以用于开发出吗啡和相关毒品的上瘾性较弱的替代品。如本文中所使用的，样品是指含有分析物分析所期望的分析物的任何物质。样品可以是生物学样品，例如生物流体或生物组织。生物流体的例子包括尿、血、血浆、血清、唾液、精液、大便、痰、脑脊髓液、眼泪、粘液、精液、羊水或类似物。生物组织是细胞的聚集体，通常是与它们的胞间物质一起形成的特定类型，其构成人、动物、植物、细菌、真菌或病毒结构的结构材料之一，包括结缔组织、上皮组织、肌肉和神经组织。生物组织的例子也包括器官、肿瘤、淋巴结、动脉和个体细胞。如本文中所使用的在测定错配百分比时的杂交严紧度描述如下1)高严紧度0.1XSSPE,0.1%SDS，65°C；2)中等严紧度0.2XSspE,O.1%SDS,50°C；3)低严紧度I.OXSspE,O.1%SDS，50°C。本领域技术人员知道选择洗涤步骤对稳定的杂交的选择作用，也知道SspE的成分(参见如Sambrook,E.F.Fritsch,T.Maniatis,in:MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdspringHarborLaboratoryPress1989Vol3,p.B.13，也参见描述常规使用的实验室溶液的大量目录)。SspE是pH7.4的磷酸盐缓冲的O.18NaCl。进一步地，本领域技术人员知道杂交的稳定性取决于TmT，它是钠离子浓度和温度的函数(Tm=81.5°C-16.6+0.41(%G+C)-600/L))，这样，在洗涤条件中仅有的对杂交稳定性至关重要的参数是SspE(或SSC)中的钠离子浓度和温度。应该理解的是，使用其它的缓冲液、盐和温度，可以获得等同的严紧度。作为例子而不是为了限制，使用低严紧度的条件的程序如下(也参见ShiloandWeinberg,Proc.Natl.AcadSciUSA78:6789-6792(1981)):含有DNA的滤膜在40°C预处理6小时，预处理在含有35%甲酰胺、5XSSC、50mMTris-HCl(pH7.5)、5mMEDTA、0.1%PVP、0.l%Ficoll、1%BSA和500ug/ml变性鲑鱼精DNA(IOX)的溶液中进行，SSC是I.5M氯化钠和O.15M柠檬酸钠，调节到pH7。杂交在同样的溶液中进行，作下述修改0.02%PVP、0.02%Ficoll、0.2%BSA、100VG/M精子DNA、10%(Wt/vol)葡聚糖硫酸酯和使用5-20X106cpm32P-标记的探针。滤膜在杂交混合物中40°C温育18-20小时，然后在55°C洗涤I.5小时，洗涤在含有2XSSC、25mMTris-HCKpH7.4)、5mMEDTA和O.1%SDS的溶液中进行。洗涤溶液用新鲜溶液更换，在60°C再温育I.5小时。将滤膜进行斑点干燥(blotteddry)并暴露以进行放射自显影。如果必要，滤膜可以在65-68°C进行第三次洗涤，并再暴露于胶片。可以使用的低严紧度的其他条件是本领域已知的，例如在种间交叉杂交(cross-specieshybridizations)中所使用的。作为例子而不是为了限制，使用中等严紧度的条件的程序包括但不限于含有DNA的滤膜在55°C预处理6小时，预处理在含有6XSSC、5XDenhart’s溶液、O.5%SDS和100μg/ml变性鲑鱼精DNA的溶液中进行。杂交在同样的溶液中进行，并使用5-20X10632P标记的探针。滤膜在55°C在杂交化合物中温育18-20小时，然后在60V洗潘30分钟，洗涤2次，洗涤在含有IXSSC和O.1%SDS的溶液中进行。将滤膜进行斑点干燥(blotteddry)并暴露以便放射自显影。可以使用的中等严紧度的其他条件是本领域已知的。对滤膜的洗涤在37°C进行I小时，洗涤在含有2XSSC、0.1%SDS的溶液中进行。作为例子而不是为了限制，使用高严紧度的条件的程序描述如下含有DNA的滤膜的预杂交在65°C进行8小时至过夜，预杂交在由6XSSC、50mMTris_HCl(pH7.5)UmMEDTA、0.02%PVP、0.02%Ficoll、0.02%BSA和500ug/ml变性鲑鱼精DNA组成的缓冲液中进行。滤膜在65°C杂交48小时，杂交在含有100ug/ml变性鲑鱼精DNA和5-20X106CPM32P标记探针的预杂交混合物中进行。滤膜的洗涤在37°C进行I小时，洗涤在含有2XSSC、0.01%PVP、0.01%Ficoll和0.01%BSA的溶液中进行。然后，在放射自显影之前，在50°C在0.IXSSC中洗涤45分钟。可以使用的高严紧型的其他条件是本领域熟知的。术语“基本上相同的”或“基本上同源的”或“类似的”随上下文而有所变化，这是相关
技术领域：
的技术人员所能理解的，一般是指至少60%或70%，优选至少80%、85%，或更优选的至少90%，最优选至少95%的同一性。如本文中所使用的，与产物基本上相同，是指足够地相似，以至于感兴趣的特性不足以被改变，这样，该基本上相同的产物可以用于替代所述产物。如本文中所使用的，基本上纯化的是指具有足够地匀质的，用标准的分析方法进行测定时似乎没有可易被检测到的杂质，标准的分析方法诸如薄层层析(TLC)、凝胶电泳和高效液相色谱(HPLC)，它们被本领域技术人员用来评估此类纯度，或指具有足够的纯度，以至于经过进一步的纯化作用，无法检测到物理和化学特性的改变，诸如物质的酶活性或生物活性的改变。对化合物进行纯化以产生化学上基本上纯的化合物的方法是本领域技术人员所知道的。化学上基本上纯的化合物然而可以是立体异构体或异构体的混合物。在这样的情况下，进一步的纯化可能增加混合物的比活性。如本文中所使用的，目标细胞(或靶细胞)指体内表达sHASEGP的细胞。如本文中所使用的，受测物质(或受测化合物)是指化学上定义的化合物(例如有机分子、无机分子、有机/无机分子、蛋白质、肽、核酸、寡核苷酸、脂、多糖、糖类，或这些分子的杂合物诸如糖蛋白等)或化合物的混合物(例如受测化合物文库、天然提取物或培养上清液等)，本文中提供了它们对sHASEGP，特别是包括了透明质酸酶结构域的单链形式或其具有足够活性的部分的效应，这可以通过体外方法例如本文所提供的分析方法进行测定。如本文中所使用的，术语治疗剂、治疗方案、辐射防护剂或化学治疗剂是指常规的药物和药物治疗，包括疫苗，其是本领域技术人员所知道的。辐射防护剂是本领域已知的。如本文中所使用的，治疗是指涉及状况、紊乱或疾病的症状得以改善或发生其他有利改变的任何方式。治疗也包括本文的组合物的任何药物学应用。如本文中所使用的，载体(或质粒)是指用于将异源核酸导入到细胞中以进行表达或复制的独立元件。载体通常保持为附加体(印isomal)，但也可以被设计成可以使得基因或其部分被整合入基因组染色体中。也考虑到人工染色体载体，诸如酵母人工染色体和哺乳动物人工染色体。此类载体的选择和使用对本领域技术人员来说是熟知的。表达载体包括能够表达DNA的载体，该DNA与调控序列有效连接，所述调控序列诸如启动子区域，其能够影响此类DNA片段的表达。因此，表达载体是指重组的DNA或RNA构建物，诸如质粒、噬菌体、重组病毒或其他载体，其一旦被导入合适的宿主细胞后，可以使克隆的DNA被表达。合适的表达载体对本领域技术人员来说是公知的，包括那些在原核细胞和/或真核细胞中可复制的载体，和那些保持为附加体的载体或那些整合入宿主细胞基因组的载体。如本文中所使用的，蛋白质结合序列是指这样的蛋白质或肽序列，其能够特异性结合到其他蛋白质或肽序列，一般地，是结合到一组蛋白质或肽序列，或结合到特定的蛋白质或妝序列。如本文中所使用的,表位标记(epitopetag)是指对应于表位的短的氨基酸残基链，它们有利于随后对具有该表位标记的蛋白质或肽进行生化和免疫学分析。通过将表位标记序列包括入合适表达载体中的蛋白质编码序列，可以完成对表位的标记。表位标记的蛋白质可以用高特异性的抗体进行亲合纯化，所述抗体是用该标记培育获得。如本文中所使用的，金属结合序列是指这样的蛋白质或肽序列，其能够特异性结合到金属离子，通常是一组金属离子，或结合到特定的金属离子。如本文中所使用的，组合或联合(combination)指两个或更多个元素之间的任何彡口口。如本文中所使用的，组合物指任何混合物。它可以是溶液、悬浮液、液体、粉、糊，含水的、不含水的或其任何组合。如本文中所使用的，流体指可以流动的任何组合物。因此流体包括半固体、膏、溶液、水混合物、胶、洗液、乳液形式的组合物，和任何其他这样的组合物。如本文中所使用的，细胞的提取物指由裂解的或破裂的细胞制得的制剂或组分。如本文中所使用的，当试剂是被随意选择而未考虑涉及单独蛋白质或蛋白质同与之联系的底物、结合伴侣(bindingpartners)等的结合的特异性序列时，该试剂被认为是随意选择的。随意选择的试剂的例子是使用化学文库或肽组合文库(peptidecombinatoriallibrary),或生物体的培养液或条件培养基。如本文中所使用的，当试剂是在非随机的基础上被选择并考虑到了目标位点的序列和/或它的与试剂的作用相关的构象时，该试剂被认为是理性选择的或设计的。如描述于实施例中的，在具有SEQIDNO:I或SEQIDNO:4的糖蛋白中，提出了透明质酸酶结合位点和(催化)位点。通过利用构成这些位点的肽序列，可以被理性地选择或理性地设计出试齐U。例如，理性选择的肽试剂可以是其氨基酸序列与ATP或钙调蛋白结合位点或结构域相同的肽。寡糖被认为具有还原端和非还原端，无论在还原端的糖是否实际上是还原糖。根据公认的命名法，本文在描述寡糖时将非还原端置于左边，将还原端置于右边。本文在描述所有的寡糖时，使用了非还原糖的名字或缩写(例如Gal)，然后是糖苷键的构型(α或β)、环键(ringbond)、在该键中涉及的还原糖的环位置,然后是还原糖的名字或缩写(例如GlcNAc)。两个糖之间的连接可以表示为例如2，3、2.fwdarw.3或(2，3)。每个糖均为吡喃糖。如本文中所使用的，N-连接糖部分(N-linkedsugarmoiety)是指通过Asn残基的酰胺氮附着到sHASEGP的寡糖。N-连接寡糖分为几个主要的类型(甘露寡糖、复合体、杂合物、硫酸化)，它们全都通过Asn残基的酰胺氮附着有(Man)3_GlcNAc_GlcNAc-核心,所述Asn残基落入-Asn-Xaa-Thr/Ser-序列中(其中，Xaa不是Pro)。在测序期间，N-连接位点常常可由“空白(blank)”循环的出现而间接指示出来。可以在由PNGaseF释放寡糖之后，进行阳性鉴定，PNGaseF将糖基化Asn转变为Asp。PNGaseF进行释放之后，N-连接的寡糖可以用Bio-GelP-6层析进行纯化，对寡糖收集物进行制备型高pH阴离子交换层析(HPAEC)(Townsendetal.,(1989)Anal.Biochem.182,1-8)。某些寡糖异构体可以用HPAEC分离。在HPAEC层析谱中海藻糖残基将较早地变换洗脱位置，而其他唾液酸残基将会增加滞留时间。其寡糖结构已知的糖蛋白(例如牛胎球蛋白、α-I酸性糖蛋白、卵白蛋白、RNAseB、转铁蛋白)被同时进行处理，这将方便寡糖峰的指认。收集到的寡糖可以用成分分析和甲基化连接分析的组合方法进行表征(Waegheetal.,(1983)CarbohydrRes.123,281-304.),利用NMR光谱术来测定端基异构构造(anomericconfigurations)(VanHalbeek(1993)inMethodsEnzymol230)。可选择地,寡糖可以用突光辅助碳水化合物电泳(FACE)进行鉴定。Callewaertetal.(2001)Glycobiology11,275-281。如本文中所使用的，术语“唾液酸”指九碳羧基化糖(carboxylatedsugars)家族的任何成员。唾液酸家族最常见的成员是N-乙酰神经氨酸(2-酮-5-乙酰胺-3，5-二脱氧-D-甘油基-D-galactononulopyranos-l-onicacid(常常缩写为Neu5Ac、NeuAc或NANA)。该家族的另一个成员是N-轻乙酰-神经氨酸(Neu5Gc或NeuGc),其中，NeuAc的N-乙酰基团被轻基化。唾液酸家族的第三个成员是2-酮-3-脱氧-nonulosonicacid(KDN)(Nadanoetal.(1986)J.Biol.Chem.261:11550-11557；Kanamorietal.(1990)J.Biol.Chem.265:21811-21819。该家族也包括9-取代的唾液酸，诸如9-0-C.sub.「C.sub.6酸基_Neu5Ac,如9_0_乳酸_Neu5Ac或9_0_乙酸_Neu5Ac、9_脱氧-9-氣_Neu5Ac和9-叠氮基-9-脱氧_Neu5Ac。对于唾液酸家族的综述,参见Varki(1992)Glycobiology2:25-40；SialicAcids:Chemistry,MetabolismandFunction,R.Schauer,Ed.(Springer-Verlag,N.Y.(1992))。唾液酸化合物在唾液酸化程序中的合成和应用公开于1992年10月I日公开的国际申请WO92/16640中。如本文中所使用的，PNGase是指天冬酰氨肽特异性N-糖苷酶F，诸如黄杆菌maningoseptum肽-N-糖苷酶F。PNGASE酶的特征为对N-连接寡糖而不对O-连接寡糖具有特异性。PNGASE效率的表征可以用SDSPAGE电泳或荧光辅助碳水化合物电泳来限定。如本文中所使用的,基本上末端化的唾液酸化作用(substantiallyterminatedsialation)是指用唾液酸残基作为末端糖进行末端化处理的N-连接寡糖。末端唾液酸可以通过用神经氨酸苷酶处理之后对释放的碳水化合物进行FACE分析来鉴定。糖蛋白在血液中的循环寿命(circulatorylifetime)很大程度取决于它的N-连接碳水化合物基团的组成和结构。该事实与打算经肠胃给药的治疗性糖蛋白直接相关。一般来说，糖蛋白的最大循环半衰期要求它的N-连接碳水化合物基团以序列NeuAc-Gal-GlcNAc终止。如果没有末端唾液酸(NeuAc)，糖蛋白通过涉及潜在的N-乙酰半乳糖胺(GaINAc)或半乳糖(Gal)残基的识别的机制,迅速从血液中清除掉(Goocheeetal.(1991)Biol/Technology9:1347-1355)。由于该原因，确保在治疗性糖蛋白的N-连接碳水化合物基团上存在末端唾液酸，对于它们的商业开发是重要的考虑因素。循环中的糖蛋白被暴露于能去除末端唾液酸残基的唾液酸酶(或神经氨酸苷酶)。通常，唾液酸的去除暴露半乳糖残基，这些残基被肝细胞中的半乳糖特异性受体识别并结合(综述于AshwellandHarford(1982)Ann.Rev.Biochem.51:531)月干脏也含有其他的糖特异性受体，其介导糖蛋白从循环中的清除。此类受体的特异性也包括N-乙酰葡糖胺、甘露糖、海藻糖和磷酸甘露糖。通过肝细胞的半乳糖受体而被清除的糖蛋白经历实质性的降解作用，然后进入胆汁；通过Kupffer细胞的甘露糖受体而被清除的糖蛋白进入网状内皮系统(综述于AshwellandHarford(1982)Ann.Rev.Biochem.51:53)如本文中所使用的，中性活性是指在pH5和8之间，在盐小于150mM和缓冲强度小于50mM的条件下，sHASEGP糖蛋白在体外对糖胺聚糖底物具有催化活性。如本文中所使用的，稳定的溶液是指在室温保存30天之后，保留大于60%的最初活性的sHASEGP。如本文中所使用的，除非另外特别指出，单位用池度降低单位(turbidityreducingunits,TRU)来表示。一个TRU被定义为降低透明质酸的酸化溶液的池度所需要的透明质酸酶活性的量，并等同于U.S.P./NationalFormulary(NFXIII)units(NFU)。本文中描述的ELISA样酶分析可以通过经U.S.P.标准化的透明质酸酶样品(例如USP或WHO标准)的标准曲线而与TRU、NFU和U.S.P.单位相关联。因此，用ELISA样酶分析测定的酶活性实际上是相对TRU，因为酶活性不是用浊度计分析实际测量得到的(Dorfmanetal.，1948，J.Biol.Chem.172:367)。如本文中所使用的，效价(potency)是用在体外降解底物所需要的sHASEGP蛋白的量来定义的，其基于池度降低单位或相对池度降低单位(RelativeTurbidityReducingUnit)。如本文中所使用的，比活性是指每毫克蛋白质的活性的单位数。sHASEGP蛋白的量定义为在280nm处sHASEGP溶液的吸光度，假定摩尔消光系数为近似I.7，单位为ΜΑπΓ1。聚乙二醇(PEG)已经被广泛用于生物材料、生物技术和医学中，主要是因为PEG是生物可相容的、无毒的、无免疫原性的和水溶性的聚合物(ZhaoandHarris,ACSSymposiumSeries680:458-72,1997)在药物传送领域，PEG衍生物已经被广泛用于共价附着到蛋白质(即"聚乙二醇化作用")，以减少免疫原性、蛋白水解和肾清除，并增强溶解性(Zalipsky，Adv.DrugDel.Rev.16:157-82，1995)。类似地，PEG已经被附着到低分子量的、相对疏水的药物上，以增加溶解性、减少毒性和改变生物分布(biodistribution)。通常，PEG化的药物作为溶液被注射。紧密相关的应用是合成交联的可降解的PEG网络或制剂以用于药物传送，用于设计可降解的可溶性药物载体的化学的许多方面也可以用于设计可降解的凝胶(Sawhneyetal.,Macromolecules26:581-87,1993)。还知道，大分子间的复合体可以通过混合两种互补的聚合物的溶液而形成。此类复合体一般通过所涉及的聚合物之间的静电相互作用(聚阴离子-聚阳离子)和/或氢键(聚酸-聚碱)，和/或通过在水环境中聚合物之间的疏水相互作用而得以稳定(Krupersetal.,Eur.PolymJ.32:785-790，1996)。例如，聚丙烯酸(PAAc)和聚氧乙烯(PEO)的混合溶液在合适的条件下，主要基于氢键而形成复合体。这些复合体在生理条件的解离作用已经被用于传送游离的(即，非PEG化的)药物。此外，互补聚合物的复合体已经由均聚物和共聚物形成。·在一个方面，聚乙二醇的分子量在约3kD至约50kD范围内，优选约5kD至约30kD范围内。通过已知的化学合成技术可将PEG共价附着到药物(称为“PEG化”或“聚乙二醇化”)。例如，在本发明的一个方面，蛋白质的PEG化可以通过在合适的反应条件下，通过将NHS活化的PEG与蛋白质反应而实现。尽管已经描述了无数的关于PEG化作用的反应，那些最经常使用的反应是赋予了方向性、使用温和的反应条件、并且不需要大量的下游工艺来去除毒性催化剂或副产物的反应。例如，单甲氧PEG(mPEG)只有一个活性末端羟基，因此它的使用一定程度地限制了所得到的PEG-蛋白产物混合物的异质性。与末端甲氧基基团相反的聚合物末端的羟基的激活通常是获得有效的蛋白质PEG化作用所必需的，目的是使得衍生的PEG更容易遭受亲核攻击。攻击性的亲核试剂通常是赖氨酰残基的ε-氨基基团，但是其他的胺也可以反应(例如组氨酸的N-末端α-胺或环胺)，如果局部条件是有利的话。在含有单个赖氨酸或半胱氨酸的蛋白质中可能发生更为定向的附着。后一残基可以被PEG-马来酰亚胺作为目标，用于硫醇特异性的修饰。可选择地，PEG酰肼可以与高碘酸盐氧化的sHASEGP反应，并在NaCNBH3存在的条件下被还原。更特别地，PEG化的CMP糖可以与sHASEGP在合适的糖基转移酶存在的条件下发生反应。一种技术是“聚乙二醇化作用”技术，其中，许多聚合物分子被偶联到被研究的多肽上。当使用该技术时，免疫系统难以识别形成抗体所需的多肽表面上的表位，从而减少免疫应答。对直接引入人体循环系统以给予特定的生理效应的多肽(即药品)，典型的潜在免疫应答是IgG和/或IgM应答，而通过呼吸系统吸入的多肽(即工业多肽)潜在地可以引起IgE应答(即过敏应答)。解释减少的免疫应答的理论之一是聚合物分子掩蔽了多肽表面上的表位，而正是这些表位对导致抗体形成的免疫应答负有责任。另一理论或至少部分因素是共轭物越重，所能获得的免疫应答的减少程度越大。偶联到多肽的聚合物分子可以是任何合适的聚合物分子，具有依据本发明所限定的分子量，包括天然的和合成的均聚物，诸如多元醇(即聚-0H)、聚胺(即聚-NH2)和聚羧酸(即聚-C00H)，以及进一步地，杂聚物，即包括一个或多个不同的偶联基团如羟基基团或胺基团的聚合物。合适的聚合物分子的例子包括选自下列的聚合物分子聚环氧烷烃(ΡΑ0)，诸如聚亚烷基二醇(PAG)，包括聚乙二醇(PEG)、甲氧基聚乙二醇(mPEG)和聚丙二醇、PEG-缩水甘油醚(Epox-PEG)、PEG-氧羰基咪唑(CDI-PEG)支链聚乙二醇(PEGs)、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚-D，L-氨基酸、聚乙烯顺丁烯二酸酸酐共聚物、聚苯乙烯苹果酸酸酐共聚物、葡聚糖包括羧甲基-葡聚糖、肝素、同源白蛋白、纤维素，包括甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羧乙基纤维素和羟丙基纤维素，壳聚糖的水解物，淀粉诸如羟乙基-淀粉和羟丙基-淀粉、糖原、琼脂糖和其衍生物，瓜尔豆胶、短醒霉多糖、菊糖、黄原胶、卡拉胶、果胶、海藻酸水解产物和生物多聚物。优选的聚合物分子是无毒性的聚合物分子，诸如(m)聚乙二醇(mPEG)，进一步地，它们需要相对简单的化学过程便能够共价偶联到酶表面上的附着基团。常见的聚环氧烷烃(PAO)，诸如聚环氧乙烷，例如PEG，特别是mPEG，是优选的聚合物分子，这是因为这些聚合物分子相比起多糖例如葡聚糖、短醒霉多糖和类似物，具有更少的能够发生交联的活性基团，而交联是不利的。B.sHASEGP的组织表达情况尽管先前认为sHASEGP是睾丸特异性的，但当使用更灵敏的技术如RT-PCR时，发现人sHASEGP表达在人的多种组织中。sHASEGP转录物被发现于髓质(脑)、微血管内皮、前列腺、胸、视网膜、收集的人黑素细胞、胎儿心脏和怀孕子宫中。sHASEGP也表达在生殖细胞肿瘤中。sHASEGP转录物的RT-PCR检测通常是检测在除睾丸之外的组织中的水平所必需的。C.sHASEGP酶活性的分析透明质酸酶活性的浊度法微量滴定测定透明质酸酶活性可以通过修饰的浊度法分析在酸化的血清溶液中进行检测。所需要的试剂如下JU作灌冼的UV火睛的2X去离f水或尤I為水iraunR5000-01HylumedMedical-透明成酸钠，GeniymeAdvmiced4876BiomateriaIs透明质酸_參考極难Up31200乙酸钾，粒状，USP,ACSJTBaker2914-01^冰fill酸，99+%SigmaA-6283.....:.......丽-丽-USP；—丽MallinkrodtTm权利要求1.纯化的透明质酸酶糖蛋白，其中所述糖蛋白包含至少一个糖部分，所述糖部分共价连接于所述透明质酸酶多肽的天冬酰胺(N)残基上；所述糖蛋白由与如下多肽具有至少98%氨基酸序列同一性的氨基酸序列组成，所述多肽由SEQIDNO.4显示的氨基酸序列组成，所述SEQIDNO.4显示的氨基酸序列是SEQIDNO.I的氨基酸残基36-483；所述糖蛋白是可溶性的；以及所述糖蛋白是中性活性的。2.如权利要求I所述的纯化的透明质酸酶糖蛋白，其包含透明质酸酶结构域，所述透明质酸酶结构域由SEQIDNO:I的残基36-464组成。3.如权利要求I所述的纯化的透明质酸酶糖蛋白，其中所述多肽在CHO细胞中被分泌。4.如权利要求I所述的纯化的透明质酸酶糖蛋白，其中，所述的糖部分被共价连接到天冬酰胺残基上，所述天冬酰胺残基选自SEQIDNO.I中所示的氨基酸82、166、235、254、368或393。5.如权利要求I所述的透明质酸酶糖蛋白，由与如下多肽具有至少99%序列同一性的氨基酸序列组成，所述多肽由SEQIDNO.4显示的氨基酸序列组成。6.如权利要求5所述的纯化的透明质酸酶糖蛋白，其包含透明质酸酶结构域，所述透明质酸酶结构域由SEQIDNO:I的残基36-464组成。7.纯化的透明质酸酶糖蛋白，其中所述糖蛋白包含至少一个糖部分，所述糖部分共价连接于所述透明质酸酶多肽的天冬酰胺(N)残基上；所述糖蛋白包含SEQIDNO:I的残基36-464，并且在选自SEQIDNO:I的残基477、478、479、480、481、482或483的残基处被截短；所述糖蛋白是可溶性的；以及所述糖蛋白是中性活性的。8.如权利要求1-7的任一项所述的透明质酸酶糖蛋白多肽，其中，所述多肽用聚合物修饰。9.如权利要求8所述的透明质酸酶糖蛋白多肽，其中，所述聚合物是PEG或葡聚糖。10.组合物，其包括权利要求1-7的任一项所述的透明质酸酶糖蛋白。11.组合物，其包括权利要求8所述的透明质酸酶糖蛋白。12.核酸分子，其包括编码权利要求1-7的任一项所述的透明质酸酶糖蛋白多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包括终止密码子，由此，在细胞中表达和分泌后，权利要求1-7的任一项所述的多肽被产生。13.如权利要求12所述的核酸分子，其中所述核苷酸序列编码用于分泌所述被编码多肽的信号序列。14.如权利要求13所述的核酸分子，其中所述信号序列是IgGK链前导肽。15.如权利要求14所述的核酸分子，其中所述IgGK链前导肽具有SEQIDNO:43所示的核苷酸序列。16.载体，其包含权利要求12所述的核酸分子。17.如权利要求16所述的载体，其包含SEQIDNO:51中所示的核苷酸序列。18.如权利要求16所述的载体，其为表达载体。19.如权利要求16所述的载体，其为真核生物载体。20.如权利要求16所述的载体，其包括核苷酸序列，该核苷酸序列指导由有效连接到其上的核苷酸序列编码的任何多肽的分泌。21.如权利要求16所述的载体,其为毕赤酵母(Pichia)载体、大肠杆菌(E.coli)载体或病毒载体。22.分离的细胞，其包含权利要求16所述的载体。23.如权利要求22所述的细胞，其为原核细胞或真核细胞。24.如权利要求22所述的细胞，其选自细菌细胞、酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞或动物细胞。25.如权利要求22所述的细胞，其为哺乳动物细胞。26.如权利要求25所述的细胞，其为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。27.用于产生权利要求1-7的任一项所述的可溶性透明质酸酶糖蛋白多肽的方法，包括将被有效地连接于启动子的、编码权利要求1-7的任一项所述的多肽的核酸导入细胞中，所述细胞将N-连接的糖部分整合到所述多肽中；在被编码的多肽被所述细胞表达和分泌的条件下培养所述细胞；和回收所述的被表达的多肽。28.如权利要求27所述的方法，其中，所述细胞是真核细胞。29.如权利要求28所述的方法，其中，真核细胞选自哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞或植物细胞。30.如权利要求29所述的方法，其中，所述细胞是CHO细胞。31.用于产生可溶性透明质酸酶多肽的方法，包括在被编码的多肽被细胞表达和分泌的条件下培养权利要求22所述的细胞；和回收所述的被表达的多肽。32.如权利要求31所述的方法，其中所述细胞在适合于产生所述多肽的条件下、在O.I-ImM丁酸钠存在下被培养。33.药物组合物，其包含权利要求1-7的任一项所述的透明质酸酶多肽糖蛋白。34.权利要求33所述的药物组合物，其包含药物载体。35.如权利要求33所述的药物组合物，进一步包含药物活性试剂。36.如权利要求35所述的药物组合物，其中，所述药物活性试剂选自化疗剂、止痛剂、抗炎剂、抗微生物剂、抗阿米巴虫剂、杀毛滴虫剂、抗帕金森剂、抗痢疾剂、抗痉挛剂、抗抑郁剂、抗风湿剂、抗真菌剂、抗高血压剂、退热剂、抗寄生虫剂、抗组胺剂、α-肾上腺素激动齐U、α封阻剂、麻醉剂、支气管扩张剂、杀生物剂、杀菌剂、抑菌剂、β肾上腺素封阻剂、钙通道封阻剂、心血管药剂、避孕药剂、解充血药剂、利尿剂、镇静剂、诊断试剂、电解质试剂、催眠药剂、激素、促血糖增高药剂、肌松弛剂、肌收缩剂、眼用药剂、拟副交感神经药、心理兴奋齐U、镇定剂、拟交感神经药、安定剂、泌尿剂、阴道用药剂、杀病毒剂、维生素药剂、非类固醇类抗炎药剂、血管紧张素转化酶抑制剂、多肽、蛋白质、核酸、药物、有机分子和促睡眠剂。37.如权利要求35所述的药物组合物，其中，所述药物活性试剂选自胰岛素、细胞因子、抗体和单克隆抗体。38.如权利要求35所述的药物组合物，其中，所述药物活性试剂是化疗剂，所述化疗剂是毒素或肿瘤坏死因子。39.如权利要求35所述的药物组合物，其中，所述药物活性试剂是麻醉剂，所述麻醉剂是利多卡因或布比卡因。40.如权利要求35所述的药物组合物，进一步包括激素试剂。41.如权利要求40所述的药物组合物，其中，所述激素试剂是肾上腺素。42.如权利要求33所述的药物组合物，其为冻干粉末或为液体。43.共轭物，其包括如权利要求1-6的任一项所述的可溶性多肽或包括如权利要求1-7的任一项所述的可溶性多肽的结构域。44.如权利要求33所述的药物组合物，用于治疗糖胺聚糖过量、用于治疗肿瘤、用于治疗心血管紊乱、用于增加化疗剂向实体瘤中的渗透、用于诱导玻璃体液液化、用于促进坏死组织的血管再造、或用于将尺寸小于500nm的分子传送给含有过量糖胺聚糖的组织。45.权利要求44所述的药物组合物，其中所述的过量的糖胺聚糖底物由瘢痕组织产生。46.权利要求44所述的药物组合物，其中所述瘢痕组织是由脊髓损伤引起的神经胶质瘢痕，是手术的结果，或是瘢痕瘤瘢痕。47.权利要求44所述的药物组合物，其中所述底物与椎间盘突出有关。48.如权利要求33所述的药物组合物在制备药物中的应用，所述药物用于治疗糖胺聚糖过量、用于治疗肿瘤、用于治疗心血管紊乱、用于增加化疗剂向实体瘤中的渗透、用于诱导玻璃体液液化、用于促进坏死组织的血管再造、或用于将尺寸小于500nm的分子传送给含有过量糖胺聚糖的组织。49.如权利要求48所述的应用，其中，所述应用用于治疗由瘢痕组织产生的过量的糖胺聚糖底物。50.如权利要求49所述的应用，其中，所述的瘢痕组织是由脊髓损伤引起的神经胶质瘢痕，是手术的结果，或是瘢痕瘤瘢痕。51.如权利要求49所述的应用，其中，所述底物与椎间盘突出有关。全文摘要本发明涉及发现新的可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP's)、制备方法，和它们帮助其他分子的给药或者缓解糖胺聚糖相关的病理的用途。描述了可溶性中性活性sHASEGP结构域的最小化的活性多肽结构域，其包括对于功能性的中性活性透明质酸结构域而言所必需的天冬酰胺-连接的糖部分。本发明包括了经修饰的可增强sHASEGP的分泌的氨基末端前导肽。本发明进一步包括重组sHASEGP的唾液酸化和聚乙二醇化形式，以增强其稳定性和血清药物动力学，使其优于天然发生的来自屠宰场的酶。进一步描述了基本上纯的重组sHASEGP糖蛋白的合适制剂，所述的重组sHASEGP糖蛋白来自于可产生适当的糖基化的真核细胞，而该糖基化对于该蛋白的最佳活性是必需的。文档编号C12N9/00GK102943067SQ201210442499公开日2013年2月27日申请日期2004年3月5日优先权日2003年3月5日发明者L·H·布宾枫,A·昆度,G·I·弗罗斯特申请人:海洋酶公司