专利名称：一对应用于检测家蚕质型多角体病毒的检测引物及检测方法
技术领域：
本发明属于分子诊断和鉴定技术领域，具体涉及以BmCPV RDRP基因为靶标的一对应用于检测家蚕质型多角体病毒的检测引物及快速检测方法。
背景技术：
家蚕质型多角体病又称家蚕中肠型脓病。病原为家蚕质型多角体病毒(BombyxmoriCytoplasmic polyhedrosis virus。简称BmCPV),是呼肠弧病毒科质型多角体病毒属的模式种。家蚕质型多角体病是家蚕第二大病毒病，在生产上危害严重。该病是一种慢性病，病原是一种具包涵体的多角体病毒，核酸类型是dsRNA，具有独立的十个片段组成。病毒通过家蚕食下感染，侵染中肠圆筒状细胞，在细胞质中形成多角体，导致细胞破裂，病毒多角体通过粪便排出体外，感染其它健康个体，形成严重的蚕座传染，蚕儿感染病毒后，正常 消化功能受到影响，相继发病死亡，蚕茧减产甚至绝收，对蚕桑生产造成巨大的威胁。目前对BmCPV还没有特效型的蚕药，生产上主要通过加强养蚕前消毒，蚕期蚕座消毒，养蚕结束后的回山消毒等预防措施。对于发病个体，只能淘汰处理，无其它有效手段。RDRP基因是BmCPV第二分节片段，依靠宿主翻译系统，能翻译成RDRP酶，RDRP酶在RNA病毒转录、复制过程中起到非常重要的作用，它一方面以病毒RNA为模版复制子代病毒的基因，另一方面将病毒增殖过程中需要的蛋白质和酶类基因转录为mRNA，即具有复制酶和转录酶的双重功能，人类一些病毒病的分子治疗研究，例如SARS病毒，肝炎病毒等RNA病毒，分子治疗祀标均为RDRP基因。目前，根据其核酸数量和多角体形状及在细胞内形成的部位，将BmCPV分为9个株系，其中BmCPV-I株的RNA基因全序列已被测定，松毛虫及马尾松毛虫CPV全基因序列也被测定，但对其分子生物学检测方法报道较少。刘吉平(2011年专利)报道了利用BmCPV第五基因片段做检测靶基因，能够快速检测BmCPV，吴萍(2012年专利)公开利用BmCPV第五基因片段采用荧光定量PCR检测BmCPV。本发明的检测靶基因是第二片段RDRP基因，提供一种可行的检测内容和检测方法。
发明内容
解决的技术问题本发明的目的是以BmCPV的RDRP基因为检测靶标，提供检测引物和检测工艺应用于检测家蚕质型多角体病毒。技术方案一对应用于检测家蚕质型多角体病毒的检测引物，所述引物的核苷酸序列如 SEQ ID NO. I 和 SEQ ID NO. 2 所示。—种应用于检测家蚕质型多角体病毒的试剂盒，含有权利要求I所述的引物。一种利用权利要求I所述引物检测家蚕质型多角体病毒的方法，包括以下步骤(I)试剂盒抽提家蚕质型多角体病毒RNA ；(2)试剂盒对所提RNA采用Random Primer引物进行反转录；
(3)应用所述引物对反转录样本进行PCR扩增；(4)取步骤(3) PCR扩增产物用I %的琼脂糖电泳检测。具体步骤为I)病毒多角体悬浊液200 μ L，转入I. 5mL离心管，加入400 μ L裂解液RLB，立刻涡旋振荡充分混勻；2)室温放置IOmin,每隔5min,振荡混勻一次；3)加入450 μ L无水乙醇，立刻涡旋振荡充分混匀；
4)将上述混合物加入一个吸附柱RA中，13000rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液；5)加500 μ L去蛋白液RE, 12000rpm离心30s,弃废液；6)加入500 μ L漂洗液RW，12000rpm离心30s，弃废液，重复一遍；7)将吸附柱RA放回空收集管中，13000rpm离心2min，除去漂洗液RW ；8)取出吸附柱RA，放入一个RNase free的离心管中，在吸附膜的中间部位加30-50μ L65-70°C RNase free H2O,室温放置 lmin, 12000rpm 离心 Imin ；9)同步骤I 8抽提家蚕中肠总RNA ；10)反转录合成第一链 cDNA : IOOng/μ L Total RNA, I μ L ；0. I μ g/ μ L RandomPrimer,I μ L；IOmM dNTP Mixture, I μ L ;5XRT Buffer,4μ L ；40units/ul RnaseInhibitor, 0. 5 μ L ；TUREscript H-Rtase, I μ L ；RNase free H20,11. 5 μ L ;混匀 25°C孵育10min，42°C孵育 50min ;然后 70°C孵育 5min。11)PCR 扩增总体积 25μ L :2. 5μ L 10XPCR Buffer, I μ L dNTPs，正反向引物浓度为 10 μ M，各加 O. 5 μ L，I μ L cDNA, 19 μ L ddH20,0. 5 μ L Taq 酶(2. 5U/ μ L)；反应条件为，94°C 5min ；94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 50s, 30 个循环；72°C IOmin ；12)取上步PCR扩增产物用I %的琼脂糖电泳检测在370bp处是否有清晰的条带。有益效果本发明提供了一对特异的引物BmCPV-F、BmCPV-R,采用所述特异性引物可有效地扩增BmCPV的RDRP基因5’一 3’第366碱基到第736碱基特异性片段，片段大小370bp，用于检测出家蚕质型多角体病毒RDRP基因，检测灵敏度高，操作简单，为该病毒引起的家蚕病害的防治效果提供重要的检测技术基础。
图I家蚕质型多角体病毒基因PCR扩增结果。
具体实施例方式下面结合上图和具体实施步骤进一步说明本发明，上述实施步骤中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法，所使用的材料，试剂等，如无特殊说明，是可从商业途径得到的试剂和材料。实施例I :一、家蚕质型多角体病毒的人工繁殖与纯化生物材料家蚕质型多角体病毒由江苏科技大学蚕蚕业研究所病理实验室保存复壮(仅为说明本发明方法)，病毒RNA快速提取试剂盒(北京博凌科为生物科技有限公司)，反转录试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司)(I)接种方法以4X IO7个/mL多角体添食四龄起蚕，悬浊液涂在桑叶正反两面，家蚕食桑8小时后，更换无病毒桑叶；(2)收集方法到5龄第6天，解剖家蚕，取患病家蚕中肠，解剖后生理盐水漂洗，无菌研钵磨碎、离心；(3)纯化方法以蔗糖或氯化铯密度梯度离心，得到纯净多角体。二、病毒基因组抽提I)病毒多角体悬浊液200 μ L，转入I. 5mL离心管，加入400 μ L裂解液RLB，立刻涡旋振荡充分混勻；
2)室温(15-25°C )放置lOmin，每隔5min，振荡混匀一次；3)加入450 μ L无水乙醇，立刻涡旋振荡充分混匀；4)将上述混合物加入一个吸附柱RA中，13000rpm离心30_60s，倒掉收集管中的废液；5)加500 μ L去蛋白液RE, 12000rpm离心30s,弃废液；6)加入500 μ L漂洗液RW，12000rpm离心30s，弃废液，重复一遍；7)将吸附柱RA放回空收集管中，13000rpm离心2min，尽量除去漂洗液；8)取出吸附柱RA，放入一个RNase feee的离心管中，在吸附膜的中间部位加30-50μ L65-70°C RNase free H2O,室温放置 lmin, 12000rpm 离心 Imin ；三、正常家蚕中肠总RNA抽提同步骤(二)；四、反转录合成第一链cDNA Total RNA (IOOng/ μ L), I μ L ；Random Primer (0. I μ g/ μ L) , I μ L ；dNTPMixture(IOmM each), I μ L ；5 X RT Buffer, 4 μ L, Rnase Inhibitor (40units/ul),0. 5 μ L ；TUREscript H-Rtase, I μ L ；RNase free H20，11.5yL。混匀 25 °C 孵育 lOmin，42 °C 孵育50min ;然后 70°C孵育 5min。五、PCR扩增总体积 25μ L :2. 5μ L 10XPCR Buffer, I μ L dNTPs，正反向引物浓度为 10 μ M，各加 0. 5 μ L，I μ L cDNA, 19 μ LddH2O, O. 5 μ LTaq 酶(2. 5U/ μ L)；反应条件为，94°C 5min ；94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 50s, 30 个循环；72°C IOmin0六、实验结果见附图I所示，应用本发明方法对家蚕质型多角体病毒基因组dsRNAs的PCR检测结果,在370bp处有一条清晰的条带,与预期结果是一致的。而健康家蚕的基因组没有任何条带，显示应用本设计引物及检测工艺检测技术特异性强。实验证明本发明设计的引物，应用于家蚕质型多角体病的PCR扩增检测，可以有效扩增出RDRP基因片段，而健康家蚕未显示特异性条带，为以RDRP为靶标相关研究检测提供技术基础。实施例2本发明基于NCBI (http://www.ncbi.nlm.gov.cn)提供的 BmCPV-I (序列号:GQ924586. I)、松毛虫CPV (序列号AF389463. I)、马尾松毛虫CPV (序列号AY147187. I)三种病毒的RDRP全基因序列，Bioedit软件查询保守区，共20个保守区，设计引物后进行筛选，筛选出符合要求的引物。
所述引物BmCPV-R、BmCPV-F,上游引物22bp，位于其5’端从366到388，下游引物为22bp，位于从714到736之间的序列，两引物的核苷酸序列如SEQ ID No. I和SEQ IDNo. 2所示，分别为BmCPV-F CAAGGTCACAAGTATGATTACTBmCPV-R CTGACATTATTGCTGTACCTAC扩增的目的片段为370bp左右，克隆后由上海生物工程有限公司进行序列测定，测序结果与NCBI公布的序列比对证明是BmCPV RDRP基因片段，与设计完全相符。同时，本发明提供的BmCPV检测方法包括以下工艺步骤(I)用试剂盒抽提患病个体蚕中肠总RNA ；(2)反转录试剂盒对所提RNA反转录； (3)取IyL稀释10倍，吸取I μ L，应用所述引物进行PCR扩增； (4)扩增产物用I %的琼脂糖凝胶电泳检测。步骤(I)采用北京博凌科为生物科技有限公司提供的病毒RNA专用试剂盒，抽提RNA步骤如下病毒基因组抽提I)吸取磨碎后的病蚕组织悬浊液200 μ L，转入I. 5mL离心管，加入400 μ L红细胞裂解液RLB，立刻涡旋振荡充分混匀；2)室温(15-25°C )放置lOmin，每隔5min，振荡混匀一次；3)加入450 μ L无水乙醇，立刻涡旋振荡充分混匀；4)将上述混合物加入一个吸附柱RA中，13000rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液；5)力口 500 μ L去蛋白液RE, 12000rpm离心30s,弃废液；6)加入500 μ L漂洗液RW，12000rpm离心30s，弃废液，重复一遍；7)将吸附柱RA放回空收集管中，13000rpm离心2min，尽量除去漂洗液；8)取出吸附柱RA，放入一个RNase free的离心管中，在吸附膜的中间部位加30-50μ L65-70°C RNase free H2O,室温放置 lmin，12000rpm 离心 lmin。步骤(2)反转录试剂盒采用北京艾德莱生物科技有限公司专用反转录试剂盒，反转录采用Random引物；第一链cDNA 合成反应体系Total RNA, I μ L IOOng/ μ L ；RandomPrimer(0. I μ g/μ L), I μ L;dNTP Mixture(IOmM each), I μ L ；5 X RT Buffer,4 μ L ；RnaseInhibitor (40units/ul), 0. 5 μ L ；TUREscript H-Rtase, IuL ；RNase free H20,11. 5 μ Lot昆匀 25°C孵育 10min，42°C孵育 50min ;然后 70°C加热 5min。步骤(3)PCR 反应体系为总体积 25μ L :2. 5μ L 10XPCR Buffer, I μ L dNTPs, ιΕ反向引物浓度为 10μΜ4 η0·5μ ，1μ cDNA, 19 μ L ddH20,0. 5μ L Taq 酶(2. 5U/ μ L)；反应条件为94°C 5min ；94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 50s，30 个循环；72°C IOmin0取上步PCR扩增产物用1%的琼脂糖电泳检测在370bp处是否有清晰的条带，结果可参考附图I。序列表〈110〉江苏科技大学
<120> 一对应用于检测家蚕质型多角体病毒的检测引物及检测方法〈130〉<160>2<170>PatentIn version 3. 3〈210〉I<211>22<212>DNA
〈213〉人工序列〈400〉Icaaggtcaca agtatgatta ct22<210>2<211>22<212>DNA〈213〉人工序列<400>2ctgacattat tgctgtacct ac2权利要求
1.一对应用于检测家蚕质型多角体病毒的检测引物，其特征在于所述引物的核苷酸序列如 SEQ ID NO. I 和 SEQ ID NO. 2 所示。
2.一种应用于检测家蚕质型多角体病毒的试剂盒，其特征在于含有权利要求I所述的引物。
3.一种利用权利要求I所述引物检测家蚕质型多角体病毒的方法，其特征在于包括以下步骤(1)试剂盒抽提家蚕质型多角体病毒RNA；(2)试剂盒对所提RNA采用RandomPrimer引物进行反转录；(3)应用所述引物对反转录样本进行PCR扩增；(4)取步骤(3)PCR扩增产物用I %的琼脂糖电泳检测。
4.根据权利要求3所述利用权利要求I所述引物检测家蚕质型多角体病毒的方法，其特征在于步骤为1)病毒多角体悬浊液200μ L，转入I. 5mL离心管，加入400 μ L裂解液RLB，立刻涡旋振荡充分混匀；2)室温放置IOmin,每隔5min,振荡混勻一次；3)加入450μ L无水乙醇，立刻涡旋振荡充分混匀；4)将上述混合物加入一个吸附柱RA中，13000rpm离心30_60s，倒掉收集管中的废液；5)加500μ L去蛋白液RE，12000rpm离心30s,弃废液；6)加入500μ L漂洗液RW, 12000rpm离心30s,弃废液，重复一遍；7)将吸附柱RA放回空收集管中，13000rpm离心2min，除去漂洗液RW；8)取出吸附柱RA，放入一个RNasefree的离心管中，在吸附膜的中间部位加30-50μ L65-70°C RNase free H2O,室温放置 lmin, 12000rpm 离心 Imin ；9)同步骤I 8抽提家蚕中肠总RNA；10)反转录合成第一链cDNA IOOng/ μ L Total RNA, I μ L ；0. I μ g/ μ L RandomPrimer,I μ L；IOmM dNTP Mixture,I μ L ;5XRT Buffer,4μ L ；40units/ul RnaseInhibitor, 0. 5 μ L ；TUREscript FRtase, I μ L ；RNase free H20,11. 5 μ L ;混匀 25°C孵育10min，42°C孵育 50min ;然后 70°C孵育 5min ；11)PCR扩增总体积 25μ L :2. 5μ L 10XPCR Buffer，I μ LdNTPs ;正反向引物浓度为 ΙΟμΜ，各加 O. 5μ L ；1 μ LcDNA ； 19 μ LddH2O ；2. 5U/ μ LTaq 酶，O. 5 μ L ;反应条件为，94°C 5min ；94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 50s, 30 个循环；72°C IOmin ；12)取上步PCR扩增产物用I%的琼脂糖电泳检测在370bp处是否有清晰的条带。
全文摘要
一对应用于检测家蚕质型多角体病毒(BmCPV)的检测引物及检测方法，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。采用所述特异性引物可有效地扩增BmCPV的RDRP基因5’→3’第366碱基到第736碱基特异性片段，片段大小370bp，用于检测出家蚕质型多角体病毒RDRP基因，检测灵敏度高，操作简单，为该病毒感染引起的家蚕病害的防治效果提供重要的检测技术基础。
文档编号C12N15/11GK102925590SQ20121045277
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月13日 优先权日2012年11月13日
发明者潘中华, 郭锡杰, 耿涛, 吴萍, 沈中元, 朱峰 申请人:江苏科技大学