专利名称：一种用肝素抗凝血浆制备cik细胞的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种应用患者肝素抗凝的血浆制备CIK细胞的方法。
背景技术：
细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine induced killer, CIK)是将人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)在体外经多种细胞因子(如抗⑶3McAb、IL-2、IFN-Y、IL-I α等)联合诱导产生的以⑶3+⑶56+为主要特征的一群异质细胞，兼具有T淋巴细胞的抗瘤活性和NK细胞的非主要组织相容性复合体(MajorHistocompatibilityComplex, MHC)限制性杀瘤优点，故又被称为自然杀伤细胞(NatureKiller, NK)样T淋巴细胞(NK-T cells)。作为一种新型高效的免疫活性细胞，因其具有增殖能力强、杀瘤谱广、杀瘤活性强，对多重耐药肿瘤细胞敏感等其它一些效应细胞无法比拟的优点，被认为是新一代抗肿瘤过继性细胞免疫治疗的首选细胞。传统的CIK细胞体外扩增培养方法多采用添加牛源性血清(多采用胎牛血清)或人AB型血清的培养基进行培养，存在传播疾病的隐患、并有内毒素残留和感染其它外源性疾病的风险，存在一定的安全隐患，造成在临床推广应用细胞过继免疫治疗受到很大的局限。要实现CIK细胞过继免疫治疗在临床的推广应用，必须解决好CIK细胞体外扩增培养的安全性问题，这就必须采用自身血浆或无血清培养基来替代传统的牛源性血清或人AB型血清的培养方式，以减少意外感染的机会。由于无血清培养基价格较为昂贵，限制了该方法在细胞过继免疫治疗在临床的推广应用。因此，本发明提供了一种采用患者自体血浆在体外高效、安全制备CIK细胞的方法。该方法克服了传统方法的缺点，使CIK细胞过继免疫治疗的安全性得到保障。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术的不足，提供了一种应用患者肝素抗凝的血浆在体外培养和扩增CIK细胞的方法，在降低细胞培养费用、减少感染外源性疾病的可能性的同时，显著提高了 CIK细胞的生物活性，使CIK细胞过继免疫治疗的安全性得到保障，对CIK细胞过继免疫治疗在临床的推广应用起到了积极的作用。本发明通过如下具体技术方案实现本发明目的I、外周血单个核细胞的采集在血细胞分离机上采集患者50-100ml的单个核细胞血浆悬液，细胞总数为5-10X107 ；2、肝素抗凝血浆的分离和制备将单个核细胞血浆悬液转移到数个50ml Falcon离心管中，2000-2500rpm下离心5-10min，此时，单个核细胞血浆悬液分为分界明显的上下两层，上层为血浆层，下层为单个核细胞层。首先吸取上层的血浆，并添加终浓度为I. 0-2. OX IO5 U/L的肝素钠，轻摇混·勻，置于_20°C冰箱放置30-60min后,将含肝素钠的血衆转入数个50ml Falcon离心管中，2000-2500rpm离心5-10min后，吸出上层血浆并置于4°C冰箱保存备用，弃去离心管底的絮状冷凝沉积物(主要为纤维蛋白和纤维蛋白原)。3、外周血单个核细胞的分离、培养及活化下层的单个核细胞层则加入约其2倍体积的质量百分比浓度为O. 9%生理盐水稀释悬液后，缓慢加入到数个预装有15_25ml淋巴细胞分离液(购自北京索莱宝科技有限公司)的50mlFalcon离心管中(细胞悬液体积与淋巴细胞分离液体积相等)，离心管经严格配平后2000-2500rpm室温离心20_40min，离心后用平口 IOml吸管吸取界面层的单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC),缓慢加入到数个预装有 20_40mlRPMI-1640培养基(购自赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司)的Falcon离心管中，2000-2500rpm室温离心5_10min，洗涤2_4遍，收集细胞；经离心洗涤的单个核细胞按2. 0-4. OXlOVmL悬浮于含体积百分比10-15%患者抗凝血浆的RPMI-1640培养基中，并添加终浓度为I. 0-1. 5X106U/L的rhIFN- Y，混匀，混合液转入750ml无菌Falcon培养瓶，每个培养瓶接种体积为60-70ml，将盛有细胞的培养瓶置于37°C、5% CO2，饱和湿度的培养箱 中培养，24小时后加入终浓度为5. 0-10. OX 105U/L的rhIL_2、终浓度为5. 0-10. OX IO5U/L的rhIL-la、和终浓度为100_200ug/L的鼠抗人CD3单克隆抗体(CD3McAb)继续培养，之后，每隔2-4天补加新鲜的含体积百分比10-15%患者血浆和终浓度为5. 0-10. OX IO5U/L rhIL-2的RPMI-1640培养基，同时调整细胞浓度为I. 5-2. 5X106/ml，培养至7-21天，即可开始收获细胞，此时，可用数个50ml离心管收取用于收获部分的CIK细胞悬液，于2000_2500rpm离心5_8min,收集细胞,再加入无菌生理盐水，2000_2500rpm离心5_8min,洗涤2-4次，最后悬浮于250ml无菌生理盐水中，即制得用肝素抗凝血浆培养得到的CIK细胞悬液，用于注射使用，其余的CIK细胞则补加新鲜的含体积百分比10-15%患者血浆和终浓度为5. 0-10. OX 105U/L rhIL-2的RPMI-1640培养基，同时调整细胞浓度为I. 5-2. 5 X IO6/ml，继续在体外扩大培养。4、CIK细胞的扩增情况通过上述方法培养的CIK细胞获得大量扩增，实验显示在培养的第1-4天，培养细胞数量有所减少，之后，细胞数量呈非线形增长，从第5-6天后细胞开始逐渐增殖，倒置显微镜下可观察到细胞体积增大，胞浆少，胞核大、圆；细胞呈集落样生长；在培养至第7-10天，细胞数量明显增多，集落样细胞团块更大，悬浮于培养基中，其后进入快速增长期，至培养第7-21天，CIK细胞数量可达到起始培养细胞数的40. 0±15. O倍。5、CIK细胞的免疫表型测定分别对培养不同天数的CIK细胞进行免疫表型测定，测定的免疫表型包括CD45、CD3、CD25、CD15、CD4、CD8、CD16、CD56、CD29、CD28。CIK 是一群以 CD3+CD56+ 为主要特征的异质细胞群，兼具有T淋巴细胞的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤活性，CD3+CD56+细胞占总细胞数的比例随培养时间逐步升高，在培养至第7-21天，可达到10-60%不等；并且，用患者肝素抗凝血浆培养得到的CIK细胞，CD3+CD56+细胞占总细胞数的比例要高于用胎牛血清培养的CIK细胞。6、CIK细胞生物学活性效应检测采用MTT法测定体外CIK对NK细胞敏感肿瘤细胞系K562的细胞杀伤实验(效靶=10 I)，实验结果显示采用抗凝血浆培养的CIK细胞，在培养第7-21天，其细胞杀伤活性均>70%，并且用含抗凝血浆的培养液所获得的CIK细胞杀伤活性高于用胎牛血清和无血清培养基培养的CIK细胞。本发明相对于现有技术的优点和技术效果如下I)本发明方法具有较高的扩增倍数，实验数据显示使用肝素抗凝血浆培养淋巴细胞，CIK细胞数量明显增多，在第7-21天可达到起始培养细胞数的40. O±15. O倍；2)通过本发明方法得到的CIK细胞中免疫表型⑶3+⑶56+细胞占总细胞数的比例高，在培养至第7-21天，可达到10-60% ；3)通过本发明方法培养的CIK细胞，生物学活性提高，实验结果显示在培养第7-21天，其细胞杀伤活性均彡70%。4)通过本发明方法制备得到的CIK细胞安全可靠，可在体外一定期限内不断扩大培养，且活性稳定，适用于批量生产。
图I是本发明患者的肝素抗凝血浆在体外扩增培养获得的CIK细胞在显微镜下观察示意图，其中A是100倍放大图，B是400倍放大图；图2是本发明流式检测CIK细胞的免疫表型结果示意图；其中I是细胞散点图；11是⑶3的单参数图；III是⑶3和⑶56的双参数图；图3是采用MTT法分别测定培养第7、14和第21天的CIK细胞对NK细胞敏感肿瘤细胞系K562的细胞杀伤实验结果示意图；图4是用含不同血浆的培养液体外扩增培养同一患者所获得的CIK细胞的免疫表型结果示意图，其中SI是实施例I中的患者；S2是实施例3中的患者；A是用含胎牛血清的培养液体外扩增培养得到的CIK细胞；B :用含肝素抗凝血浆的培养液体外扩增培养得到的CIK细胞；图5是本发明方法制备得到胃癌患者的CIK细胞，经CIK细胞回输前后胃镜下病变部位形态学和该部位病理组织切片的对比示意图，其中A-I是该胃癌患者经CIK细胞治疗前胃镜下病变部位的形态学特征；A-2是该胃癌患者经CIK细胞治疗前病变部位的病理组织切片结果是该胃癌患者经CIK细胞治疗后胃镜下同一病变部位的形态学特征；B-2是该胃癌患者经CIK细胞治疗后该病变部位的病理组织切片结果。
具体实施方案下面通过附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围不局限于所述内容，实施例中方法如无特殊说明的，均采用常规方法。实施例I :贲门癌术后患者的肝素抗凝血浆用于培养自身淋巴细胞的方法，具体内容如下I、临床资料病例1，男，56岁，贲门癌术后2月，为经手术后病理检查确诊病例。2、主要材料·Hyclone RPMI-1640购自赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司；注射用重组人白细胞介素_2 (Recombinant human interleukin-2, rhIL-2)购自北京四环生物制药有限公司;重组人白细胞介素_la (Recombinant human interleukin-1 alpha,rhIL-1 α )购于美国PeproTech公司；注射用重组人干扰素Y (Recombinat human interferonY, rhIFN- y )购自上海凯茂生物医药有限公司；注射用抗人T细胞⑶3鼠单克隆抗体(Monoclonal antibody⑶3,⑶3McAb)购自武汉生物制品研究所人淋巴细胞分离液购自北京索莱宝科技有限公司；细胞培养瓶、培养板均为Corning公司(美国)产品；Forma CO2培养箱(美国)；Nikon倒置显微镜(日本)；细胞培养操作均在达到药品生产质量管理规范(GMP)的CIK细胞操作间进行。3、CIK细胞的制备在血细胞分离机上用淋巴细胞采集程序采集患者单个核细胞，获得含总数为5. OX IO7单个核细胞和50ml患者血浆的细胞悬液。将50ml患者单个核细胞血浆悬液转移到2个50mlFalcon离心管中，2000rpm离心5min，此时，单个核细胞血浆悬液分为分界明显的上下两层，上层为血浆层，下层为单个核细胞层。首先吸取上层共40ml的血浆，并添加终 浓度为I. O X 105U/L的肝素钠，轻摇混匀，置于_20°C冰箱放置30min后，将含肝素钠的血浆转入2个50ml Falcon离心管中，2000rpm离心5min后，吸出上层血浆并置于4°C冰箱保存备用，弃去离心管底的纤维蛋白和纤维蛋白原絮状冷凝沉积物；在下层IOml的单个核细胞层中加入其2倍体积(20ml)的质量百分比浓度为0. 9 %生理盐水，细胞经充分混匀后，缓慢加入2个预加15ml淋巴细胞分离液的50mlFalcon离心管中(细胞悬液体积与淋巴细胞分离液体积相等)，2000rpm室温离心30min，用平口 IOml吸管吸取界面层的单个核细胞，缓慢加入到2个预加30ml RPMI-1640培养基的Falcon离心管，2000rpm室温离心5min，洗涤2次后，收集细胞；经离心洗涤的单个核细胞按2. OX IOfVmL数量悬浮于含体积百分比10 %血浆的RPMI-1640培养基中，并添加终浓度为I. O X 106U/L的rhIFN- Y，混匀，转入750ml无菌Falcon培养瓶，每个培养瓶接种体积为60ml，共2瓶。将盛有细胞的培养瓶置于37°C、5% CO2培养箱(Forma Therapeutics Inc,USA)中培养。24h后加入鼠抗人⑶3单克隆抗体(⑶3McAb)100 ug/L，终浓度为5. OX IO5U/L的rhIL-2和终浓度为5. OX 105U/L的rhIL_la，继续培养，之后每2天补加含体积百分比10%血浆和终浓度为5. OX 105U/L rhIL-2的RPMI-1640培养基I次，并调整细胞浓度为I. 5 X 106/ml。培养第7天收获细胞，用5个50ml离心管收取CIK细胞悬液，2000rpm离心5min,收集细胞；再加入无菌生理盐水，2000rpm离心5min,洗漆2次,最后收集细胞,用无菌生理盐水配成250ml，即得到用肝素抗凝血浆在体外培养的CIK细胞悬液，经质量控制检测合格后即可用于静脉回输治疗。5) CIK细胞的扩增情况培养的CIK细胞获得大量扩增，在培养的第1-4天，培养细胞数量有所减少。之后，细胞数量呈非线形增长，从第5天后细胞开始逐渐增殖，倒置显微镜下可观察到细胞体积增大，胞浆少，胞核大、圆。细胞呈集落样生长；在培养第5天，细胞数量明显增多，集落样细胞团块更大，悬浮于培养基中，其后进入快速增长期，至培养第7天，CIK细胞数量已达到起始培养细胞数的27. 6倍(见图I)。6) CIK细胞免疫表型检测在培养的第20天收集CIK细胞，采用常规方法进行免疫表型检测，用PBS平衡液洗漆细胞后用 FITC 标记的 CD 3 (Beckman Coulter)、PE 标记的 CD56 (BD BiosciencesPharmingen)避光孵育细胞,4°C, 30min。洗去多余的抗体,用流式细胞仪(Beckman Culter,MoFlo)检测阳性细胞，结果分析使用Kaluza vl. I软件进行分析，其中I中所设定的门A表示在B和C中所分析的细胞是该群细胞，该群细胞占总细胞数的82. 85%，II是CD3的单参数图，其中门C表示⑶3+的细胞占所分析细胞群的73. 07%，III是⑶3和⑶56的双参数图，结果显示⑶3+⑶56+的细胞占所分析细胞群的42. 04% (见图2)。实施例2 :左乳癌术后患者的肝素抗凝血浆用于培养自身淋巴细胞的方法，具体内容如下I、临床资料病例2，女，54岁，左乳癌术后I年，为经手术后病理检查确诊病例。2、主要材料
Hyclone RPMI-1640购自赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司；注射用重组人白细胞介素_2 (Recombinant human interleukin-2, rhIL-2)购自北京四环生物制药有限公司；重组人白细胞介素-I α Recombinant human interleukin-1 alpha,rhIL-1 α )购于美国PeproTech公司；注射用重组人干扰素Y (Recombinat human interferonY, rhIFN- y )购自上海凯茂生物医药有限公司；注射用抗人T细胞⑶3鼠单克隆抗体(Monoclonal antibody⑶3,⑶3McAb)购自武汉生物制品研究所人淋巴细胞分离液购自北京索莱宝科技有限公司；细胞培养瓶、培养板均为Corning公司(美国)产品；Forma CO2培养箱(美国)；Nikon倒置显微镜(日本)；细胞培养操作均在达到药品生产质量管理规范(GMP)的CIK细胞操作间进行。3、CIK细胞的制备在血细胞分离机上用淋巴细胞采集程序采集患者单个核细胞，获得含总数为7. 5X107单个核细胞和75ml患者血浆的细胞悬液。将75ml患者单个核细胞血浆悬液转移到2个50mlFalcon离心管中，2250rpm离心8min，此时，单个核细胞血浆悬液分为分界明显的上下两层，上层为血浆层，下层为单个核细胞层，首先吸取上层共65ml的自体血浆，并添加终浓度为I. 50X 105U/L的肝素钠，轻摇混匀，置于_20°C冰箱放置45min后,将含肝素钠的血浆转入2个50ml Falcon离心管中，2250rpm离心8min后，吸出上层血浆并置于4°C冰箱保存备用，弃去离心管底的纤维蛋白和纤维蛋白原絮状冷凝沉积物；在下层IOml的单个核细胞层中加入其2倍体积(20ml)的质量百分比浓度为O. 9 %生理盐水，细胞经充分混匀后，缓慢加入2个预加15ml淋巴细胞分离液的50mlFalcon离心管(细胞悬液体积与淋巴细胞分离液体积相等)，2250rpm室温离心30min，用平口 IOml吸管吸取界面层的单个核细胞，缓慢加入到2个预加了 30ml RPMI-1640培养基的Falcon离心管，2250rpm室温离心7. 5min,洗涤3次后，将PBMC按3. O X 106/mL数量悬浮于含体积百分比12. 5%患者血浆的RPMI-1640培养基中，并添加终浓度为I. 25X 106U/L的rhIFN-Y，转入750ml无菌Falcon培养瓶，每个培养瓶接种体积为65ml，共2瓶，将盛有细胞的培养瓶置于37°C、5% CO2培养箱(Forma Therapeutics Inc, USA)中培养。24h后加Λ CD3McAb 150ug/L, rhIL-27. 5 X 105U/L 和 rhIL-1 a 7. 5 X 105U/L。之后每 3 天添加含体积百分比12 %患者血浆和终浓度为7. 5X 105U/L的rhIL-2新鲜RPMI-1640培养基I次，并调整细胞浓度为2. O X 106/ml，培养第14天收获细胞，用6个50ml离心管收取CIK细胞悬液,2250rpm离心6. 5min,收集细胞；再加入无菌生理盐水，2250rpm离心6. 5min,洗漆3次，最后收集细胞，悬浮于250ml无菌生理盐水中，即得到用肝素抗凝血浆培养得到的CIK细胞悬液。4、CIK细胞的扩增情况培养的CIK细胞获得大量扩增，在培养的第1-4天，培养细胞数量有所减少。之后，细胞数量呈非线形增长，从第5天后细胞开始逐渐增殖，倒置显微镜下可观察到细胞体积增大，胞浆少，胞核大、圆，细胞呈集落样生长，其后进入快速增长期，至培养第14天，CIK细胞数量已达到起始培养细胞数的42. 2倍。5、CIK细胞免疫表型检测在培养的第14天收集CIK细胞，采用常规方法进行免疫表型检测，用PBS平衡液洗涤细胞后分别分组标记如下免疫表型⑶45、⑶3、⑶25、⑶15、⑶4、⑶8、⑶16、⑶56、⑶29、CD28，避光孵育细胞，40C，30min。洗去多余的抗体，用流式细胞仪(Beckman Culter,MoFlo) 检测阳性细胞，结果分析使用Kaluza vl. I软件进行分析，结果见表I和表2。表I :CIK细胞的免疫表型测定结果
权利要求
1.一种用肝素抗凝血浆制备CIK细胞的方法，其特征在于按如下步骤进行 (1)外周血的单个核细胞血浆悬液的采集 在血细胞分离机上采集患者50-100ml的单个核细胞血浆悬液，细胞总数为5-10X107 ； (2)肝素抗凝血浆的分离和制备 将单个核细胞血浆悬浮液在2000-2500rpm下离心5_10min，吸取上层液体即得血浆，下层为单个核细胞层备用，在血浆中添加肝素钠，肝素钠的添加终浓度为1-2X105U/L，混匀后于-20°C下放置30-60min，然后将含肝素钠的血浆于2000-2500rpm下离心5-10min，吸取上层血浆并置于4°C保存备用； (3)外周血单个核细胞的分离、培养及活化 在下层单个核细胞层中加入单个核细胞层2倍体积的质量百分比浓度为O. 9%生理盐水，稀释，将稀释液加入等体积淋巴细胞分离液中，2000-2500rpm室温离心20_40min，离心后吸取界面层的单个核细胞，加入RPMI-1640培养基中，2000-2500rpm室温离心5-10min，洗涤2-4次，将洗涤后单个核细胞按2. 0-4. OX IO6个/mL浓度悬浮于含体积百分比10-15%患者血浆的RPMI-1640培养基中，并在悬浮液中添加终浓度为I. 0-1. 5X106U/L的rhIFN- Y，混匀，混合液置于培养瓶中在37°C、5% CO2,饱和湿度的培养箱中培养24h后，力口入终浓度为5. 0-10. 0X105U/L的rhIL-2、终浓度为5. 0-10. O X 105U/L的rhIL_la和终浓度为100-200ug/L的鼠抗人⑶3单克隆抗体，在37°C、5% CO2，饱和湿度的培养箱中继续培养，之后，每隔2-4天补加新鲜的含体积百分比10-15%患者血浆和终浓度为5. 0-10. OX IO5U/L rhIL-2的RPMI-1640培养基，同时调整细胞浓度为I. 5-2. 5 X 106/ml，培养7-21天后收获细胞，于2000-2500rpm离心5_8min，收集细胞，加入无菌生理盐水，再于2000-2500rpm离心5-8min洗涤2_4次，收集细胞并悬浮于无菌生理盐水中，即得到CIK细胞悬液。
全文摘要
本发明公开了一种用肝素抗凝血浆制备CIK细胞的方法，该方法采用癌症患者肝素抗凝的血浆在体外诱导培养和扩增淋巴细胞的方法，通过本发明方法可以大量扩增CIK细胞，实验结果显示在第7-21天CIK细胞数量明显增多，可达到起始培养细胞数的40.0±15.0倍，CIK细胞中免疫表型CD3+CD56+细胞占总细胞数的比例高，在培养至第7-21天，可达到10-60％，CIK细胞生物活性提高，实验结果显示在培养第7-21天，其细胞杀伤活性均≥70％。
文档编号C12N5/0783GK102925410SQ20121046437
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月19日 优先权日2012年11月19日
发明者严新民, 董虹, 华映坤, 唐慧, 高建梅 申请人:昆明理工大学附属医院