专利名称：一种随机shRNA文库的构建方法
技术领域：
本发明涉及生命科学领域，是一种用于构建随机的shRNA文库的策略和方法，及其在药物靶点筛选和重要功能基因发现和鉴定中的应用。
背景技术：
RNAi是近年来发现的一种重要生命现象，可以特征性降低机体和细胞内某个感兴趣靶基因的量。基于这样的原理，科学家们通过设计shRNA、转染细胞，靶向干涉候选基因，为认识生命现象提供了重要手段。在此基础上，进一步设计针对全基因组的RNA文库，对在全基因组范围内发现和鉴定新的功能基因、新的药物靶点的筛选、基因治疗等方面具有广阔的应用前景。传统构建shRNA是通过将针对不同基因的序列一个一个插入载体，然后将它们组合起来(图I)，形成文库。随着基因测序技术的进步，全基因组范围内新的功能基因不断得以发现，特别是一些非蛋白编码基因逐渐发现，为人类认识生命现象和开发疾病治疗手段提供了新的候选分子，同时也对shRNA文库提出了更高的要求。然后传统的shRNA文库主要针对已知蛋白编码基因，库容量有限；虽有一些随机shRNA文库的尝试，但这些构建方法因存在引入额外的序列干涉效率降低、配套病毒载体病毒包装效率较低等问题，并不理想。因此构建基于高效率pLKO. I载体、完全满足干涉需求的随机shRNA文库将提升该领域的研究。
发明内容
本发明解决的一个技术问题是提供一种构建完全随机的、符合shRNA表达和加工特征的双链DNA的方法。本发明解决的另一个技术问题是提供将上述双链DNA克隆至pLKO. I、并高效表达shRNA的方法。本发明专利的有益效果是，为筛选参与具体生物学功能的相关基因提供稳定可靠的工具，为药物靶点的发现和验证提供有效的手段，进而推动新药研发。
下面结合附图对本发明专利进一步说明附图I是传统的构建pLKO. I载体的方法，现有技术不能实现批量合成随机的能够转录成发夹结构的核酸序列。附图2-6描述本发明采用的随机干涉文库的方法，该方法通过补平(图2)、连接加终止码和3’酶切位点I (图3)、合成互补链、继续连接加5’端酶切位点(图4)、扩增、克隆(图5)和亚克隆(图6)等步骤实现表达随机shRNA文库的载体构建。
具体实施例方式(I)通过公司合成序列，其特征是5’ -NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCTCGAGATCACCATTATAAGATCTCGAG-3’ ；该序列的 3’ 端能够形成一个茎环结构，其中茎的结构主要是通过两个Xhol的酶切位点实现的；
(2)将上述合成序列进行95度变性4min，然后缓慢降温至20度，使其形成不完全的发夹结构(图2);(3)在上述不完全的发夹结构的核酸溶液中加入DNA polymerase Klenow片段，buffer, dNTP，25度2小时，完成延伸反应，使其生成完全互补的、完整的发夹结构(图2);(4)通过氛/氯仿/乙醇沉淀法回收上述发夹结构的DNA，溶于H20，同时加入T4DNA连接酶,连接缓冲液,和预先合成好的、5’磷酸化的连接子Iinkerl,其序列特征为5’ -TTTTTAAGCTTCtcagcagagaactca-3 ’ ； 16度连接过夜，使发夹结构的DNA具备了 3类启动子转录的终止信号和3’酶切位点EcoRl (图3);(5)回收上述产物，方法同前，在此基础上，加入primerl，PCR反应的酶和buffer，95度变性3min，74度退火和延伸I. 5min，生成互补的DNA (图3);引物primerl的序列为5， -TGAGTTCTCTGCTGAGAAGCTT-3，；(6)进一步回收生成的底物，对互补DNA的3’端进行连接反应；其反应过程同步骤4,具体的linker2的序列为5’ -ACCGGTCCaccaactatccagac-3’;连接产物是的互补DNA具备了 5’端的酶切位点(图3);(7)回收上述连接产物，同时加入primer I和primer2,其中primerl和2均进行了 5’端加磷酸反应。加入PCR反应的酶和dNTP、buffer等。PCR反应条件为95度变性3min, 74度退火和延伸Imin,反应一共进行10个循环(图4);(8)回收上述PCR产物，并克隆至pMD-18 T simple载体(载体和片段的比例为I D ;该载体不含有Xhol，Agel和EcoRl等酶切位点。连接体系同前，连接反应为T4 DNAliagasel6度作用16小时(图5);(9)将连接产物转化入高效率的DH5aE. Coli中(转化时，每20ng载体转化200 μ L感受态细胞)，以保证获得最大的转染效率，转化后的细菌直接进行细菌培养；细菌培养过程中，每200 μ L感受态细胞在200mL培养基中培养；(10)提取质粒，通过Xhol酶切，胶回收载体后直接连接，使得额外的loop等序列去除(图5);(11)连接产物转化入高效率的DH5 a E. Coli中，过程同步骤(9);重新抽提质粒，通过Agel和EcoRl酶切后连入pLKO. 1，从而成功构建pLKO. I表达的随机shRNA文库(图
6)，将该文库质粒与VSVG、Δ8. 9质粒共转染HEK293T细胞即可产生病毒。通过扩大规模即可获得表达shRNA随机文库的病毒颗粒。
权利要求
1.一种随机ShRNA文库的构建方法，其特征在于通过合成特征性核酸序列(自5’到3’依次为21任意核酸、由Xhol酶切位点形成互补链的小茎环结构)，通过聚合、连接反应形成含有酶切位点和完全随机的shRNA的双链DNA结构，克隆至T载体，再用Xhol酶切后自连的方法，去除shRNA内部额外的序列,最后通过Agel和EcoRl酶切回收T载体中插入片段，亚克隆至pLKO. I载体中，构建表达完全随机的shRNA的pLKO. I质粒文库。
2.按照权利I表述的、合成的特征性核酸序列中的小茎环结构，其特征是5TCGAGATCACCATTATAAGATCTCGAG-3’。
3.按照权利I表述的Linker序列,其特征分别是连接子I序列5’ -TTTTTAAGCTTCTCAGCAGAGAACTCA-3 ;连接子 2 序列5’ -ACCGGTCCACCAACTATCCAGAC-3’。
全文摘要
创建了一种基于pLKO.1慢病毒载体的随机shRNA文库构建方法，其方法为合成特征性核酸序列(自5’到3’依次为21任意核酸、由Xho1酶切位点形成互补链的小茎环结构)，将其退火后补平成完全的发夹结构，通过连接反应加入shRNA表达所需终止序列和克隆所需3，端酶切位点EcoR1，在此基础上通过DNA聚合酶和单条引物产生其互补链，并再次通过连接反应，给新生成的链的3’端连接上酶切位点Age1；通过PCR的方法扩增同时含有Age1和EcoR1的序列；然后将PCR产物连入pMD-18 simple T载体，再用Xho1酶切后自连的方法，去除shRNA内部额外的序列，最后将插入片段亚克隆至pLKO.1载体中，构建表达完全随机的shRNA文库，并包装成病毒。该文库在筛选致病基因和药物靶点方面具有广阔的应用前景。
文档编号C12N15/85GK102925987SQ20121046469
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月19日 优先权日2012年11月19日
发明者杨国栋, 袁丽君, 王臻 申请人:杨国栋, 袁丽君, 王臻