专利名称：双表达的aav重组病毒的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种双表达猪繁殖与呼吸综合征病毒shRNA及0RF5-6免疫组合基因的AAV(Adeno-associated Virus)重组病毒的制备方法。
背景技术：
RNA干扰(RNA interference, RNAi)是一种使特定基因沉默、使其功能丧失或降低，具有高度序列专一性的RNA诱导的转录后调控方式，是研究基因功能、肿瘤基因治疗、抵御病毒侵袭的一种有效的手段。目前进行RNAi的策略主要有人工合成双链RNA、PCR产物直接导入、载体介导和病毒介导。腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)载体由于具有安全性好、免疫原性低、可转导分裂细胞和非分裂细胞及介导外源基因的长期表达等 特点，在基因治疗研究中受到了广泛关注。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种双表达的AAV重组病毒的制备方法。本发明的技术方案如下一种双表达的AAV重组病毒的制备方法，采用基因克隆技术将合成的特异性PRRSVRNA干扰寡核苷酸序列克隆至AAV Helper Free System中的表达质粒pAAV-U6-IRES-hrGFP的U6启动子下游，将PRRSV的0RF5-6结构蛋白基因克隆至pAAV-U6-IRES-hrGFP的CMV启动子的下游，构建成双效腺相关病毒载体PAAV-U6-IRES-hrGFP-siRNA-0RF5-6,通过酶切及PCR鉴定后进行DNA测序以鉴定重组质粒。优选的，所述的制备方法，具体方法包括以下步骤I) pAAV-U6-IRES-hrGFP-siRNA 质粒表达载体的制备PRRSV-shRNA弓丨物序列的设计及合成针对PRRSV JXAl毒株的基因组序列，设计筛选并合成DNA模板引物SH-A :5’ - Iccggt丨 gatgacgtcaggcatcactttcaagacgagtgatgcctgacgtcatctttttt
T-3’SH-B 5 -|CTAGA|AAAAAAGATGACGTCAGGCATCACT CGTCTTGAA AGTGATGCCTGACGTCATCA-3，；设立阴性对照，目的序列为已知序列碱基序列打乱后重排所得，酶切位点和发卡环结构相同；合成的单链目的基因片段的退火连接后形成双链DNA，与经Xba I和Age I双酶切的载体pAAV-U6-IRES-hrGFP连接后转化，提取质粒进行PCR鉴定，并经DNA测序法鉴定，得到干扰性质粒 pAAV-U6-IRES-hrGFP-shRNA ；2)双表达质粒 pAAV-U6-IRES-hrGFP-shRNA-0RF5-6 的构建PRRSV免疫蛋白组合基因0RF5-6的获得
针对PRRSV设计0RF5及0RF6全基因设计其引物，引物序列分别为F51 :5’ -ataGGATCCACCATGTTGGGGAAGTGCTTG-3> (BamH I)F52 :5， -GCGAATTC AAGAAGGTCAAAATTCAACAG ctagagacgaccccatag—3’ (EcoR HF61 :5’ -ATAGAATTC atggggtcgtctctagacga-3’ (EcoR I)F62 :5，-AGC ctcgag ttatttggcatatttaacaagg-3J (Xho I)利用Qigen RNA提取试剂盒提取PRRSV JXAl毒株RNA，利用RT-PCR法获取0RF5及0RF6基因后连接到pMD18-T载体上进行进行DNA测序分析；利用内切酶分别从T载体上双酶切下0RF5和0RF6，与经双酶切的PAAV-U6-IRES-hrGFP-shRNA连接，转化感受态细胞后挑斑，小量提取质粒后经PCR及酶切鉴定正确后测序表明，成功构建了 PRRSV shRNA及0RF5-6基因腺相关共表达载体pAAV-U6 -IRES-hrGFP-shRNA-0RF5-6。采用上述方案，本发明通过构建双表达猪繁殖与呼吸综合征病毒shRNA及0RF5-6免疫组合基因的AAV重组病毒载体，并对其在体外细胞中的表达进行检测。并将重组质粒与控制质粒pAAV-RC、辅助质粒pHelper共转染HEK293细胞，包装得到表达PRRSVsiRNA及0RF5及0RF6的重组腺相关病毒，测定重组AAV病毒毒价。实验证实，双效质粒转染靶细胞Marcl45，有延迟细胞病变的作用，说明双表达AAV疫苗载体能够转录出siRNA，对病毒的转录复制有一定的抑制效果。
图 I PRRSV 0RF5、0RF6基因的PCR结果；1 2000bp DNA marker ；2 0RF5 ；3 0RF6 ；
4:阴性对照；图 2 :为 pMD18-T-0RF5 的酶切及 PCR 鉴定图；1 2000bp DNA marker ；2 0RF5 ；3 0RF6 ；图3 pMD18-T-0RF6基因的酶切鉴定图；I 0RF6酶切鉴定；2 2000bp DNAMarker ；图 4 pMD18-T-0RF6 基因的 PCR 鉴定；1 2000bp DNA Marker ；2 0RF6 PCR 鉴定；图 5 :pAAV-shRNA-0RF5-6 的酶切鉴定结果；I :2000bp DNA Marker ；2 pAAV-shRNA-0RF5-6 切下 0RF5+6 ;3，质粒对照；4 T14 DNA Marker ；图6 pAAV-shRNA-0RF5+6质粒转染Marc-145细胞后对PRRSV的抑制作用；A :对照细胞:转染重组pAAV后接毒24h ；C :接毒24h细胞；图7 pAAV-shRNA-0RF5+6质粒及其对照质粒瞬时转染Marc-145细胞荧光图片；A :瞬时转染阳性质粒后48h ；B :转染阴性质粒对照；图8 pAAV-shRNA-0RF5+6质粒转染HEK293细胞后不同时间荧光图片；A :转染阳性质粒后36h ；B :转染阳性质粒后72h ；C :转染阴性质粒对照；图9 :包装成功的AAV重组病毒及对照细胞HEK-293 ；A pAAV-shRNA-0RF5+6、pHelper和pRC共同转染HEK-293细胞形成重组腺相关病毒(72小时HEK-293细胞病变)；B :载体转染对照组。图10 :包装成功的AAV重组病毒SDS-PAGE图；A图为AAV重组病毒SDS-PAGE图，B图为AAV重组病毒经纯化后SDS-PAGE图。
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。利用商品化的AAV Helper Free System构建双表达猪繁殖与呼吸综合征病毒shRNA及0RF5-6免疫组合基因的AAV重组病毒载体，并与控制质粒pAAV-RC、辅助质粒pHelper共转染HEK293细胞，包装得到表达PRRSV siRNA及0RF5及0RF6的重组腺相关病毒；经测定重组AAV病毒的滴度后，用包装重组AAV病毒试制疫苗免疫动物，验证该双效疫苗的作用。主要包括以下步骤步骤一、人工合成片段针对PRRSV 0RF7基因筛选确定RNAi有效靶序列，人工合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA。所设计的shRNA片段的引物为SH-A :5’ -CCGGTGATGACGTCAGGCATCACTTTCAAGACGAGTGATGCCTGACGTCATCTTTTTT T-3’SH-B :5’ -ctaga AAAAAGATGACGTCAGGCATCACT CGTCTTGAAAGTGATGCCTGACGTCATCA-3’ ；设立阴性对照，目的序列为已知序列碱基序列打乱后重排所得，酶切位点和发卡环结构相同。合成的单链目的基因片段的退火连接后形成双链DNA，与经Xba I和Age I双酶切的载体pAAV_U6-IRES_hrGFP连接后转化，提取质粒进行PCR用测序鉴定。得到干扰性质粒pAAV-U6-IRES-hrGFP-shRNA。步骤二、目的基因0RF5-6的获得根据PRRSV JXAl 毒株全基因组序列(gb | EFl 12445. I)，利用 DNAstar 及 DNAclubl软件，设计0RF5及0RF6基因的扩增引物，引物序列分别为F51 :5，-ata GGATCC ACCATGTTGGGGAAGTGCTTG-3 (BamH I)F52:5，-GC GAATTC AAGAAGGTCAAAATTCAACAG ctagagacgaccccatag二3，(EcoR I)F61 :5’ -ATA GAATTC atRRRRtcRtctctaRacRa-3’ (EcoR I)F62 :5，-AGC 包应巡 ttatttggcatatttaacaagg-3’ (Xho I)其中，在0RF5的上游引入起始密码子ATG，0RF6基因的下游引物的3’端引入终止密码子，同时在组合基因0RF5-6的上游加入Kozak序列等元件，在0RF5的下游引入FMDV的2A序列(加下划线的序列)，以启动0RF6的并联表达，在引物序列中，斜体并加下划的为酶切位点部分。提取PRRSV JXAl毒的RNA，利用经反转录得到的cDNA为模板进行扩增，得到0RF5和0RF6基因片段，如图I所示。将0RF5和0RF6基因分别连接到T载体后，经PCR和酶切鉴定正确后送去测序，结果见图2-4。步骤三、PRRSV双表达载体 pAAV-U6-IRES-hrGFP-siRNA-0RF5-6 的构建3. I、干扰性质粒 pAAV-U6-IRES-hrGFP-siRNA 的构建将针对0RF7基因筛选合成的靶序列的Oligo DNA，进行退火形成双链DNA，与线性化的载体pAAV-U6-IRES-hrGFP连接，连接产物转化感受态细胞，构建成RNA干扰性载体pAAV-U6-IRES-hrGFP-shRNA。挑选阳性克隆，提取质粒，进行电泳、酶切及PCR鉴定后送Invitrogen公司进行测序验证。阳性重组子命名为pAAV-U6-IRES-hrGFP_shRNA。3. 2、双效表达载体 pAAV-U6-IRES-hrGFP-siRNA-0RF5-6 的构建利用合适的内切酶分别从T载体上双酶切下0RF5和0RF6，与经双酶切的PAAV-U6-IRES-hrGFP-shRNA连接，转化感受态细胞后挑斑，小量提取质粒后经合适的双酶切，切下了 0RF5-0RF6大小的片段(如图5所示)，经DNA测序表明，已成功构建了PRRSVshRNA 及 0RF5-6 基因腺相关共表达载体 pAAV-U6-IRES-hrGFP-shRNA-0RF5_6。在3. I中，双启动子载体pAAV-U6-IRES-hrGFP中的U6启动子启动shRNA的转录，第二个启动子为CMV启动子，启动0RF5和0RF6的表达；终止子为polyA。 步骤四、双效表达载体pAAV-U6-IRES-hrGFP-siRNA-0RF5-6体外表达的检测用脂质体介导法将双表达质粒和空质粒分别导入Marcl45细胞，经病毒抑制试验表明双表达质粒中的shRNA在细胞中得到了转录，能够抑制FMDV在细胞中的复制；经间接免疫荧光等试验表明免疫组合基因在Marc 145细胞中得到了表达，见图6。所述的重组质粒的体外表达检测包括以下操作I)、细胞培养与脂质体转染 Marcl45细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养液中培养，培养条件为37°C 5% CO2培养箱，饱和湿度。转染前24h取对数生长期的Marcl45细胞用胰蛋白酶消化，用含10%胎牛血清的1640培养液(不含抗生素)重悬，调整细胞浓度为LX 105/mL，均匀接种于六孔板培养皿中，每孔2mL。细胞生长至70 % 80 %时，将六孔板用无血清培养液清洗2遍，预先加入I. 5mL无血清培养液，转染时分别用240 μ L无血清DMEM培养液与10 μ LLipofectamine2000 和 10 μ L pAAV-U6-IRES-hrGFP-shRNA-0RF5-6 质粒(约 3 μ g)混合，混匀并室温放置5min (siRNA终浓度为16 μ g/ml)。将两者混匀后室温孵育20min，加入培养皿中，摇动培养板，轻轻混匀。同时，设立对照组，将其与试验组同置于37°C 5% CO2，饱和湿度条件下培养，6h后以含10%胎牛血清的DMEM培养液换液。2)、Western-Blot在蛋白质水平检测0RF5及0RF6基因的表达量取转染后培养72h的六孔板，吸去培养基，PBS洗细胞2次，每孔加入100 μ I2X SDS裂解液裂解细胞，收集蛋白液至1.5ml离心管中，沸水煮lOmin，10000r/min离心lOmin，取上清液，用Bradford法测定总蛋白浓度，_20°C储存备用。取适量样品加入5X上样缓冲液，进行SDS-PAGE电泳，其中分离胶浓度12%，浓缩胶浓度5 %。停止电泳后，用Bio-Rad半干电转仪转移到硝酸纤维素膜上，恒流110mA，lh，然后5%的脱脂奶粉封闭，37°C，2h。加入稀释好的一抗37°C孵育Ih后，加入二抗，37°C孵育lh。参照ECL试剂盒操作说明书，根据膜的大小，取适量的A液、B液等体积混合，覆盖硝酸纤维素膜室温反应3min。浙干膜，用保鲜膜包裹后至暗盒中，暗房里曝光20s lmin、显影5min、定影5min,胶片洗净晾干后扫描。最后，用凝胶成像仪进行光密度分析，以0RF5与0RF6蛋白条带光密度比值反映其蛋白表达水平，并进行半定量和siRNA抑制效率分析(SDS-PAGE见图10)。3)、病毒抑制试验按常规法以双效质粒转染细胞，设空白细胞对照。24h后接种PRRSV JXAl毒株(由兰州兽医研究所传染病研究室分离保存，参考文献Zhao，T.Z.，Tian, X. S.，Zhang, Y. X.，Wang, B.，Yu, X. L，Cao, Z.，Deng, X. Y.，Hu, D. M. and Tian, K. G. Emergenceof fatalPRRSV variants !unparalleled outbreaks of atypical PRRS in Chinaand moIecuIardissection of the unique hallmark. PLoS 0NE2 (6)，E526 (2007)·(ACCESSI0NEF112445，VERSION EF112445. I GI :119068009)接种病毒量为 100TCID50/0. lmL，间隔6h观察细胞病变结果，结果见图6。结果表明，双效质粒转染靶细胞Marcl45，有延迟细胞病变的作用，说明双表达AAV疫苗载体能够转录出siRNA，对病毒的转录复制有一定的抑制效果，如图6所示。4)、间接免疫荧光检测免疫基因的表达间接免疫荧光检测转染了重组双表达质粒pAAV-U6-IRES-hrGFP-shRNA-0RF5-6的Marcl45细胞中0RF5和0RF6基因的表达，结果显示，阳性Marcl45细胞(A)中有较强的荧光，而对照组细胞(B)中则无可见荧光，如图7所示，说明免疫组合基因得到了有效表达。同时，利用间接免疫荧光检测转染了重组双表达质粒pAAV-U6-IRES-hrGFP-shRNA-0RF5-6的HEK293细胞中的表达情况，在不同时间观察荧光情况，结果显示，阳性HEK293细胞中有荧光产生，转染后72h比转染后36h荧光明显增多，而对照组细胞中则无可见荧光，如图8所示，说明免疫组合基因得到了有效表达。步骤五、将该双表达质粒与AAV Helper Free System中的控制质粒pAAV-RC、辅助质粒pHelper用磷酸钙法共转染HEK293细胞，包装得到表达PRRSV shRNA及0RF5及0RF6 的重组腺相关病毒(见图9)，并对重组腺相关病毒的滴度进行测定。检测所包装的腺相关病毒毒液中的蛋白浓度，并计算病毒滴度。病毒滴度(particles/mL)=蛋白浓度(mg/mL)XL 33X1014，求得病毒滴度为9. 31X1011。HEK293细胞用含10 %胎牛血清(FBS)的DMEM培养基常规培养。包装前2d于IOOmm培养皿接种3X106个细胞，当细胞生长至汇合率60 %左右，取重组质粒pAAV-U6-IRES-hrGFP-shRNA-0RF5-6、包装质粒 pAAV-RC 以及辅助质粒 pHelper 各 10 μ g，利用磷酸钙法共转染HEK293细胞；同时，以相同体积TE溶液代替重组质粒，其他转染条件不变，作为阴性对照；37°C、5% CO2条件下培养。转染孵育后6h，更换含10% FBS的DMEM培养基，继续培养66 72h。期间每隔24h于倒置显微镜下观察细胞形态变化。培养结束，完成病毒包装，收获病毒包装组细胞以及培养上清液，经4次-70°C /37°C反复冻融后IOOOOg室温离心IOmin收集上清，制成pAAV-U6-IRES-hrGFP-shRNA-0RF5-6病毒悬液，保存于_80°C，以进行电镜观察，检测病毒粒子的状态及浓度，并利用斑点杂交法测定病毒效价。应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
权利要求
1.一种双表达的AAV重组病毒的制备方法，其特征在于，采用基因克隆技术将合成的特异性PRRSV RNA干扰寡核苷酸序列克隆至AAV Helper Free System中的表达质粒pAAV-U6-IRES-hrGFP的U6启动子下游，将PRRSV的0RF5-6结构蛋白基因克隆至pAAV-U6-IRES-hrGFP的CMV启动子的下游，构建成双效腺相关病毒载体PAAV-U6-IRES-hrGFP-siRNA-0RF5-6,通过酶切及PCR鉴定后进行DNA测序以鉴定重组质粒。
2.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于，具体方法包括以下步骤 1)pAAV-U6-IRES-hrGFP-siRNA质粒表达载体的制备 PRRSV-shRNA引物序列的设计及合成针对PRRSV JXAl毒株的基因组序列，设计筛选并合成DNA模板引物SH-A :5’ - |CCGGT( GATGACGTCAGGCATCACTTTCAAGACGAGTGATGCCTGACGTCATCTTTTTTT-3，SH-B :5’ _ Ictaga丨 aaaaaagatgacgtcaggcatcact cgtcttgaa agtgatgcctgacgtcatcA-3，； 设立阴性对照，目的序列为已知序列碱基序列打乱后重排所得，酶切位点和发卡环结构相同；合成的单链目的基因片段的退火连接后形成双链DNA，与经XbaI和AgeI双酶切的载体pAAV-U6-IRES-hrGFP连接后转化，提取质粒进行PCR鉴定，并经DNA测序法鉴定，得到干扰性质粒 pAAV-U6-IRES-hrGFP-shRNA ； 2)双表达质粒pAAV-U6-IRES-hrGFP-shRNA-0RF5-6 的构建 PRRSV免疫蛋白组合基因0RF5-6的获得 针对PRRSV设计0RF5及0RF6全基因设计其引物，引物序列分别为F51 :5’ -ataGGATCCACCATGTTGGGGAAGTGCTTG-3, (RamH I)F52 :5， -GCGAATTC AAGAAGGTCAAAATTCAACAG ctagagacgaccccatag-3’ (EcoR HF61 :5’ -ATAGAATTC atggggtcgtctctagacga-3’ (EcoR I)F62 :5’ -AGC ctcgag ttatttggcatatttaacaagg-3J (Xho I) 利用Qigen RNA提取试剂盒提取PRRSV JXAl毒株RNA，利用RT-PCR法获取0RF5及0RF6基因后连接到pMD 18-T载体上进行进行DNA测序分析； 利用内切酶分别从T载体上双酶切下0RF5和0RF6，与经双酶切的PAAV-U6-IRES-hrGFP-shRNA连接，转化感受态细胞后挑斑，小量提取质粒后经PCR及酶切鉴定正确后测序表明，成功构建了 PRRSV shRNA及0RF5-6基因腺相关共表达载体pAAV_U6-IRES-hrGFP-shRNA-0RF5-6。
全文摘要
本发明公开了一种双表达的AAV重组病毒的制备方法，采用基因克隆技术将合成的特异性PRRSV RNA干扰寡核苷酸序列克隆至AAV Helper Free System中的表达质粒pAAV-U6-IRES-hrGFP的U6启动子下游，将PRRSV的ORF5-6结构蛋白基因克隆至pAAV-U6-IRES-hrGFP的CMV启动子的下游，构建成双效腺相关病毒载体pAAV-U6-IRES-hrGFP-siRNA-ORF5-6，通过酶切及PCR鉴定后进行DNA测序以鉴定重组质粒。实验证实，双效质粒转染靶细胞Marc145，有延迟细胞病变的作用，说明双表达AAV疫苗载体能够转录出siRNA，对病毒的转录复制有一定的抑制效果。
文档编号C12N15/66GK102925485SQ20121047411
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月9日 优先权日2012年11月9日
发明者柳纪省, 杨彬, 兰喜, 邱燕, 殷相平, 李学瑞, 李宝玉, 白银梅, 张韵, 李志勇, 方玉萍 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所