专利名称：一种糖化酶的制作方法
一种糖化酶技术领域
本发明属于微生物工程技术领域，具体涉及一种糖化酶及用于表达该糖化酶的重组表达工程菌。
背景技术：
糖化酶,又称葡萄糖淀粉酶(Glucoamylase),它能把淀粉从非还原性未端水解 α -1. 4葡萄糖苷键产生葡萄糖，也能缓慢水解a-1. 6葡萄糖苷键，转化为葡萄糖。同时也能水解糊精，糖原的非还原末端释放β-D-葡萄糖。糖化酶用于以葡萄糖作发酵培养基的各种抗生素、有机酸、氨基酸、维生素的发酵；本品还大量用于生产各种规格的葡萄糖。总之， 凡对淀粉、糊精必需进行酶水解的工业上，都可适用。
我国高转化率糖化酶市场发展迅速，产品产出持续扩张，国家产业政策鼓励高转化率糖化酶产业向高技术产品方向发展。2011年国内糖化酶的市场容量为5亿元人民币， 而且市场以每年20%速度在增长。预计2012年市场容量不低于6亿元。糖化酶价格则自 2007年起不断上涨，由2元/公斤涨到2. 7元/公斤。因此，国内企业新增糖化酶投资项目也逐渐增多。
目前常用的糖化酶均是来自黑曲霉。自70年代中期开始，中科院微生物所筛选获得了高产糖化酶菌株AS. 3. 4309。该菌株国内许多大型抗生素制药厂、酒精厂、酿酒厂进行了生产规模试验，均获得成功。该项目的成功为我国发酵行业节约了大量的粮食，产生了巨大的经济效益和社会效益。市场越来越密切关注高转化率糖化酶，这使得克隆和表达高转化率糖化酶成为研究的热点之一。蛋白表达系统是黑曲霉，其产酶量(蛋白量)较高，但是受到糖化酶本身性质的影响，黑曲霉表达糖化酶的比活比较低，不能适应市场的需求。因此， 开发性能优良、比活高的糖化酶越来越受到各方 的关注。发明内容
本发明的目的是提供一种新型糖化酶及其重组表达工程菌，并将筛选的糖化酶基因转入里氏木霉(Trichoderma reesei)中进行表达,为实现糖化酶的高密度发酵生产奠定了基础。
本发明一方面提供一种新型的糖化酶，所述的糖化酶包括
I)氨基酸序列为SEQ ID NO:1的糖化酶；
2)在I)限定的氨基酸经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有糖化酶功能的，由I)衍生的蛋白质。
用于编码上述糖化酶的基因，其一种核苷酸序列为SEQ ID N0:2。
本发明另一方面提供了一种表达载体，其包含上述编码糖化酶的核苷酸。
本发明另一方面提供了一种表达宿主细胞，其携带有表达上述糖化酶基因的表达载体。
上述表达宿主细胞为里氏木霉(Trichoderma reesei)。
本发明所述糖化酶在里氏木霉工程菌中得到高效表达，酶活水平达到148U/mL。所述糖化酶能从糖链的非还原端高效分解a -1, 4-糖苷键，因此，有望将其应用于全酶法生产葡萄糖的糖化过程。
图1 :本发明构建的表达载体质粒图谱。图2 :里氏木霉工程菌发酵上清液的SDS-PAGE电泳分析图，其中箭头所指为重组表达的糖化酶。
具体实施例方式以下实施例是为了更好地说明阐述本发明内容，本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，本发明的保护和权利要求范围不限于所提供的案例。 实施例1绳状青霉(Penicillium funiculosum)糖化酶基因的克隆1.1总DNA的提取将绳状青霉(购自中国普通微生物囷种保减管理中心，囷株编号3. 3791)过夜培养，取适量菌体置于离心管中，13000 rpm离心5 min，弃上清；加入400 抽提缓冲液(100mM Tris-HCl, IOOmMEDTA, 250 mM NaCl, 1%SDS);然后加 IOOmg石英砂或玻璃珠，在珠打仪剧烈振荡2min左右；65°C水浴20min后，加入200iil IOM NH4AC,冰浴IOmin ；13000rpm离心IOmin,取上清；加入2倍体积的无水乙醇，_20°C放置30min ；13000 rpm离心IOmin,弃上清；用70%乙醇洗涤2次；晾干，加入水溶解，于_20°C保存。1. 2基因克隆以1.1中提取的基因组总DNA为模板进行PCR扩增，引物序列如下上游引物ATGGCTGTAACAGCTGCCTTGGCCG下游引物CTACTGCCAGCTATCGTTGATGCAGPCR。扩增条件为94°C 3min ；94°C 30S ；58°C 30S，72°C 2min 30 个循环；72°C 7min。利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物。1. 3测序分析将1. 2中回收的扩增产物分别连接到pMD18 T-载体，相应的克隆载体分别命名为pT-Glu，转化大肠杆菌DH5a。最后把阳性克隆送至北京华大基因研究中心进行测序分析。测序结果，扩增产物的基因序列为SEQ ID NO: 2，其编码氨基酸序列为SEQ ID NO:1。多个不同克隆测序结果表明没有出现扩增时的错误。经NCBI的BLAST比对发现,其核酸序列与Penicillium marneffei菌的糖化酶核酸具有87%同源性；该蛋白属于15家族的糖水解酶，具有糖化酶保守催化和结构域，与Penicillium marneffei菌的糖化酶具有89%的同源性,证明本发明筛选的酶为新的，与已知酶来源不同的新的等位基因。实施例2里氏木霉工程菌的构建2.1表达载体构建以质粒pT-Glu 为模板，利用引物(ACGCGTCGACATGGCTGTAACAGCTGCCTTGGCCG 和 CGCGGATCCCTACTGCCAGCTATCGTTGATGCAG)进行 PCR 扩增，PCR 扩增条件是 94°C 3min ；94°C 30S ；58°C 30S,72°C 2min 30个循环；72°C 7min。扩增产物凝胶回收后，先进行Sal I和 BamH I双酶切。同样，对木霉表达质粒pKDN_EG也进行Sal I和BamH I双酶切。用T4连接酶把双酶切产物即克隆基因和表达载体22°C连接过夜。最后，把连接产物导入大肠杆菌 DH5a。相应的阳性克隆表达质粒命名为pVL-glu,质粒图谱如图1所示。
2. 2原生质体制备
接种里氏木霉菌丝于PDA平板上生长4天；切取直径约3cm的菌落置于约60ml YEG (O. 5%酵母粉、1%葡萄糖)的液体培养基中，30°C，200 rpm振荡培养过夜；多层纱布过滤收集菌丝;将菌丝置于盛有20 ml裂解酶液(O. 2g/10ml，0. 7 M NaCl溶解，Sigma L1412) 酶解2小时；取出酶解液，轻轻摇晃，倒于三层灭菌擦镜纸过滤，收集滤液，3000 rpm，离心 10 min;弃上清,加5 ml溶液2悬浮,然后3000 rpm,离心10 min ;加适量溶液2悬浮分装 (200 μ /管，IO8 个/ml)。
2. 3转化与验证
取10 ul pKDN-Glu DNA加入到200μ1原生质体中，接着加入50μ1 25%PEG溶液轻轻混匀，冰浴20min ;然后加入2 ml 25%PEG，轻轻混匀，室温静置5min，把原生质体加到50 ml左右熔化后冷却至45-55°C的上层半固体培养基(O. l%MgS04, 1%KH2P04, O. 6%(NH4)2SO4, 1%葡萄糖，18. 3%山梨醇，O. 35%琼脂糖)，轻轻混匀后倒入含IOOPg/ ml潮霉素下层基础培养基平板(2%葡萄糖，O. 5% (NH4) 2S04, 1. 5%KH2P04, O. 06%MgS04, O. 06%CaCl2，1. 5%琼脂)，28°C黑暗培养数天至转化子长出。
按照实施例1中的方法提取转化子基因组DNA为模板，利用引物扩增目的验证转化子。利用实施例1中引物进行PCR扩增目的基因。PCR扩增条件为94°C 3min ；94°C 30S ； 58°C 30S，72°C 90S 30个循环；72°C 7min。利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物并进行测序分析，经过PCR反应选育和验证阳性转化子。所获得的阳性工程菌命名为里氏木霉 VL-2 (Trichoderma reesei VL-2)。
实施例3发酵和酶学性质测定
3.1木霉工程菌摇瓶发酵
将上述木霉工程菌VL-2接种于MM发酵培养基(1. 5%葡萄糖，1. 7%乳糖，2. 5%玉米浆，O. 44%(NH4)2SO4,0. 09%MgS04，2%KH2P04，0. 04%CaCl2，0. 018% 吐温-80,0. 018% 微量元素， O. 018%聚丙二醇-2000 )，28 °C培养48小时，然后25 °C乳糖诱导培养48小时，取发酵上清液，进行SDS-PAGE分析。结果如图2所示，其中箭头所指处为重组表达的糖化酶，说明本发明所述糖化酶基因在木霉工程菌中得到高效表达，利用考马斯亮蓝法测定显示其表达量约为 3g/L。
3. 2酶活测定
(I)酶活测定方法
甲、乙两支50mL比色管，分别加入25mL的2%可溶性淀粉溶液和5mL的O.1M乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH4. 6);于40±0. 2°C的恒温水浴中预热5 lOmin。在甲管中加入酶制备液2. OmL摇匀并立即记时；反应Ih后，立即在甲、乙两管各加O. 2mL的20%氢氧化钠溶液，立即摇匀并将两管取出迅速用水冷却；然后于乙管中补加酶制备液2. OmL(作为对照)。取两管中上述反应液各5mL放入碘量瓶中，准确加入O.1N碘液10mL，再加O.1N氢氧化钠溶液15mL (边加边摇晃)，放置暗处15min，加入2N硫酸2mL ;最后用0. 05N硫代硫酸钠溶液滴定至无色为终点。酶活X = (A-B) XNX90. 05Xn其中X-酶活力单位，U /g (mL);A—空白试验消耗硫代硫酸钠溶液的毫升数；B—样品消耗硫代硫酸钠溶液的毫升数；N—硫代硫酸钠溶液的当量浓度；n——稀释倍数；
90. 05—ImLlN硫代硫酸钠相当葡萄糖毫克数；(2)酶活测定按照上述测定方法，取Iml上述摇瓶发酵的上清液进行酶活测定。结果显示其酶活为148U/mL，说明糖化酶基因在木霉工程菌中得到高效表达。实施例4转糖实验取IOml经淀粉酶液化的淀粉，加入2ml上述摇瓶发酵的上清液，即糖化酶；55°C作用30分钟后，测定反应液的DE值(还原性糖值)，达到89% ;然后，等比例加入适量普鲁兰酶，55°C作用I小时后，其DE值超过了 92%。实验结果表明，本发明的糖化酶能从糖链的非还原端高效分解a -1, 4-糖苷键，因此，能够将其应用于全酶法生产葡萄糖的糖化过程。
权利要求
1.一种糖化酶，所述的糖化酶包括1)氨基酸序列为SEQID NO:1的糖化酶；2)在I)限定的氨基酸经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有糖化酶功能的， 由I)衍生的蛋白质。
2.用于编码上述糖化酶的基因，其核苷酸序列为SEQID N0:2。
3.一种重组表达载体，所述的重组表达载体用于表达权利要求1所述的糖化酶。
4.如权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于所述的表达载体包含有权利要求2 所述的基因。
5.一种用于表达权利要求1所述的糖化酶的表达宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞携带有权利要求3所述的重组表达载体。
6.如权利要求5所述的表达宿主细胞，其特征在于所述的宿主细胞为里氏木霉 (Trichoderma reesei)。
全文摘要
本发明提供了一种新型糖化酶及其重组表达工程菌，所述的酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1；并将筛选的糖化酶基因转入里氏木霉(Trichoderma reesei)中进行表达，构建了里氏木霉工程菌株。本发明所述糖化酶在里氏木霉工程菌中得到高效表达，酶活水平达到148U/mL，为实现糖化酶的高密度发酵生产奠定了基础。
文档编号C12R1/885GK102994476SQ20121049155
公开日2013年3月27日 申请日期2012年11月27日 优先权日2012年11月27日
发明者黄亦钧, 刘士成, 王华明, 张慧丹 申请人:青岛蔚蓝生物集团有限公司