专利名称：鸡高迁移率族蛋白b1抗原多肽和抗鸡高迁移率族蛋白b1单克隆抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及细胞工程技术领域，具体涉及利用ChHMGBl抗原多肽制备抗chHMGBl单克隆抗体及其应用。
背景技术：
高迁移率族蛋白(HMG)最早由Johns于20世纪70年代在小牛胸腺中发现，是种几乎存在于所有真核细胞内的非组蛋白染色体结合蛋白，因其分子质量小(<30kD)，在聚丙烯酰胺凝胶电泳快速迁移而被命名为高迁移率族蛋白(HMG蛋白)。根据分子质量大小及DNA结合特性，HMG族蛋白分为HMGA，HMGB, HMGN家族；HMGB又分为HMGBl和HMGB2。HMGBl在进化过程中高度保守，在所有哺乳动物中有99%同源性。HMGBl分子包括3个功能区含与DNA结合的结构域A盒(Iaa 79aa)和B盒(89aa 163aa)，及I个高度重复并富含带负电荷的天冬氨酸和谷氨酸的C-末端(186aa 215aa)。其中，B盒前20个氨基酸是其发挥细胞因子活性的关键位点。A盒蛋白(A-box)能取代全长HMGBl而与相应受体结合，但不发挥生物学效应，故纯化的A-box可作为HMGBl特异性拮抗剂。HMGBl广泛分布于淋巴、心、肝、肺、脑、脾、肾等组织，在肝和脑组织中HMGBl主要存在于胞浆，而大多数其他组织中存在于细胞核内。在这些细胞核中，HMGBl和HMGB2结合于DNA双螺旋小沟内，引起DNA构象变化。这种结合无序列选择性，可以帮助特异性DNA结合蛋白正确装配到其在染色体内的结合位点。高迁移率族蛋白BI (high mobility group boxBl,HMGBl),是一种典型的危险因子，正常情况下表达于胞核和胞浆内的非组蛋白染色体结合蛋白，参与多种生物学过程包括基因转录、DNA修复、V (D) J重组(胚系基因片段重组)、分化和发展。其功能主要为①使双螺旋极度扭曲以便各种转录因子和染色质相互作用；②调节类固醇激素受体、NF-K B、p53及RAGl重组酶的转录活性；③与组蛋白作用而影响染色质结构，使染色质解螺旋。HMGBl非特异性与DNA结合，可通过核孔而穿梭于胞核与胞浆之间。HMGBl仅在危险信号出现时释放至胞外发挥作用。胞外HMGBl不仅可直接充当炎性细胞因子参与固有免疫效应，也可作为内源性DAMP激活APC，从而启动、增强适应性免疫应答，并参与多种疾病过程发生和发展。HMGBl过表达有抑制细胞凋亡，诱导细胞分化、细胞迁移、细胞增殖等作用。因此，HMGBl可能作为干预多种免疫相关疾病的重要靶标。目前已发现的HMGBl的重要受体包括晚期糖基化终末产物受体(receptor for advanced glycation end products,RAGE)、Toll样受体2 (toll like rec^ptor2，TLR2)、TLR4。新近研究表明它也不但是一种转录因子和促生长因子，而且是一种重要的炎性细胞因子，并与肿瘤的发生、浸润、转移等生物学行为关系密切，有很重要的临床价值。本课题组前期的蛋白质组学结果也显示chHMGBl在J亚群禽白血病(ALV-J)感染的细胞中蛋白表达水平有差异，故推测chHMGBl在ALV-J感染致病过程中发挥一定的作用。目前对于chHMGBl的研究还处于起始阶段，各种检测chHMGBl表达的方法还很欠缺。为了深入研究chHMGBl的生物学功能，必须有相应的抗体工具，因此筛选合适的chHMGBl抗原多肽以及制备抗chHMGBl的单克隆抗体对进行相应研究具有重要作用。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中的不足，提供一种chHMGBl抗原多肽，它的氨基酸序列为VDAGKKVVAKAEKSKK，该多肽能诱导动物产生抗鸡chHMGBl抗体。本发明的另一目的是提供一株能分泌抗chHMGBl抗原多肽的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本发明的又一目的是提供chHMGBl抗原多肽的单克隆抗体，这些多肽制备的单克隆抗体能够与融合蛋白表达的chHMGBl反应，也能与禽类巨噬细胞系HDll和CEF、DF1细胞中天然的chHMGBl特异性反应，还可以应用于免疫蛋白印迹反应，检测细胞受到刺激后分泌到培养上清中的chHMGB I。本发明通过以下技术方案实现上述目的筛选合适的chHMGBl多肽序列，获得良好的免疫原，以此制备抗chHMGBl的单克隆抗体。具体技术方案如下一种ChHMGBl抗原多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO: I所示。chHMGBl蛋白共有16个氨基酸，经过对其进行亲水区，疏水区，抗原性等多方面的研究，最终筛选确定16个氨基酸序列即VDAGKKVVAKAEKSKK，作为抗原多肽。一株杂交瘤细胞株2G1是由上述chHMGBl抗原多肽作为抗原制备得到，能够分泌抗chHMGBl的单克隆抗体，2012年10月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址中国.北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；保藏编号为 CGMCC No. 6708。一种抗chHMGBl的单克隆抗体是由上述杂交瘤细胞株2G1得到的。该抗chHMGBl的单克隆抗体的制备方法如下I. chHMGBl抗原多妝合成，与匙孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin, KHL)偶联后免疫小鼠；2.杂交瘤细胞株制备与筛选取免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,然后用常规ELISA检测技术筛选，建立杂交瘤细胞株；3.单克隆抗体的纯化对所得杂交瘤细胞株分泌的单抗利用Protein G层析柱纯化，SDS-PAGE电泳分析纯化结果。上述抗chHMGBl单克隆抗体可以与融合蛋白表达的chHMGBl反应，而且能够与禽类巨噬细胞系HDll和CEF、DF1细胞中天然的chHMGBl特异性反应；该抗体还可以用于细胞刺激后培养上清中chHMGBl的分析，因此可以用于对chHMGBl分子生物学功能的深入研究，以及监测与chHMGBl分子相关的疾病。
图IchHMGBl 融合蛋白 westernblot 鉴定M:蛋白 Marker; l:PET32a-chHMGBl;2:GST-chHMGBl。图2细胞裂解物中chHMGBl蛋白的western blot鉴定
M:蛋白Marker; I: HD11细胞裂解上清；2: CEF细胞裂解上清。图3HD11细胞培养上清中chHMGBl蛋western blot鉴定Μ:蛋白Marker; I: LPS刺激后I小时；2: LPS刺激后6小时；3: LPS刺激后12小时；4:LPS刺激后24小时。图4鸡高迁移率族蛋白BI间接免疫荧光鉴定(X100)A/D:DF1细胞阳性/阴性对照;B/E:CEF细胞阳性/阴性对照;C/F:HD11细胞阳性/阴性对照。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于解释发明，而不用于限制发明的范围。在不背离本发明的技术方案的前提下，对本发明所做的本领域普通技术人员容易实现的任何改动都将落入本发明的权利要求范围内。实施例IchHMGBl抗原多肽的设计I.鸡高迁移率族蛋白BI抗原多肽的设计及合成根据已登录的鸡高迁移率族蛋白BI (GenBank:AF178849，Y17968)获得chHMGBl蛋白序列，含有215个氨基酸。2.用DNAstar软件分析chHMGBl蛋白特性、亲疏水性、表露性、免疫原性及结构组成情况，最终获得一段符合要求的序列VDAGKKVVAKAEKSKK位于168 183位(SEQ IDN0:l)o实施例2制备抗chHMGBl的单克隆抗体I.抗原多肽合成与动物免疫根据实施例I的设计抗合成原多肽，该多肽与KHL偶联，免疫61周龄雌性BALB/c小鼠。采用腹腔直接注射，三免后采集血清进行ELISA实验测定小鼠血清效价，选择免疫效价高的小鼠进行加强免疫后准备细胞融合。2.细胞融合取加强免疫三天后的小鼠脾脏，分离脾脏细胞并计数。将分离的脾细胞与骨髓瘤细胞以5:1比例在PEG作用下融合，并分别加入到96孔细胞培养板。利用HAT选择培养基培养，观察细胞生长情况。3.阳性杂交瘤细胞的筛选当融合阳性细胞克隆生长出来时，采集细胞上清进行ELISA检测，单抗分泌阳性孔保留，进一步经过有限稀释法进行亚克隆筛选。4.单克隆抗体杂交瘤细胞建株经过三次亚克隆筛选，选高分泌特异性抗体的细胞扩大培养或冻存。反复冻存和复苏的杂交瘤细胞系，经染色体分析稳定，抗体检测保持阳性的细胞系进行建株命名2G1，同时送中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 6708。实施例3chHMGBl单克隆抗体的应用I.检测抗原制备免疫印迹所需抗原来自原核表达载体表达的chHMGBl融合蛋白、CEF和HDll细胞裂解上清，以及HDll细胞刺激物的培养上清。I. I原核表达载体表达的chHMGBl融合蛋白制备按照Axygen公司总RNA小量制备试剂盒步骤提取DF-I细胞的总RNA,并逆转录为cDNA。以新鲜制备的cDNA为模板进行HMGBl基因的扩增，反应体系为50 μ L cDNA模板I μ L，上游引物为5’-AG GAA TTC ATG GGC AM GGA GAT CCT AA_3’(SEQ ID NO:2)下游引物为 5’-GC CTC GAG TTA TTC ATC ATC ATC ATC TT-3’ (SEQ ID NO:3)上下游引物各 IyL(IOnM), dNTP4y L, IOXbuffer (含 MgCl2) 5 μ L，LA TaqDNA 聚合酶 0· 5 μ L，ddw37. 5μ L0PCR反应的循环参数95°C 5min ；95°C 30s,60°C (退火温度根据不同基因有所调整)30s，72 °C 30s，30个循环；72°C延伸lOmin。反应结束后进行电泳，凝胶浓度1%上样量5yL。胶回收上样50 μ L电泳，按照胶回收试剂盒回收PCR产物-20°c保存备用。将目的基因片段与pGEM-T Easy载体(购于美国Promega公司)按说明书要求以3:1的摩尔比在16°C水浴中连接过夜(连接体系10 μ L 5X ligationbuffer2 μ L, pGEM-T载体3 μ L，目的片段3 μ L，T4连接酶I μ L，ddwl μ L)，连接产物5 μ L加入DH5 α大肠杆菌感受态细胞，将转化后的感受态细胞均匀涂布于LB-Amp平板(添加X-Gal和IPTG)，37°C 过夜培养。挑取白色菌落进行培养，按常规方法提取质粒，用进行EcoRI单酶切鉴定(酶切体系10 μ L =Bufferl μ L, EcoRlO. 5 μ L,质粒3μ L，ddw5. 5μ L),筛选阳性质粒标记为pGEM-T-chHMGBlo利用引物两端酶切位点EcoR I和XhO I酶切重组质粒pGEM-T_chHMGBI，回收目的条带并亚克隆入PGEX-6P-1和PET-32a (购于美国罗氏公司)，构建重组原核表达质粒PGEX-chHMGBl和ΡΕΤ-chHMGBl。经IPTG诱导后，超声波裂解细菌，按照GE公司的蛋白纯化试剂盒纯化融合蛋白，即为检测用抗原。I. 2CEF和HDll细胞裂解上清制备CEF和HD11细胞用RIPA细胞裂解液置于冰上裂解I小时，13200rpm离心30分钟，收集上清即为检测用抗原。I. 3HD11细胞刺激物的培养上清制备HDll细胞利用400ng/ml的脂多糖(LPS)刺激，分别收集刺激后I小时，6小时，12小时和24小时的培养上清作为检测用抗原。2. Western blot检测抗体特异性将检测用抗原原核表达载体表达的chHMGBl融合蛋白和HDll细胞刺激上清进行SDS-PAGE，然后按照Western印迹操作步骤转移到硝酸纤维素膜，依次加一抗、二抗(AP标记的羊抗鼠IgG购于美国SIGMA公司)，观察结果。Western blot结果显示,2G1不仅可与chHMGBl融合蛋白反应(如图I),还能与CEF、HD11细胞裂解上清中天然的chHMGBl反应(如图2)，此外2G1还能与HDll细胞受LPS刺激后释放到培养上清中的天然chHMGBl反应(如图3)。3.共聚焦显微镜观察将禽类巨噬细胞系HDll或CEF、DFl爬片培养24h后，取出爬片4%多聚甲醛固定并破膜，BSA封闭后分别孵育一抗,二抗，PBS洗漆五次,控干过量缓冲液,抗淬灭剂封片,然后用莱卡SP2共聚焦显微镜观察chHMGBl在细胞中细胞定位情况。另设Isotype抗体孵育的细胞为阴性对照。共聚焦免疫荧光发现，单克隆抗体2G1能够与禽类巨噬细胞系HD11、CFF、DF1细胞中天然chHMGBl特异性反应(如图4)。
权利要求
1.一种能诱导抗鸡高迁移率族蛋白BI抗体的抗原多肽，其特征在于氨基酸序列VDAGKKVVAKAEKSKKo
2.一株杂交瘤细胞株，其特征在于由权利要求I所述抗原多肽作为抗原制备得到，能够分泌抗chHMGBl的单克隆抗体，保藏编号为CGMCC No. 6708。
3.一种抗chHMGBl的单克隆抗体，其特征在于由杂交瘤细胞株CGMCC No. 6708分泌得到。
全文摘要
本发明公开了鸡高迁移率族蛋白B1(chHMGB1)抗原多肽和抗chHMGB1的单克隆抗体。该chHMGB1抗原多肽序列为VDAGKKVVAKAEKSKK。以该抗原多肽为免疫原免疫Balb/c小鼠，筛选得到一株杂交瘤细胞株2G1，保藏编号为CGMCCNo.6708。该细胞株能够持续稳定地分泌抗chHMGB1的单克隆抗体。该单克隆抗体不仅能够与融合蛋白表达的chHMGB1反应，而且能够与禽类巨噬细胞系HD11和CEF、DF1细胞中天然的chHMGB1特异性反应；该抗体还可以用于细胞刺激后培养上清中chHMGB1的分析，因此可用于对chHMGB1分子生物学功能的深入研究。
文档编号C12N5/20GK102924577SQ201210494560
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月28日 优先权日2012年11月28日
发明者钱琨, 秦爱建, 张娜, 朱明月, 高爱俊, 金文杰, 邵红霞 申请人:扬州大学