专利名称：用于mst1基因定量检测的标准质粒及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及用于定量检测MSTl基因的标准质粒及试剂盒，本发明还涉及检测MSTl基因的引物。
背景技术：
哺乳动物STE20相关激酶(MST)是哺乳动物系统中体内普遍泛素化表达的一种丝/苏氨酸蛋白激酶，主要包括MST1、MST2、MST3和MST4四个成员。许多细胞系的研究表明，多种促凋亡刺激和细胞应激可激活MST1，激活的MSTl产生的片段可以入细胞核，从而与核内一些蛋白如DAP、H2b相互作用，引起染色质浓缩和DNA断裂。也有报道指出，MSTl能专一性地被具有活性的蛋白酶Caspase3所剪切活化，过量表达的MSH也能诱导Caspase3活 性，由此MSIl和Caspase形成正向反馈回路，导致DNA片段化与核膜崩解，进一步增强了凋亡反应。近几年，国内外研究MSTl激酶的凋亡作用，主要集中在蛋白结构变化和生物活性这两方面，而对于组织或细胞中MSTl基因表达调控的影响研究较少。传统的RT-PCR方法常被用于mRNA转录的检测，但此方法是非定量的。实时荧光定量PCR可以通过标准曲线对未知模板进行定量分析，从而实现了 PCR技术从定性到定量的飞跃，利用实时荧光定量PCR技术对基因mRNA的表达水平进行研究非常可靠，其研究结果具有可比性和重复性。SYBR Green I实时荧光定量PCR是目前较为准确定量检测核酸的一种方法。SYBRGreen I染料非特异地与双股DNA分子结合，在适当的光源激发下放出荧光，其荧光信号强度与双链DNA的数量相关，即荧光信号的增加与PCR产物的增加同步，所以对不同模板不需要特别定制不同的特异性探针，其检测范围宽、灵敏度高、特异性强、成本低、易于标准化，是一种有效、快速和简便的检测方法。由于SYBR Green I没有特异性，对PCR反应中的非特异性扩增或引物二聚体也会产生荧光，会影响定量的精确性，因此该方法对PCR扩增特异性要求较高。目前，PCR产物的非特异性扩增以及引物二聚体的问题可以通过溶解曲线的分析得以解决，根据样品的Ct值参照标准曲线，经软件分析处理后可以精确的计算出样品的拷贝数，因此，国内外在科研中使用比较普遍。SYBR Green I模式的荧光定量PCR是一种利用荧光染料非特异地与双股DNA分子结合释放荧光的一种基因表达定量方法，它具有检测范围宽、灵敏度高、特异性强、成本低等优点，但运用SYBR Green I实时荧光定量PCR技术检测MSTl基因表达变化还未见报道。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供用于检测MSTl基因的靶序列。本发明的第二个目的在于提供含有上述靶序列的重组质粒；本发明的第三个目的在于提供用于扩增上述靶序列的引物；本发明的第四个目的在于提供定量检测MSTl基因表达变化的方法及试剂盒。基于以上目的，本发明对NCBI数据库中的MSTl基因进行反复比对，筛选出MSTl基因高度保守的靶序列，其含有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。进一步，本发明提供用于特异性扩征上述靶序列的引物。本发明提供的优选的弓I物序列为上游引物GATGGCTCCTGAAGTTAIT，(SEQID NO. 2)下游引物CTGGCTTACGGAATGTGGG，(SEQID NO. 3)。本发明还提供了含有上述靶序列的重组质粒。该重组质粒的构建方法为以哺乳动物组织或细胞的c DNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增，反应条件为95°C热启动3min ;95°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸40s，35个循环后72°C延伸5min，反应结束后，以1%琼脂糖凝胶电泳验证扩增产物；回收PCR产物，将T载体与PCR产物进行连接，连接反应按照pEASY-Blunt试剂盒的说明书进行，后将连接产物转化至感受态细胞，进行氨苄青霉素及蓝白斑筛选，挑选白斑，37°C过夜培养10h-12h ;次日提取质粒，提取步骤按照试剂盒说明书进行。而后利用内切酶Hind III和Xba I进行酶切鉴定，最后对重组子T-MSTl测序；使用Vector NTI软件进行核苷酸序列分析，获得阳性重组质粒后测定质粒0D260和0D280值，并按照10D=50ii g/ml计算质粒质量浓度。本发明提供了上述重组质粒作为标准阳性参考物质用于哺乳动物MSTl基因的分子生物学检测的用途。所述分子生物学检测为PCR或荧光定量PCR检测。进一步，本发明提供检测MSTl基因的实时荧光定量PCR检测方法，包括从动物组织或细胞中提取总RNA，反转录获得cDNA，利用本发明提供的引物进行实时荧光定量PCR，同时设立无模板对照和阳性对照，根据扩增曲线判定结果。其中，所述的引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3所示。其中，所述的阳性对照为本发明提供的标准质粒即含有上述MSTl基因靶序列的重组质粒。所述的实时荧光定量PCR，其20 ii L总工作体系为
试剂体积叫终浓度
SYBR Green Supennix 10.0 I x 上游引物0.5 5yM
下游引物0.5 SjiM
cDNA 模板1.0
去离子水叫L。所述的实时荧光定量PCR，其反应程序为50°C UNG酶孵育2min，95°C变性30sec ；95°C变性5sec，55°C退火20sec，72°C延伸30sec，84°C数据采集ls，40个循环；72°C延伸IOmin0实时荧光定量PCR结束后，对扩增产物(75°C 95°C )进行溶解曲线分析。反应结束后，系统自动生成溶解曲线及标准曲线。
本发明提供了一种用于检测MSTl的试剂盒，其包括上述能特异地扩增出如SEQ IDNO.1所示核苷酸序列的特异性引物。本发明试剂盒的引物序列为上游引物GATGGCTCCTGAAGTTATT(SEQ ID NO. 2)，下游引物CTGGCTTACGGAATGTGGG(SEQ ID NO. 3)。本发明提供的试剂盒，还可进一步包括荧光定量反应液，阴性模板和阳性模板，所述阴性模板为双蒸水，所述阳性模板为标准质粒即含有上述MSTl基因靶序列的重组质粒。本发明的试剂盒，其20 ii L总工作体系为
试剂体积卩L终浓度
SYBR Green Supermix 10.0 I x 上游引物0.5 5
下游引物0.5 5
cDNA 模板1.0
去离子水。其工作程序为50°C UNG酶孵育2min，95°C变性30sec ;95°C变性5sec，55°C退火20sec，72°C延伸30sec，84°C数据采集ls，40个循环；72°C延伸lOmin。本发明还提供了含有上述引物和探针的诊断试剂。本研究采用SYBR Green I染料法进行实时荧光定量PCR，由于Ct值相对固定，重复性好，以不同浓度标准品质粒DNA分别进行荧光定量PCR扩增，发现起始浓度越高，Ct值越小，即起始模板浓度与Ct值之间呈良好的线性关系，因此，制定的标准曲线具有很闻的线性相关性、敏感性，使得实验结果更精确并具有很闻的可罪性。本研究中，目的基因MSTl为单一的溶点峰，表明实验中无引物二聚体和非特异性条带的扩增，产物纯度高，特异性好，通过10倍递减稀释标准品质粒浓度所得到的Ct值绘制标准曲线的相关系数高达0. 997，说明质粒各个梯度间相关性较好，标准曲线的可靠性强，能够保证数据的精确性。目前，在国内外尚未发现有针对MSTl基因mRNA进行荧光定量PCR检测方法的报道，同时在国内外也未发现有商品化的检测MSTl基因mRNA试剂盒出售。本发明根据实施
4、5、6、7实验结果发现，本发明方法检测灵敏度比普通PCR方法高100倍，最低限度可检测到目的基因的10个拷贝，且可实时定量扩增的模板量；利用该方法比普通PCR方法检测所用时间从原来的4小时缩减为2. 5小时,单一样本所耗成本缩减三分之一,一次可检测72个样品，如若大批量进行检测，不仅更加快速、费时少，同时极大地节约人力、物力和财力；以往普通PCR检测方法极易出现假阳性，如环境、操作等对样本的污染，检测人员很难加以区别，而运用本发明的方法，根据溶解曲线图(单一峰值)可很容易地加以分辨假阳性，且根据扩增曲线图和标准曲线图能够准确地定量模板中基因的表达变化，可用于统计学分析及后续样品的定量。
图1为PCR扩增MSTl基因纯化回收结果电泳图，其中M:5000DNA Marker ;1:MST1。
图2为Xba I和Hind III酶切鉴定结果电泳图，其中M:5000DNAMarker ；1-4, 6-10:Xba I和Hind III酶切鉴定的阳性克隆;5:Xba I和Hind III酶切鉴定的阴性克隆。图3为实时荧光定量熔解曲线图，其中6个模板稀释梯度的RT-qPCR溶解曲线均
为单一峰。图4为实时荧光定量动力学曲线图，其中6个模板稀释梯度的RT-qPCR扩增曲线间距相同，扩增曲线均呈指数上升，标准品质粒10倍递减稀释，每条曲线由左至右分别为Io6UO5UO4UO3UO2UO1 拷贝 / 反应。
图5为实时荧光定量标准曲线图，其中6个模板稀释梯度的RT-qPCR呈一次递减函数。
具体实施例方式以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例中使用的材料、试剂和仪器如下小鼠神经瘤细胞系N2a(ATC-CCCL-131TM)，购自中国科学院细胞生物所；RNA提取试剂盒购自北京艾德莱生物科技有限公司；ReVertAidFirstStrand cDNA Synthesis Kit 购自 Thermo 公司；iQ SYBR GreenSupermix 购自BIO-RAD 公司、Trans5 a 感受态细胞、pEASY-Blunt 克隆载体(T 载体)、2 X Taq PCR MasterMix、质粒小量提取试剂盒,均购自北京全式金生物技术有限公司；DNA marker、内切酶HindIII和Xba I均购自TaKaRa公司。实时荧光定量PCR仪，0PTIC0N2型，MJ Research公司。实施例1MSTl特异序列的确定本发明对NCBI上所有的MSTl基因核苷酸序列进行反复比对和筛选，发现MSTl基因(GenBank中登录号为AF271360.1)的序列中173bp长度的序列具有高度的保守性，可以用于检测MSTl基因在体内的表达变化。实施例2MST1特异性引物和探针的设计本发明经反复筛选和验证，利用引物设计软件Vector NTI，按照已经发表的鼠MSTl基因相应mRNA序列，分析并设计一对用于检测MSTl基因特异性保守序列的的荧光定量PCR引物，由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列为上游引物5’-GATGGCTCCTGAAGTTATT-3’(SEQ IDN0. 2)，下游引物5’-CTGGCTTACGGAATGTGGG-3’(SEQ IDN0. 3)。 实施例3MST1基因组DNA标准品质粒的构建l、N2a细胞的复苏与培养取出液氮罐中装有N2a细胞的冻存管，立即放入预热至37°C的水浴中并摇动，使管中细胞悬液快速融化，然后后低速800r/min离心5min，离心后弃去冻存液，取Iml完全DMEM培养基加至管中反复吹打，吸出吹打后的液体加至培养瓶中，重复冲洗吹打一次。用含20%胎牛血清的完全DMEM培养基5ml，37°C、5%C02、饱和湿度培养。12h待细胞贴壁后，更换新鲜培养液继续培养。2、N2a细胞总RNA的提取及反转录用0. P/oDEPC水处理所有实验用具(37°C，2h)，塑料器皿高压灭菌，其他用品180°C烘烤3h。于1. 5ml EP管总放入约IO5细胞，加入Iml Trizol用振荡器充分振荡混匀，使细胞充分裂解，冰浴5min ;加入200 ill氯仿，充分振荡振摇15s，静置3min ；4°C 12000r/min离心lOmin，吸取最上层透明液体400iU，移取至新的1. 5EP管中，加入等体积70%的乙醇，颠倒混匀，而后加入到RA吸附柱中；4°C离心12000r/min离心45s，弃去废液，加入500iil去蛋白RE, 12000r/min离心45s,弃去废液；加入500 U I漂洗液，离心12000r/min离心45s,弃废液后重复一次，将RA吸附柱13000r/min离心2min尽量去除漂洗液，最后加入无RNA酶的 DEPC 水 50 u I 溶解 RNA。参照 RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 说明书进行反转录，反转录反应总体系为20 ii 1，获得cDNA。3、普通PCR扩增 引物序列见实施例2 ；以cDNA为模板进行PCR扩增，模板0. 5 U 1，上、下游引物均为 1.5iil，2XTaq PCR Master Mix 10 yl，补水至 20 yl，反应条件为95°C 热启动 3min ;95°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸40s，35个循环后72°C延伸5min，反应结束后，以1%琼脂糖凝胶电泳验证扩增产物。产物经1%琼脂糖凝胶电泳，获得了预期目的基因产物特异性条带，且无引物二聚体，即成功扩增了 MSTl基因的173bp特异性条带，见图1，该特异性条带的序列如SEQ ID NO.1所示。4、重组质粒的制备及鉴定PCR产物回收按照童贻刚等人发明的方法进行胶回收，然后将pEASY-Blunt克隆载体(T载体)与PCR产物进行连接，连接反应按照pEASY-Blunt试剂盒的说明书进行。后将连接产物转化至Trans5 a感受态细胞，进行氨苄青霉素及蓝白斑筛选，挑选白斑，37°C过夜培养12h。次日，提取质粒，提取步骤按照试剂盒说明书进行；而后利用内切酶Hind
III和Xba I进行酶切鉴定。经酶切后，T-MSTl所含片段大小为283bp，剩余质粒片段为3819bp，见图2，与预测结果相同。最后对重组子T-MSTl测序；经测序，利用Vector NTI软件与GenBank中相应的基因序列(登录号为AF271360.1)进行比对，本发明所扩增的基因序列与GenBank中相应的MSTl基因序列完全一致。结果表明，成功构建了 MSTl基因的重组质粒。获得阳性重组质粒后测定质粒0D260和0D280值，并按照10D=50 u g/ml计算质粒质量浓度，经测得质粒浓度为107. 4ng/u I0实施例4检测MSTl的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法的建立以10倍递减稀释的标准品质粒(IO6拷贝/反应 IO1拷贝/反应)为模板，采用实施例2的引物，在实时荧光定量PCR仪上进行扩增。每个标准品设3个重复。RT-PCR总反应体系为20iU，包括IOu liQ SYBR Green Supermix、上游下游引物各0. 5 yl、IcDNA和8 u I双蒸水。荧光定量PCR反应条件为50°C UNG孵育2min ;95°C初始变性30s ;95°C变性5s，55°C退火20s，72°C延伸30s，84°C数据采集ls，40个循环；72°C最终延伸lOmin。然后对扩增产物(75°C 95°C )进行溶解曲线分析。反应结束后，系统自动生成溶解曲线(见图3)及标准曲线(见图4、图5)。图3的熔解曲线结果显示MSTl特异性条带为单峰，且峰值单一，说明产物特异。
由图4和图5可知，⑴总体看所有曲线拐点清楚，指数期明显，扩增曲线整体平行性好；(2)相邻浓度标准品扩增曲线与曲线之间的间距都十分接近理想值，说明扩增效率较高；(3)低浓度样本扩增曲线指数期明显，一方面不易出现假阴阳性误判，另一方面说明灵敏度高；(4)起始模板浓度与循环数(Ct值)之间呈良好的线性关系，扩增曲线的Ct值范围都大致在10 30范围内，保证了定量准确性。成功建立了 MSTl基因SYBR Green I实时荧光PCR定量标准曲线方程y=-0. 24x+8. 45，R2=O. 997。其线性范围可达6个数量级，Ct值和起始模板拷贝数的相关性均较好(R2=O. 997)，实验建立的克隆质粒标准品检测范围宽、灵敏度高，IO1数量级拷贝数的初始模板也可准确检测到，定量结果可靠。实施例5MST1荧光定量PCR检测方法的特性评价1、灵敏度评价
取质粒标准品1. OX IO1 1. OX 101°拷贝/ ill，共10个浓度梯度作为模板进行实时荧光PCR检测。当质粒标准品浓度为1. OX IO6 1. OX IO1拷贝/iil时，根据系统自动生成的动力学曲线观察，所有曲线均呈平滑的指数生长，且曲线间距为3. 32，说明质粒模板以10倍递减稀释；进一步分析模板1.0X101拷贝数即最低质粒模板拷贝数时，该曲线仍然与此前5个高拷贝模板质粒所得到的扩增曲线相一致，即该模板在1. OX IO1拷贝/yl时仍呈特异性扩增的指数生长期，由此表明通过该方法，在模板仅有1. OX IO1拷贝/Ul时，仍可通过该方法对细胞或组织表达的mRNA进行精确定量。在该PCR检测体系中，靶基因扩增反应的Ct值与模板浓度之间均存在良好的线性关系，相关系数为0. 997。图1和图2比较发现，本发明建立的实时荧光PCR检测体系对MSTl质粒标准品的检测灵敏度比普通PCR方法高100倍。2、特异性评价将本发明扩增的MSTl基因序列送上海生物工程技术有限公司测序，结果显示，与目的基因同源性为100%。同时，发明人将此序列在Genbank中进行比对，发现本序列与小鼠(GenBank 号AF271360.1),人(GenBank 号NM 006282. 2)，猕猴属(GenBank 号NM_001168677.1)，牛(GenBank 号NM_001015602.1)的覆盖率分别为 100%，100%，100% 和98%。按照实施例4的方法，用优化了的real-time PCR检测包括MSTl在内的哺乳动物相关激酶的其他蛋白酶，评价本发明的实时荧光PCR体系的特异性。用实施例3制得的MSTl基因组质粒标准品为阳性对照，结果除阳性对照扩展外，其他蛋白酶均出现溶解曲线，说明其余检测结果均为阴性。可见本发明的检测MSTl的实时荧光PCR方法的特异性为100%。实施例6检测动物细胞中的MSTl以本发明实施例3构建的标准质粒为阳性对照，以双蒸水为阴性对照，利用实施例4建立的荧光定量方法，用PrP多肽对N2a细胞样品进行攻毒，同时设立对照组细胞，24小时后用本发明荧光定量PCR方法进行检测，检测结果为攻毒组细胞和对照组细胞CT值分别为7. 76967和8. 28667，经计算后发现，用PrP多肽对N2a细胞样品进行攻毒，与未攻毒的对照组N2a细胞样品相比，MSTl的mRNA表达量提高了1. 43097倍。说明本发明的SYBRGreen I实时荧光定量PCR方法能够定量检测MSTl在体内的表达量变化。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详细的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做 的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1.用于检测MSTl基因的靶序列，其特征在于，其含有如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。
2.含有权利要求1所述靶序列的重组质粒。
3.权利要求2所述的重组质粒作为标准阳性参考物质用于哺乳动物MSTl基因的分子生物学检测的用途。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述分子生物学检测为PCR或荧光定量PCR 检测。
5.可特异性扩增MSTl基因的引物，其特征在于，具有如SEQIDNO. 2和SEQ ID NO. 3 PJf 示的核苷酸序列，所述的MSTl基因含有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
6.一种检测MSTl基因的方法，其特征在于，从动物组织或细胞中提取总RNA，反转录获得cDNA，利用权利要求5所述的引物进行实时荧光定量PCR，同时设立无模板对照和阳性对照，根据扩增曲线判定结果。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，其20μ L总工作体系为试剂体积μ 终浓度SYBR Green Supennix 10.0 I χ上游钥物0.5 5μΜ下游引物0.5 5μΜcDNA 模板1.0去离子水
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，其反应程序为50°CUNG酶孵育2min，95°C 变性30sec ;95°C变性5sec, 55°C退火20sec, 72°C延伸30sec，84°C数据采集Is, 40个循环； 72°C延伸 IOmin0
9.一种检测MSTl基因的试剂盒，其特征在于，含有权利要求5所述的引物。
10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，还包括荧光定量反应液、阴性模板、阳性模板，所述阴性模板为双蒸水，所述阳性模板为权利要求2所述的重组质粒。
全文摘要
本发明提供了用于MST1基因定量检测的标准质粒及试剂盒，还提供了检测MST1基因的引物，其具有如SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3所示的核苷酸序列。利用本发明的引物摸索出合适的实时荧光定量PCR反应体系与反应条件，实现对MST1基因的定量检测。本发明的检测方法及其试剂盒具有检测准确，灵敏度高、特异性强，简便快速的优点，能够很好地检测哺乳动物组织或细胞中MST1基因的表达量，为进一步研究MST1基因在哺乳动物系统中的调控作用提供有效工具。
文档编号C12N15/11GK103014032SQ20121049488
公开日2013年4月3日 申请日期2012年11月28日 优先权日2012年11月28日
发明者杨利峰, 赵德明, 潘博, 尹晓敏, 王进, 王继宏, 王运盛, 周向梅, 赵化粉 申请人:中国农业大学