特异于流感病毒h5亚型或者n1亚型的血凝素和神经氨酸酶的单克隆抗体及其应用的制作方法

专利名称：特异于流感病毒h5亚型或者n1亚型的血凝素和神经氨酸酶的单克隆抗体及其应用的制作方法
特异于流感病毒H5亚型或者NI亚型的血凝素和神经氨酸酶的单克隆抗体及其应用
本申请为申请日为2008年9月12日、申请号为200880115546.4、发明名称为“特异于流感病毒H5亚型或者NI亚型的血凝素和神经氨酸酶的单克隆抗体及其应用”的发明专利申请的分案申请。发明领域
本发明涉及检测和治疗禽流感病毒(“AIV”)的抗体和相关的结合蛋白。更具体地，本发明涉及可用于检测和治疗AIV的高致病性H5和NI亚型的单克隆抗体及相关的结合蛋白，以及涉及诊断、监视和治疗动物和人体内AIV感染的方法和产品。
发明背景
H5N1禽流感病毒也许成为下一次流感流行的原因。每年甲型流感感染的爆发是持续的公共健康威胁，新的流感毒株可以周期性呈现，人对于其具有较低的免疫性，导致破坏性流行。1918年由HlNl流感病毒引起的“西班牙流感”爆发导致世界范围内超过4千万人死亡。HlNl的来源也许是从鸟类直接传染人，或者也许潜伏于中间宿主如猪或者仍未鉴别的另一动物宿主中(I)(在本文结尾处提供参考书目)。分别由H2N2和H3N2流感病毒引起的1957年和1968年流感流行,可能源自重配事件(reassortment),其中一或两种适应人的病毒表面蛋白由禽流感毒株的蛋白质置换(2)。
H5N1病毒具有感染史无前例范围的宿主的能力，包括食肉动物。1997年证实第一例感染的人。高致病性H5N1感染在禽类和人类中均发生。这是已发现的首次禽流感病毒从鸟类直接传播至人类。之后，根据世界卫生组织(WHO)报告，人H5N1感染病例总数从2003年在东南亚开始爆发至今已经有281例，死亡169例。印度尼西亚在2005年6月报道其首例人H5N1病毒所致禽流感病例。迄今为止，这是唯一一个给出2007年报道的国家，截至2007年3月共81例证实的人感染病例，其中63例死亡。
流感病毒根据其核蛋白和基质蛋白抗原特异性分类。这些病毒主要被分为A、B和C血清型，A型具有8个RNA节段，其编码十个病毒蛋白。所有已知的A型流感病毒均源自鸟类。这个类别的病毒可以感染其它物种，如马、猪、猫头鹰和海豹，并且对人类造成威胁(23)。根据包膜糖蛋白的抗原性性质，可以将A型流感病毒进一步分为亚型，根据血凝素(“HA”)分为Hl至H16亚型，根据神经氨酸酶(“NA”)分为NI至N9亚型(24，25，26)。据信在HA1-HA2连接处的HA蛋白质的蛋白酶解与禽流感毒株的病原性相关，而且在这个裂解位点周围疏水性氨基酸的存在是H5亚型的特点。此外，据信HA蛋白质介导与宿主细胞sialoside受体附着，随后通过膜融合进入细胞(27), HA蛋白质被认为作为中和抗体的主要靶位(26)。
在急性呼吸系统疾病爆发期间进行检测可以确定流感是否是爆发原因。在流感季节，检测呈现与流感一致的呼吸系统疾病的选择患者可帮助确定流感是否存在于特定患者群中，并且帮助卫生保健人员确定怎样使用其临床判断诊断和治疗呼吸系统疾病。快速流感检测帮助确定是否使用抗病毒药物。 一些检测如病毒培养、逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)以及血清学检测是常规方法，但是不能及时获得结果而为临床医生提供帮助(3)。目前常用的大多数快速诊断检测是基于单克隆抗体的免疫测定(3，4，5)。免疫荧光测定(荧光抗体染色)是另一种快速流感病毒诊断检测法，其可用于许多医院实验室中，且通常可以在2-4小时内产生结果。首要的是特异性单克隆抗体产生是大多数常用的快速、灵敏性和有成本效益的诊断方法的基础。
区域性独特的亚系的鉴别表明H5N1病毒是地理学广泛分布的，具有遗传和抗原性差异。种系发生学研究示出来自印尼的所有病毒形成H5N1基因型Z病毒的一个独特亚系，提示这种爆发可能由于单一引入传播遍及整个国家造成的(14，15)。获得特异性识别印尼流感分离株的单克隆抗体是非常有益的。获得也覆盖越南和新加坡流感分离株的这种mAb也是非常有益的。
发明目的
本发明的目的是提供特异性结合AIV的H5和NI亚型的、特别是结合H5和NIIndonesia AIV分离株的单克隆抗体(mAb)及相关的结合蛋白。单克隆抗体应答的特异性为有效诊断试剂提供基础。衍生自其中的mAb和结合蛋白也可以用作治疗剂。
发明概述
根据本发明，提供了特异于H5亚型血凝素糖蛋白的线性和构象表位或者NI亚型神经氨酸酶糖蛋白的线性和构象表位的单克隆抗体及相关的结合蛋白。线性H5表位的mAb能以良好的特异性和灵敏性检测变性的样品如福尔马林固定的组织样品中的H5N1及其它H5亚型病毒毒株，而靶向H5或者NI构象表位的那些mAb用于检测未进行预处理的组织如冷冻组织样品及其它生物学组织和体液中的H5N1及其它NI亚型病毒。H5表位的mAb和NI表位的mAb可以组合使用，以特异性诊断H5N1病毒分离株。
具体地，称作5A5的mAb靶向H5亚型血凝素的线性表位。称作5C5、2D9、4F8、1C1、3B6、2F11、9C1和3H11的其它mAb靶向H5亚型血凝素的构象表位。称作8H12的mAb靶向NI亚型神经氨酸酶的线性表位，称作6C6和3D4的两个抗体靶向NI亚型神经氨酸酶的构象表位。因此,本发明包含基本上具有如mAb 5A5对于线性H5亚型血凝素表位的免疫学结合特性的结合蛋白，以及基本上具有如mAb 8H12对于线性NI亚型神经氨酸酶表位的免疫学结合特性。本发明进一步包含基本上具有如mAb 5C5、2D9、4F8、1C1、3B6、2F11、9C1和3H11对于H5亚型血凝素构象表位的免疫学结合特性的结合蛋白。本发明还包含基本上具有如mAb 6C6或3D4对于NI亚型神经氨酸酶构象表位的免疫学结合特性的结合蛋白。
另一方面，本发明包含检测样品中H5亚型AIV的方法，包括检测AIV与基本上具有mAb 5A5、5C5、2D9、4F8、1C1、3B6、2F11、9C1或者3H11的免疫学结合特性的mAb或者结合蛋白的结合。本发明还包含检测样品中NI亚型AIV的方法，包括检测AIV与基本上具有mAb6C6、3D4或者8H12的免疫学结合特性的mAb或者结合蛋白的结合。具体地，本发明涉及利用这种结合蛋白的免疫荧光测定、免疫组织化学测定以及ELISA方法。识别H5亚型AIV的抗体可以与识别NI亚型AIV的抗体组合使用，以检测H5N1病毒。
另一方面，本发明涉及检测AIV的试剂盒，其包含基本上具有mAb5A5、5C5、2D9、4F8、1C1、3B6、2F11、9C1、3H11、8H12、3D4和/或6C6的免疫学结合特性的结合蛋白。
本发明进一步涉及治疗感染H5 AIV毒株如H5N1 AIV毒株的对象的方法，包括给予这种对象有效量的一或多种基本上具有mAb 5C5、2D9、4F8、2F11、9C1、3H11、 3D4或者6C6的免疫学结合特性的单克隆抗体或者结合蛋白。
附图简述


图1A-1D示出感染AIV H5N1的MDCK细胞与无病毒感染的MDCK细胞的IFA图像对比。图1A是在MDCK细胞中检测到H5N1的图像。在图1B中，紫外光与正常光的合并示出由病毒感染的各个细胞与未感染细胞的对比。如图1C所示，在无病毒感染的MDCK细胞上无荧光信号。图1D示出在与图1C相同的细胞上紫外光与正常光的合并。
图2A和2B示出MDCK细胞上流感病毒的单克隆抗体中和活性。在图2A中，在单克隆抗体中和H5N1病毒感染后用FITC荧光染色MDCK细胞。在图2B中，用FITC荧光染色MDCK细胞而无H5N1病毒感染的单克隆抗体中和。
图3A和3B示出SDS-PAGE和蛋白印迹，用以鉴别mAb与线性化重组HAl之间的结合。在图3A中，在SDS-PAGE凝胶中，HAl为大约37kD，表达的GST-标记的HAl为大约61kD。单独GST为26kD。在图3B中，蛋白印迹示出重组HAl与mAB 5A5反应。除了在61kD的主要条带之外还存在较小的条带，提示当GST-HAl在大肠杆菌中表达时的降解。泳道I,无IPTG-诱导表达的大肠杆菌样品；泳道2和3，大肠杆菌中IPTG-诱导的GST-HAl表达；泳道4，纯化的GST样品。
图4A和4B例证了 mAb 5A5的线性表位作图。图4A是血凝素蛋白HAl的示意图，示出表达不同长度HAl片段的克隆构建体以及其与mAb5A5的反应性。图4B是突变的血凝素HAl片段的示意图，示出表达HAl片段上不同突变的克隆构建体以及其与mAb 5A5的反应性。
图5A和5B示出mAb 6C6或3D4与表达的重组NI之间的典型反应。图5A示出在Sf9细胞中检测的表达的重组NI。在图5B中，紫外光与正常光的合并示出各个细胞。
图6A和6B示出SDS-PAGE和蛋白印迹以验证表达的NA。
图7A、7B和7C示出MDCK细胞上流感病毒的单克隆抗体中和活性。在图7A中，在单克隆抗体中和H5N1病毒感染之后通过显微镜观测MDCK细胞。在图7B中，在作为CPE阳性对照的未经单克隆抗体中和H5N1病毒感染的条件下，通过显微镜观测MDCK细胞。在图7C中，在作为CPE阴性对照的不存在病毒和mAb的条件下示出MDCK细胞。
发明详述
本发明涉及特异性结合AIV H5亚型血凝素糖蛋白或者AIV NI亚型神经氨酸酶糖蛋白的mAb及相关的抗原结合蛋白。具体地，所述mAb或者相关的抗原结合蛋白具有如下抗体的免疫学结合特性:mAb 5A5，由在2007年7月10日在美国典型培养物保藏中心(ATCC)保藏的保藏号为PTA-8528的杂交瘤5A5产生，mAb 5C5，由在2007年7月10日在ATCC中保藏的保藏号为PTA-8529的杂交瘤5C5产生，mAb 6C6，由在2007年7月10日在ATCC中保藏的保藏号为PTA-8526的杂交瘤6C6产生，mAb 2D9，由在2008年7月29日在ATCC中保藏的保藏号为PTA-9396的杂交瘤2D9产生，mAb 4F8，由在2008年7月29日在ATCC中保藏的保藏号为PTA-9397的杂交瘤4F8产生，mAb ICl，由在2008年7月29日在ATCC中保藏的保藏号为PTA-9398的杂交瘤ICl产生，mAb 3B6,由在2008年7月29日在ATCC中保藏的保藏号为PTA-9399的杂交瘤3B6产生，mAb 3D4，由在2008年7月29日在ATCC中保藏的保藏号为PTA-9395的杂交瘤3D4产生，mAb8H12,由在2008年7月29日在ATCC中保藏的保藏号为PTA-9394的杂交瘤8H12产生， mAb 2F11，由在2008年7月16日在ATCC中保藏的保藏号为PTA-9373的杂交瘤2F11产生，mAb 9C1，由在2008年7月16日在ATCC中保藏的保藏号为PTA-9372的杂交瘤9C1产生，或mAb 3H11，由在2008年7月16日在ATCC中保藏的保藏号为PTA-9374的杂交瘤3H11产生。所有保藏物均根据布达佩斯条约的规定而进行。本发明进一步包含这些杂交瘤，且提供了本发明的mAb和结合蛋白的持续来源。
本发明进一步涉及检测和诊断H5亚型AIV感染的方法以及包含本发明mAb或者结合蛋白的试剂盒。本发明进一步涉及通过给予有效量的本发明的一或多种抗体或者相关的结合蛋白治疗H5或者NI AIV毒株感染对象的方法。具体地，在这个实施方案中，所述对象感染H5N1亚型AIV印尼分离株。本发明的抗体也可以作为预防措施给予处于可能发生流感流行事件中的对象。在这种情况中，给予抗体的有效量是用于治疗H5或者NI AIV感染的量的大约一半。
在本文中使用的各个术语具有如下含义。
所有语法形式的术语mAb或者相关的结合蛋白的“免疫学结合特性”是指所述mAb或者结合蛋白对其抗原的特异性、亲和性和交叉反应性。
术语“线性表位”是指形成抗体结合位点的具有大约4-12个氨基酸的连续序列。本发明mAb的线性表位优选在由HAl病毒基因编码的血凝素蛋白的大约第260至大约第269位氨基酸的区域中。结合mAb或者结合蛋白形式的线性表位可以是变性蛋白质，其基本上没有三级结构。
术语构象表位是指在H5亚型血凝素糖蛋白或者NI亚型神经氨酸酶糖蛋白中以其天然三维形式存在的mAb或者相关的结合蛋白的结合位点。
术语结合蛋白是指包括如下所述那些的蛋白质，所述蛋白质包括本发明mAb的抗原结合位点或者具有本发明mAb的免疫学结合特性的mAb的抗原结合位点。
本发明有利地提供了通过用AIV亚型H5N2 (A/chicken/Singapore/98)免疫动物制备具有mAb 5A5的结合特性的单克隆抗体、通过用AIV亚型H5N2 (A/chicken/Singapore/98)免疫动物制备具有mAb 5C5的结合特性的单克隆抗体、或者通过用AIV亚型H7N1 (A/chicken/Singapore/94)免疫动物制备具有mAb 6C6的结合特性的单克隆抗体的方法。本发明进一步有利地提供了通过用AIV亚型H5N2 (A/chicken/Singapore/98)免疫动物制备具有mAb2D9和mAb 3B6的结合特性的单克隆抗体的方法。本发明还提供了通过用亲代禽流感病毒A/Vietnam/1203/2004/H5Nl在第205位氨基酸具有由赖氨酸突变为甲硫氨酸的逃逸突变株免疫动物制备具有mAb 2F11或者9C1的结合特性的单克隆抗体的方法,或者通过用AIV亚型A/Indonesia/CDC669/2206/H5N1免疫动物制备具有mAb 3H11的结合特性的单克隆抗体的方法。本发明另外提供了通过用AIV亚型H7N1 (A/chicken/Singapore/94)免疫动物制备具有mAb 3D4和mAb 8H12的结合特性的单克隆抗体的方法，以及通过用AIV亚型H5N2 (A/chicken/Singapore/98)免疫动物制备mAb 4F8和ICl的方法。任何这种抗原均可用作免疫原以产生具有希望的免疫学结合特性的抗体。这种抗体包括但不限于包含 mAb 5A5、5C5、2D9、4F8、1C1、3B6、2F11、9C1、3H11、8H12、6C6 或者 3D4 的抗原结合序列的单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fab片段和蛋白质。
本发明的mAb可以通过持续培养细胞系产生抗体分子的任何技术产生。这种方法包括但不限于最初由Kohler and Milstein (Nature 256:495-497)在1975年揭示的杂交瘤技术，以及三源杂交瘤技术、 人B-细胞杂交瘤技术(Kozbor et al., 1983, ImmunologyToday 4:72)以及EBV-杂交瘤技术以产生人单克隆抗体(Cole et al., MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy Alan R.Liss, Inc.，pp77_96 (1985))。可以使用人抗体且其可以通过使用人杂交瘤获得(Cote et al.，1983，Proc.Nat’ 1.Acad.Sc1.U.S.A.，80:2026-2030)或者通过用EBV病毒在体外转化人B细胞获得(Cole etal., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R.Liss, pp.77-96)。此夕卜，可以使用产生“嵌合抗体”或者“人源化抗体”的技术(Morrison et al.，1984，J.Bacteriol.159-870;Neuberger et al., 1984,Nature 312:604-608;Takeda etal.，1985，Nature314:452-454)，通过导入来自本发明小鼠抗体分子如mAb 5C5、5A5、6C6、2D9、4F8、1C1、3B6、3D4、8H12、2F11、9C1或者3H11的序列与来自具有合适生物学活性的人抗体分子的基因产生所述抗体。嵌合抗体是含有人Fe部分和小鼠(或者其它非人动物)Fv部分的那些抗体。人源化抗体是在人抗体中掺入小鼠(或者其它非人动物)互补决定簇(CDR)的那些抗体。嵌合抗体和人源化抗体均是单克隆抗体。优选这种人或者人源化嵌合抗体用于人类疾病的体内诊断或者治疗中。
根据本发明，可以对产生单链抗体的技术(美国专利4，946，778)加以调整，以提供本发明的单链抗体。本发明的另一实施方案利用构建Fab表达文库的技术(Huse etal.，1989，Science 246:1275-1281)，以快速及简便地鉴别对于本发明的抗体具有希望的特异性的单克隆Fab片段或者其衍生物或者类似物。
含有抗体分子独特型的抗体片段可以通过已知技术产生。例如，这种片段包括但不限于:F(ab’ )2片段，其可以通过胃蛋白酶消化抗体分子而产生；Fab’片段，其可以通过还原F (ab’)2片段的二硫键而产生；以及Fab片段，其可以通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子而产生。这种抗体片段可以从本发明的任何多克隆或者单克隆抗体中产生。
在抗体的产生中，可以通过本领域已知技术筛选希望的抗体，所述技术例如放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“夹心”免疫测定、免疫放射测定、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散测定、原位免疫测定(例如使用胶体金、酶或者放射性同位素标记)、蛋白印迹、沉淀反应、凝集试验(例如凝胶凝集试验、凝血试验)、免疫荧光测定以及免疫电泳测定。在一个实施方案中，通过检测一抗上的标记检测抗体结合。在另一个实施方案中，通过检测二抗或者其它试剂与一抗的结合检测一抗。在再一个实施方案中，二抗是标记的。本领域已知在免疫测定中检测结合的方式，且包含在本发明范围内。
前述抗体可用于本领域已知关于检测或者定位H5或者NI亚型AIV的方法中，例如蛋白印迹、ELISA、放射性免疫测定、免疫荧光测定、免疫组织化学测定等。本文揭示的技术可用于定性和定量确定H5亚型AIV，以及用于诊断和监视病毒感染的动物或者人。
本发明还包括定性和/或定量确定H5亚型AIV的测定和检测试剂盒。这种测定系统和检测试剂盒可包含标记的成分，所述标记的成分例如通过用放射性原子、荧光基团或者酶标记、与本发明的mAb或者相关的结合蛋白或者其结合配体结合而制备。这种测定或者检测试剂盒进一步可包含试剂、稀释剂和使用说明书，这些为免疫测定技术领域技术人员熟知。
在本发明的某些实施方案中，根据选择的方法如“竞争性”、“夹心”、“DASP”等方法，这种试剂盒至少含有本发明的mAb或者相关的结合蛋白、检测所述mAb或者相关的结合蛋白与生物学样品中的AIV免疫特异性结合的工具， 以及使用说明书。所述试剂盒也可以含有阳性和阴性对照物。它们可以被设计为与自动分析仪或者自动免疫组织化学玻片染色设备一起使用。
本发明的测定试剂盒可进一步包含可以被标记或者可以被提供用于附着于固体支持物(或者附着于固体支持物)的二抗或者结合蛋白。这种抗体或者结合蛋白可例如是结合AIV的抗体或结合蛋白。这种二抗或者结合蛋白可以是多克隆或者单克隆抗体。
H5亚型血凝素或者NI亚型神经氨酸酶蛋白的单克隆抗体可以通过用AIV或者其H5或NI蛋白或片段免疫动物而制备。制备H5亚型血凝素蛋白的抗体的优选方法是扩增H5亚型HAl基因，随后表达该基因，回收并纯化H5亚型重组蛋白以及将该纯化的蛋白质用作免疫原。例如,通过用可获得的毒株接种鸡胚以增殖H5N1 AIV，随后分离该病毒RNA。通过逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)扩增HAl基因，然后将其克隆进杆状病毒载体中，用于在昆虫细胞中表达H5蛋白质。然后可将如此产生的蛋白质用于免疫小鼠或者其它合适物种，以产生杂交瘤。相似的程序可用于获得NI蛋白质以产生杂交瘤。
筛选杂交瘤产生能特异性结合H5或NI蛋白质的高亲和性mAb的能力，并将其与其它AIV亚型区分。根据本发明，发现具有病毒中和能力的抗体能识别H5亚型血凝素蛋白中的构象表位。这个发现得自在Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞或者鸡胚中1_2次选择循环之后在存在每种中和mAb的条件下病毒逃逸突变株的产生。通过RT-PCR从这些中和逃逸突变株中克隆所述HAl基因并测序，以鉴别点突变。在这组抗体中，在mAb 5C5、2F11、9C1和3H11中发现中和表位。使用凝血抑制试验证实中和逃逸能力。
HAl含有338个氨基酸，包括具有16个氨基酸的信号肽。为了研究线性表位在蛋白质上的分布，有利地检测截短的和突变的片段与mAb的结合，例如通过蛋白印迹或者相似技术检测。可以鉴别线性表位，其是mAb的结合靶位，在使用免疫组织化学染色方法检测如在福尔马林固定的组织中存在的变性的H5亚型蛋白中具有良好性能。以这种方式对H5亚型mAb作图提供了进一步研究和更有效地临床诊断感染性H5N1 AIV的平台。
本发明还提供了对于AIV H5血凝素和NI神经氨酸酶分子的抗原性结构的更好的了解。本发明的mAb及相关的结合蛋白提供了在冷冻切片和生物学样品中检测这种高致病性病毒的方式和方法。
检测石蜡切片中的病毒的能力具有重要意义。在大多数情况中，感染的组织切片中的AIV抗原由于固定过程而被破坏。福尔马林和乙醇具有除去脂质包膜和包膜糖蛋白包括血凝素的潜力，因此增加了病毒抗原检测的难度。因此，本发明这种形式的诊断具有提供更安全和更精确诊断AIV感染的动物和人体组织的潜力。
如在下文实施例中例证，mAb 5A5对于福尔马林固定的组织中的病毒抗原是是高效且灵敏的。这种抗体使得感染区域易于在光学显微镜下被观测到。抗体5A5不具有血凝素抑制作用或者病毒中和活性；然而其在免疫荧光测定和蛋白印迹分析中呈现出阳性结果，观测到相应于重组H5N1-HA蛋白(MW 36kDa)的强条带。
MAb 8H12对于福尔马林固定的组织中的病毒抗原也是高效和灵敏的。这个抗体也使得感染区域易于在光学显微镜下被观测到。
相反，mAb5C5、2D9、4F8、1C1、3B6、6C6、3D4、2F11、9C1 和 3H11 对于冷冻组织切片是高效的，但是在福尔马林固定的组织中未检测到抗原。这些结果提示着两组mAb与不同的病毒表位反应。通过表位作图， 确定mAb 5A5和8H12靶向线性表位。仅当对组织进行强力热处理时，它们可以检测病毒抗原。在这种严苛的抗原提取方法中，病毒的表面蛋白被破坏，使得病毒的核蛋白被暴露。因此，靶向线性表位的mAb对于冷冻组织切片不起作用。
确定单克隆抗体5C5、2D9、4F8、1C1、3B6、6C6、3D4、2F11、9C1 和 3H11 靶向 H5N1 病毒的构象表位。表位作图用于对mAb 5C5、2D9、4F8、2F11、9C1和3H11作出这种确定J^mAb6C6和3D4的确定是基于所述抗体不能识别来自SDS-PAGE的变性的神经氨酸酶。这些抗体能结合且识别病毒抗原，而不用对组织切片进行预先处理。
本发明提供了检测AIV的H5和NI亚型的便利的高特异性且灵敏的方式和方法。一种这样的方式和方法是ELISA。在优选的实施方案中，mAb5A5、5C5、2D9、4F8、lCl、3B6、2F11、9C1和3H11单独或者组合地用作捕获抗体。已经发现mAb 5A5与5C5的组合与单独使用抗体或者本文所述其它组合相比在检测H5亚型AIV中提供高光密度读数。不受理论的约束，对于这些结果的一种可能的解释是这两种抗体与HAl蛋白上的不同表位反应且是不同的抗体亚类，因此提供多个结合位点。
如果单独使用抗体，可以使用选择的抗体例如作为捕获抗体，且与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的相同抗体可用作检测抗体。6C6、3D4和8H12抗体可相似地用作捕获抗体以检测AIV的NI亚型毒株。
构象表位的单克隆抗体保持重要的生物学功能，如凝血抑制作用和中和活性，而针对线性表位的mAb也有利于诊断应用。因此，使用分别针对线性和构象表位的mAb 5A5以及mAb 5C5、2D9、4F8、1C1、3B6、2F11、9C1和3H11，可以明显提高ELISA方法的灵敏性。相似地，使用分别针对NI神经氨酸酶的线性和构象表位的mAb 8H12以及mAb 6C6和3D4，可以明显提高ELISA方法的灵敏性。使用两种mAb的方法也可以用于开发检测H5和NI病毒的其它免疫学方法，例如通过点-印迹(dot-blot)和原位杂交方法。
本发明的优选ELISA测试在印尼H5N1 AIV感染的禽类和人体中能检测出HA抗原，表明本发明在检测禽和人H5N1感染中的用途。
本发明的H5亚型和NI亚型mAb具有优于目前作为诊断工具的其它方法的优势。首先，mAb 5A5、5C5、2D9、4F8、1C1、3B6、2F11、9C1 和 3H11 对于高感染性 H5 亚型 AIV 具有高特异性，且除了 9C1 mAb之外所有mAb均示出识别所有或者几乎所有已知的H5N1印尼株。此外，mAb6C6、3D4和8H12对于NI亚型AIV是高特异性的，且可以用于诊断NI亚型病毒感染，包括所有或者几乎所有已知的H5N1印尼株。这种高特异性单克隆抗体代表禽流感诊断领域的突破。在本发明之前，未报到有单克隆抗体可以检测所有或者几乎所有印尼H5N1病毒。而除了一种抗体之外，本发明的所有单克隆抗体均示出识别在最近两年内在印尼收集的所有或者基本所有H5N1病毒。MAb 6C6、3D4或者8H12可以与mAb 5A5、5C5、2D9、4F8、1C1、3B6、2F11或者3H11组合使用(一起或相继使用)，以确认一特定的分离株是H5N1分离株。此外，所述mAb在感染的福尔马林固定组织以及血清学检测如HI和IFA中检测及精确定位H5病毒抗原的能力呈现出独特优势。再者，这些mAb提供了检测H5和NI AIV感染的安全且便利的诊断方法。冷冻的切片玻片可以低温长期贮存，且便于感染的进一步诊断和监视。本发明的抗体因此可用于诊断H5N1感染。如下文论述，本发明的mAb也可用于治疗H5N1感染。因此，本发明的mAb在遏制潜在流感流行中是非常有效的工具。
本发明的另一实施方案涉及H5禽流感的中和逃逸突变株。术语中和逃逸突变株是指由在编码血凝素的基因中的点突变产生的突变病毒，所述点突变导致H5或者NI病毒中抗原漂移，且影响中和表位。中和逃逸突变株可以逃避在中和其亲代病毒中有效的某些单克隆抗体的中和作用。在逃逸突变株的人工筛选中，将亲代病毒与某一中和抗体一起保温并接种于宿主如MDCK细胞或者鸡胚中。在2-3次筛选循环之后，克隆所述中和mAb的逃逸突变株，并对其进行HAl基因测序。突变的氨基酸通过与亲代病毒序列对比而确定，且突变的位点精确示出包含由所述中和mAb识别的中和表位的氨基酸之一。在本发明中，通过5C5中和单克隆抗体从A/Indonesia/⑶C669/H5N1 AIV中产生5C5逃逸突变株。所述突变位点列于下文实施例3和表4中。通过2F11中和单克隆抗体从A/Vietnam/1203/2004/H5N1中产生2F11逃逸突变株。通过9C1中和单克隆抗体从A/Vietnam/1203/2004/H5Nl的K189M突变株中产生9C1逃逸突变株。此外，3H11、2F9和9C I逃逸突变株从A/Indonesia/⑶C669/2006/H5N1中产生。所述突变位点在下文实施例3和表4中列出。
中和逃逸突变株与其亲代病毒不同，其不再可以由特异性结合亲代病毒的某些中和抗体识别。鉴于此，根据上述教导，这些突变株可用于免疫小鼠以产生新的单克隆抗体。在新的mAb中，可以筛选出精确识别突变表位的单克隆抗体，并将其用于提供对于不同于亲代病毒的禽流感病毒的互补监视。通过重复这种方法通过几个世代，可以发现进一步的逃逸突变株，以及获得进一步的中和抗。这些抗体可用于本发明的方法中。
在本发明的另一个实施方案中，可以给予本发明的抗体和相关的结合蛋白以治疗受累于H5 AIV感染的对象，特别是AIV的H5N1亚型感染对象。本发明的抗体和相关的结合蛋白在流感流行或者潜在流行的情况中也可以作为预防措施给予对象。所述抗体及相关的结合蛋白可以以单一剂量或者重复给予，任选以缓释形式给予。可以通过使所述抗体到达治疗对象体内其作用部位的任何方式给予，例如通过静脉内、肌内、皮内、口服或者经鼻给予。典型地，所述抗体在药物可接受的稀释剂或者载体如无菌水溶液中给予，且所述组合物可进一步包含一或多种稳定剂、佐剂、增溶剂、缓冲液等。在治疗时根据治疗对象的个体需要以及考虑到如对象的年龄、体重、一般状况及其症状的性质和程度以及给予的治疗频率等因素，确定精确的给予方法、成分和特定剂量。一般地，当给予所述抗体治疗受累于H5AIV感染的患者时,所述抗体的给予剂量在大约0.lmg/kg至大约lmg/kg体重范围内。典型地，当作为预防措施给予时，给予剂量降低大约一半，即在大约0.05mg/kg至大约0.5mg/kg体重范围内。
为了进行治疗，可以给予本发明的单一中和抗体或者结合蛋白，或者可以给予两或多种抗体的组合。如果已经产生中和逃逸突变株的一或多个世代的抗体，上述本发明的这些抗体可以作为治疗性抗体混合物给予。优选用作治疗剂的抗体包括5C5、2D9、2F11、9CU3H11 和 4F8mAb。
提供了如下实施例以例证本发明的优选实施模式。本发明不限于所述实施例，而是与所附权利要求书的整个范围一致。
实施例1:杂交瘤的产生
除了 H5N1/PR8之外，所有活的野生型H5N1流感病毒均得自印尼。H5N1/PR8得自美国疾病控制中心。其是非病原性重组病毒，含有在越南感染人的AIV H5N1病毒的HA和NA 基因(A/Vietnam/1203/2004)。 H5N2(A/chicken/Singapore/98)和 H7N1(A/chicken/Singapore/94)得自新加坡农粮兽医局(AVA)。这些病毒原种用于感染9天和11天龄的含胚鸡卵(Chew’ s Poultry Farm,新加坡)， 并使其复制两个世代。然后,吸取尿囊液并使用凝血试验(HA)确定病毒效价。失活的H5N1 (A/goose/Guangdong/97)用于RNA提取，以通过 RT-PCR 扩增 HAl 基因。将 Madin Darby 肾细胞(MDCK, ATCC CCL34)在具有 10%FBS 的DMEM培养基中在37°C在具有5%C02条件下生长。
通过对含有病毒的尿囊液在10，OOOrpm离心30分钟除去碎片，随后在40，OOOrpm对上清超离心3小时，从而对病毒进行纯化。将病毒沉淀悬浮于PBS中。
使用蛋白质A 亲和性层析柱(Sigma Aldrich; St.Louis, MO, USA)和itnmiinopure IgM 纯化试剂盒(Pierce Biotechnology; Rockford, IL, USA),根据厂商指导从澄清液中纯化单克隆抗体。使用ND-1000分光光度计(NanoDropTechnologies; Wilmington, DE, USA)测量抗体浓度。
使用体积为0.2ml的失活的禽流感病毒H5N2 (A/chicken/Singapore/98)或者H7N1 (A/chicken/Singapore/94)以及油性佐剂Montanide ISA563 (Seppic,法国)对BALB/c小鼠进行免疫接种。在第0、14、28和42天通过腹膜内注射给予。收集来自经免疫的小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞(SP2/0)，并且如De St.Groth and Scheidigger所述融合产生杂交瘤(16)。在用次黄嘌呤-氨喋呤-胸苷(HAT)培养基选择之后，通过免疫荧光测定(IFA)检测在14天后示出明显生长的杂交瘤的培养基中抗H5N1/PR8-感染的MDCK细胞的特异性抗体的存在情况。通过限制性稀释克隆选择的杂交瘤，再次鉴别，第二次克隆，以及通过IFA再次检测。一旦确定，则将该杂交瘤在组织培养中增殖，并且在液氮中冷冻以进一步使用。
从中获得本发明的每种特异性单克隆抗体的杂交瘤是根据这些一般程序制成的。
实施例2:通过IFA筛选mAb
使用免疫荧光测定检测抗体与抗原靶之间的相互作用。将已经过夜感染流感病毒(H5N2 (A/chicken/Singapore/98)或者 H7N1 (A/chicken/Singapore/94)的 MDCK 细胞在 96孔平板中用PBS-T (在PBS中0.05%Tween-20，pH 7.4)漂洗。通过将细胞在预冷的100%乙醇中保温10分钟进行固定。将该细胞在PBS-T中洗涤3次，然后在1%BSA、PBS-T中保温30分钟以阻断与抗体的非特异性结合。然后将其与100 μ L杂交瘤培养液在96孔平板中在室温保温2小时或者在4°C保温过夜。将细胞用PBS-T洗涤并与1:100稀释度的二抗-荧光标记的山羊/兔抗小鼠抗体(DakoCytomation, USA)-在1%BSA、PBS-T中在室温保温60分钟。将该平板孔用PBS-T洗涤。弃去PBS-T并加入在PBS中的50%甘油。在显微镜下用紫外光检测突光信号。
未感染的MDCK细胞用作阴性对照。来自用失活的H5N1病毒免疫接种的小鼠的血清用作阳性抗体对照。通过将与各个杂交瘤上清保温的MDCK细胞与对照组进行对比，选择产生阳性染色的杂交瘤上清，用于通过限制稀释进行克隆。通过这种方法获得稳定产生mAb的杂交瘤。
发现称作mAb 5A5、5C5、2D9、4F8、1C1、2F11和3B6的抗体结合来自印尼所有25个分离株的H5N1血凝素，以及结合H5N1/PR8和H5N2。MAb 3H11结合来自几乎所有25个印尼分离株的血凝素，但是不结合H5N1/PR8和H5N2。发现mAb 6C6、3D4和8H12结合来自所有印尼H5N1分离株的神经氨酸酶，以及H5N1/PR8和H7N1。mAb 9C1已经示出结合特异性H5N1印尼株，因为这个抗体从特定毒株的逃逸突变株中产生，其特异性结合在H5的第205位氨基酸是非赖氨酸的AIV毒株进化枝I毒株。 QClmAb的这个独特性质使得其可以与其它205-赖氨酸特异性mAb组合用于治疗而无需考虑病毒逃脱问题(evasion)。
与本发明的mAb反应的AIV毒株在下文表I中列出。
代表性IFA图像在图1中示出。
表I
权利要求
1.特异性结合H5亚型禽流感病毒血凝素包膜糖蛋白的构象表位的抗体，其基本上具有由杂交瘤3H11产生的单克隆抗体3H11的免疫学结合特性，所述杂交瘤以保藏号PTA-9374保藏在美国典型培养物保藏中心，其中所述免疫学结合特性包括结合由单克隆抗体3H11结合的表位。
2.权利要求1的抗体，其是单克隆抗体、单链抗体、抗体片段、嵌合抗体或者人源化抗体。
3.权利要求1的抗体，其是单克隆抗体。
4.由杂交瘤3H11产生的单克隆抗体3H11，所述杂交瘤保藏在美国典型培养物保藏中心，保藏号为PTA-9374。
5.权利要求1、2或3的抗体或权利要求4的单克隆抗体在制备用于检测生物学样品中H5亚型禽流感病毒的试剂盒中的用途。
6.检测生物学样品中H5亚型禽流感病毒的试剂盒，其包含权利要求1、2或3的抗体或者权利要求4的单克隆抗体，所述试剂盒还具有检测所述抗体与所述包膜糖蛋白结合的至少一种试剂。
7.权利要求6的试剂盒，其还包含特异性结合H5亚型禽流感病毒的包膜糖蛋白的结合蛋白，其中所述抗体或单克隆抗体是捕获抗体，所述结合蛋白是含有可检测元件或者与可检测元件缀合的检测结合蛋白。
8.权利要求7的试剂盒，其包含所述单克隆抗体。
9.权利要求7的试剂盒，其中所述结合蛋白是单克隆抗体。
10.权利要求8的试剂盒，其中所述结合蛋白是单克隆抗体。
11.权利要求7的试剂盒，其中所述抗体或单克隆抗体固定化于固体表面上。
12.权利要求7的试剂盒，其中所述结合蛋白含有放射性原子，与荧光分子缀合，或者与酶缀合。
13.权利要求1、2或3的抗体或者权利要求4的单克隆抗体在制备用于治疗感染H5亚型禽流感病毒的对象的药物中的用途。
14.禽流感病毒株A/Indonesia/CDC669/2006(H5N1)的中和逃逸突变株，其包含位于由单克隆抗体3H11识别的所述毒株HA序列的表位内的突变，由此所述突变病毒不能被所述抗体中和。
15.权利要求14的中和逃逸突变株，其中所述突变在第155位氨基酸。
全文摘要
本发明提供了特异性结合禽流感病毒(AIV)H5亚型的包膜糖蛋白或者N1亚型的神经氨酸酶糖蛋白的单克隆抗体及相关的结合蛋白。所述单克隆抗体及相关的结合蛋白可用于检测AIV的H5和N1亚型，包括H5N1亚型，本发明提供了危险病毒感染的诊断、监视和治疗方法。
文档编号C12R1/91GK103214570SQ20121050681
公开日2013年7月24日 申请日期2008年9月12日 优先权日2007年9月13日
发明者钱红亮, F·和, H-S·康 申请人:淡马锡生命科学研究院有限公司