专利名称：大豆开花基因GmCOL1b及其编码蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及大豆开花基因GmCOLlb及其编码蛋白。
背景技术：
大豆为人类提供重要的植物蛋白质和油份。在世界范围内，北至高纬度的北欧瑞典和北美加拿大，南至巴西及阿根廷等广泛区域内均有大豆栽培，但单个品种或种质资源一般适宜种植的纬度跨度较小，这种区域适应性与大豆光周期和生育期基因或者数量性状位点(Quantitative Trait Locus, QTL)密切相关。选育生态适应性广的优良大豆品种是实现高产、优质、高效大豆产业的根本途径。但常规育种在广适应品种选育中进展缓慢，利用分子育种手段有望定向调节大豆光周期和生育期，加快广适应品种的选育。模式植物拟南芥和水稻的研究结果表明，C0NSTANS (CO)基因在光周期调控中起核心作用。近年来，研究 者从大豆中克隆到CO的类似基因如GmC0L4、GmC0L9、GmC0L10和GmCOLll等，但其表达模式受光的调节作用较弱，并不是CO的大豆同源基因(张清哲等，2010 ;Huang等，2011 Jiang等，2011 ;Liu等，2011)。通过遗传转化手段在大豆中验证大豆CO基因的功能，改变大豆光周期和大豆开花时间也没有报道。
发明内容
本发明是要解决大豆开花时间不受控制的技术问题，从而提供了大豆开花基因GmCOlb及其编码蛋白。本发明的大 开花基因GmCOLlb的基因序列如序列表Seq ID No I所不。本发明的大豆开花基因GmCOLlb的编码蛋白的氨基酸序列如序列表Seq ID No 2所示。本发明的有益效果本发明是在分子水平上首次成功地克隆出大豆开花基因GmCOLlb。本发明利用PCR方法从大豆中克隆出大豆开花基因GmCOLlb。本发明获得的GmCOLlb基因编码区全长序列与phytozome中公布的Glyma08g28370相对应。本发明通过遗传转化手段，将GmCOLlb基因在大豆中表达，验证了 GmCOLlb基因具有强烈抑制大豆开花的生理功能。
图1为Realtime荧光定量PCR显示GmCOLlb基因在不同光照条件下的表达水平曲线图，其中TUB为参照基因GmTubul in，▲表示GmCOLlb基因在短日照的表达水平曲线图， 表示GmCOLlb基因在长日照的表达水平曲线图；图2为pTFlOl.1-GmCOLlb质粒过表达载体结构示意图；图3为未转入GmCOLlb基因的大豆开花状态图，其中，箭头所指的是已开放的大豆花朵；
图4为图3中箭头所指处的放大图；图5为转入GmCOLlb基因后的大豆开花状态图；图6为未转入GmCOLlb基因与转入GmCOLlb基因后的大豆开花时间图，其中，DN50为未转入GmCOLlb基因的大豆，GmCOLlb-OX转入GmCOLlb基因后的大豆。
具体实施例方式具体实施方式
一本实施方式的大S 开花基因GmCOLlb的基因序列如序列表SeqIDNo 1 所示。本实施方式是在分子水平上首次成功地克隆出大豆开花基因GmCOLlb。本实施方式利用PCR方法从大豆中克隆出大豆开花基因GmCOLlb。本发明获得的GmCOLlb基因编码区全长序列与phytozome中公布的Glyma08g28370相对应。 本实施方式通过遗传转化手段,将GmCOLlb基因在大豆中表达,验证了 GmCOLlb基因具有强烈抑制大豆开花的生理功能。
具体实施方式
二 本实施方式的大豆开花基因GmCOLlb的编码蛋白的氨基酸序列如序列表Seq ID No :2所示。通过以下试验验证本发明的效果(I)大豆开花基因GmCOLlb的获得—、以大豆品种东农50的叶片为材料,用购买自Invitrogen公司的TRIzol试剂盒的操作手册提取叶片总RNA ;二、采用DNase I处理步骤一提取的总RNA ;三、取I U g步骤二处理后的总RNA用于cDNA的合成,cDNA的合成操作按照购买自BD BiosciencesClontech公司的BD SMART RACE cDNAAmpl if ication Kit试剂盒的使用手册进行，获得cDNA ;四、以获得的cDNA为模板通过Fl与Rl引物扩增GmCOLlb基因，PCR反应条件如下94°C预变性 5min, 94°C变性 30s, 56°C退火 30s, 72°C延伸 lmin,共 35 循环，再 72°C延伸 IOmin,将 PCR产物在ABI3130测序仪(ABI公司)上进行测序；其中，引物Fl的序列为GCCATCAAAA CACCACTCTG AC ;引物Rl 的序列为GCCCGATTAGTACAACTGCA AG。测序结果表明大豆开花基因GmCOLlb具有序列表中Seq ID No 1的核苷酸序列，序列表中的Seq ID No :1由1220个碱基组成，并编码具有序列表中Seq ID No :2的氨基酸序列的蛋白质。(2)大豆开花基因GmCOLlb的功能验证1、Real-time荧光定量PCR进行功能验证—、以大豆品种东农50的叶片为材料，用购买自Invitrogen公司的TRIzol试剂盒的操作手册提取叶片总RNA ;二、采用DNase I处理步骤一提取的总RNA ;三、取I y g步骤二处理后的总RNA用于cDNA的合成，cDNA的合成操作按照购买自BD BiosciencesClontech公司的BD SMART RACE cDNA Amplification Kit试剂盒的使用手册进行，获得cDNA ;四、取2 u I步骤三稀释5倍后的cDNA作为RT-PCR模板，以FlQ和RlQ为引物，操作步骤按购买自BioRad公司的SYBR Green Supermix kit试剂盒中所介绍的操作步骤进行，每个样品的总反应体积为20ii L，；五、采用购买自BioRad公司的iCycle iQ实时PCR检测系统进行检测；
其中，引物FlQ 的序列为 CATCAAAACA CCACTCTGAC ;引物 RlQ 的序列为 GCGTCAGCCTTGCAGAGGAA。GmCOLlb基因在不同光照条件下的表达水平曲线图如图1所示，由图1可知，本发明的GmCOLlb基因在长日照条件下(LD)表达峰值非常高，并且呈现生物节律式表达，在光照4小时后表达呈现峰值，但是在短日照条件下(SD)，表达量却很低。2、转基因进行功能验证—、以大豆品种东农50的叶片为材料,用购买自Invitrogen公司的TRIzol试剂盒的操作手册提取叶片总RNA ;二、采用DNase I处理步骤一提取的总RNA ;三、取I μ g步骤二处理后的总RNA用于cDNA的合成,cDNA的合成操作按照购买自BD BiosciencesClontech公司的BD SMART RACE cDNAAmplification Kit试剂盒的使用手册进行，获得cDNA ;四、分别以GmCOLlb基因F2与R2为引物，对步骤三获得的cDNA通过PCR进行5 ’与3 ’扩增，PCR反 应条件94°C预变性10min，94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸5min，共35循环，再72°C延伸lOmin，获得含有Xba1-SacI双酶酶切位点的大豆开花基因GmCOLlb ;五、将获得的含有酶切位点的大豆开花基因GmCOLlb克隆到pTFlOl.1质粒中，获得pTFlOl.1-GmCOLlb质粒，以大豆品种东农50为材料，利用农杆菌介导法进行遗传转化，获得转基因大豆，将转基因大豆与未转入GmCOLlb基因的大豆在长日照条件下种植，观察大豆生长及开花状态；其中，pTFlOl.1 质粒在 2006 年《Plant CellReports》中刊登的名称为"Improved cotyledonarynode method using an alternative explantderived from mature seed for efficientAgrobacterium-mediated soybean transformation” 的文章中公开，由文章的作者惠赠；大豆品种东农50由东北农业大学张慧珍教授惠赠；其中，引物F2的序列为GCTCTAGAGC CATCAAAACA CCACTCTGAC ;引物R2的序列为GCGAGCTCGC CCGATTAGTA CAACTGCAAG。步骤五获得的pTFlOl.1-GmCOLlb质粒过表达载体结构示意图如图2所示；未转入GmCOLlb基因的大豆开花状态图如图3所示，其中，箭头所指的是已开放的大豆花朵，图3中箭头所指处的放大图如图4所示，转入GmCOLlb基因后的大豆开花状态图如图5所示，从图3、图4和图5可以看出，当未转入GmCOLlb基因的大豆开花时，转入GmCOLlb基因后的大豆还没有开花，表明转入GmCOLlb基因后的大豆呈现明显的晚花状态；未转入GmCOLlb基因与转入GmCOLlb基因后的大豆开花时间图如图6所示，其中，DN50为未转入GmCOLlb基因的大豆，GmCOLlb-OX转入GmCOLlb基因后的大豆，从图6可以看出，DN50的开花时间为30天，GmCOLlb-OX的开花时间为40天，表明转入GmCOLlb基因后的大豆开花时间比未转入GmCOLlb基因后的大豆开花时间晚10天，从而说明GmCOLlb基因具有抑制大豆开花的功能。
权利要求
1.大显开花基因GmCOLlb，其特征在于大显开花基因GmCOLlb的基因序列如序列表Seq ID No 1 所示。
2.如权利要求1所述的大豆开花基因GmCOLlb的编码蛋白，其特征在于大豆开花基因 GmCOLlb的编码蛋白的氣基酸序列如序列表Seq ID No 2所不。
全文摘要
大豆开花基因GmCOL1b及其编码蛋白，它涉及大豆开花基因GmCOL1b及其编码蛋白。本发明是要解决大豆开花时间不受控制的技术问题。本发明的大豆开花基因GmCOL1b的基因序列如序列表Seq ID No1所示。本发明大豆开花基因GmCOL1b的编码蛋白的氨基酸序列如序列表Seq ID No2所示。GmCOL1b基因在大豆中的表达能明显抑制大豆开花，使开花时间延迟，生育期延长，本发明为分子手段培育广适应作物品种创造了条件，将在植物的遗传改良中发挥重要作用，本发明应用于大豆基因工程领域。
文档编号C12N15/29GK103014019SQ201210512369
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月4日 优先权日2012年12月4日
发明者曹东, 孔凡江, 南海洋, 刘宝辉 申请人:中国科学院东北地理与农业生态研究所