专利名称：一种用于合成他汀类化合物的新型培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于合成他汀类化合物的新型培养基，具体涉及一种用于生物合成洛伐他汀的培养基。
背景技术：
他汀类药物是一种胆固醇合成抑制剂，其结构与HMG-CoA结构相似，能有效地抑制胆固醇生物合成过程中的关键酶HMG-CoA还原酶的活性，因此在降血脂药物中占据重要地位。目前临床上主要通过天然发酵或生物合成及微生物转化生产他汀类药物，他汀产生菌及菌种选育天然他汀的生产主要依靠不同种、不 同基因组的丝状真菌直接产生或通过生物转化作用而得。洛伐他汀(L，astatine)为微生物发酵生产的第I代他汀类药物，但是目前的生产工艺中其投料浓度只有2. 5g/L，收率只有52%，生产成本太高，因此现在急需要一种能提高底物的投料浓度和转化率，降低生产成本的工艺。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种以洛伐他汀(Lovastatin)产生菌M. ruber, c-1612为菌种，生物合成他汀类化合物的新型培养基，其培养基成分包含有机氮源、碳源和无机盐。所述的有机氮源为海参蒸煮液蛋白酶解干粉、蛋白胨、酵母膏，含量为20g/L 35g/L，优选为28 g/L。所述的多糖类碳源为海参蒸煮液多糖酶解干粉，淀粉、糊精，含量为20g/L 40g/L优选为30g/L。所述的海参蒸煮液蛋白酶解干粉生产工艺为将海参蒸煮液浓缩后按质量比10 I加入蛋白水解酶，酶解温度60°C，pH值为6. 8，反应时间2小时。所述的海参蒸煮液多糖酶解干粉生产工艺为将海参蒸煮液浓缩后按质量比10 I加入多糖水解酶，酶解温度50°c，pH值为5. 0，反应时间10小时。本发明以海参蒸煮液酶解干粉作为氮源和碳源主体，不仅有利于海参蒸煮液的回收利用，保护环境，还使得培养基的组分更为合理廉价，配制更为方便，因此不仅降低了培养基的成本，同时还丰富了底物得营养结构。采用本发明的培养基合成洛伐他汀时，底物投料浓度可达10g/L，转化率最高可达89. 6%，而采用现有技术的培养基合成洛伐他汀时投料浓度只有2. 5g/L，收率最高只有52%。因此本发明经过优化的培养基可以很好的解决现有技术底物投料浓度低和转化率不高的缺点，从而降低洛伐他汀的工业生产成本。
具体实施例方式实施例1斜面培养基PDA培养基(200g 土豆煮汁1000ml，葡萄糖20g，琼脂20g)，121°C灭菌20mino种子培养基海参蒸煮液酶解干粉10g/L，糊精10g/L，121°C灭菌20min。发酵培养基海参蒸煮液酶解干粉6g/L，麦芽糊精3g/L，121°C灭菌20min。转化过程将接种菌种的斜面置于30°C恒温培养箱中，培养4天，得到成熟的孢子，然后成熟的孢子接种于装有50ml种子培养基的250ml摇瓶中，在30°C、300rpm摇床上培养4天，得到成熟的种子，得到的种子以5%的接种量接入装有IOOml发酵培养基的IOOOml摇瓶中，置于30°C、300r/min摇床中继续培养I天，以每升发酵液IOg底物的量加入底物，置于30°C、300r/min摇床继续转化至2天时放瓶，发酵液采用超临界CO2萃取分离，离心取上清用HPLC进行分析，采用外标法对样品进行定量，计算转化率为85. 7%0HPLC条件为LC-10AD型高效液相色谱仪；色谱柱XDB_C18 (250mmX4. 6mm, 5 μ m);流动相为甲醇水=70 30 ;流速1. Oml/min ;进样量10μ I ;检测波长240nm。实施例2
种子培养基海参蒸煮液酶解干粉10g/L，糊精15g/L，121°C灭菌20min。发酵培养基海参蒸煮液酶解干粉7g/L，麦芽糊精2g/L，121°C灭菌20min。
转化过程将接种菌种的斜面置于30°C恒温培养箱中，培养4天，得到成熟的孢子，然后成熟的孢子接种于装有50ml种子培养基的250ml摇瓶中，在30°C、300rpm摇床上培养4天，得到成熟的种子，得到的种子以10%的接种量接入装有IOOml发酵培养基的IOOOml摇瓶中，置于30°C、300r/min摇床中继续培养I天，以每升发酵液IOg底物的量加入底物，置于30°C、300r/min摇床继续转化至2天时放瓶，发酵液采用超临界CO2萃取分离，离心取上清用HPLC进行分析，采用外标法对样品进行定量，计算转化率为89.6%。其余同实施例1。实施例3
发酵培养基海参蒸煮液酶解干粉8g/L，麦芽糊精lg/L，121°C灭菌20min。转化过程将接种菌种的斜面置于30°C恒温培养箱中，培养4天，得到成熟的孢子，然后成熟的孢子接种于装有50ml种子培养基的250ml摇瓶中，在30°C、300rpm摇床上培养4天，得到成熟的种子，得到的种子以15%的接种量接入装有IOOml发酵培养基的IOOOml摇瓶中，置于30°C、300r/min摇床中继续培养I天，以每升发酵液IOg底物的量加入底物，置于30°C、300r/min摇床继续转化至2天时放瓶，发酵液采用超临界CO2萃取分离，离心取上清用HPLC进行分析，采用外标法对样品进行定量，计算转化率为87.8%。其余同实施例1。上述实施例不作为对本发明的限定，凡在本发明的范围内所作的任何修改、等同替换、改进等，均属于本发明的保护范围。
权利要求
1.一种用于合成他汀类化合物的新型培养基，其特征是以洛伐他汀产生菌M. ruber, c-1612为菌种，生物合成他汀类化合物，尤其是洛伐他汀的培养基，包含有机氮源、多糖类碳源和无机盐。
2.权利要求1所述的培养基，其特征是所述的有机氮源为海参蒸煮液蛋白酶解干粉、蛋白胨、酵母膏，含量为20g/L 35g/L。
3.权利要求1所述的培养基，其特征是所述的多糖类碳源为海参蒸煮液多糖酶解干粉，淀粉、糊精，含量为20g/L 40g/L。
4.权利要求2所述的培养基，其特征是所述的海参蒸煮液蛋白酶解干粉生产工艺为将海参蒸煮液浓缩后按质量比10 1加入蛋白水解酶，酶解温度60°C，pH值为6. 8，反应时间2小时。
5.权利要求3所述的培养基，其特征是所述的海参蒸煮液多糖酶解干粉生产工艺为将海参蒸煮液浓缩后按质量比10 1加入多糖水解酶，酶解温度50°C，pH值为5. 0，反应时间10小时。
全文摘要
本发明公开了一种以洛伐他汀产生菌M.ruber,c-1612为菌种，生物合成他汀类化合物的新型培养基，其培养基成分包含有机氮源、碳源和无机盐，其中有机氮源为海参蒸煮液酶解干粉、蛋白胨、酵母膏。本发明的新型培养基合成洛伐他汀时的底物投料浓度可达10g/L，转化率最高可达89.6%，因此大大提高了洛伐他汀的工业生产成本。
文档编号C12P17/06GK103014089SQ20121051362
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月5日 优先权日2012年12月5日
发明者荆晓丽 申请人:青岛艾华隆生物科技有限公司