专利名称：一种对虾病毒分离、鉴定和感染模型建立的方法
一种对虾病毒分离、鉴定和感染模型建立的方法技术领域
本发明属于抗病毒研究领域，特别涉及到一种对虾病毒分离、鉴定和感染模型建立的方法。
背景技术：
凡纳滨对虾因其生长快、抗病力强、适盐性广、肉味鲜美而被引入我国大量养殖， 目前我国的对虾养殖品种中80%都为凡纳滨对虾,然而,对虾在大量养殖过程中，也伴随着病毒性疫病的大量繁殖与传播，病毒性疫病的的爆发仍是目前阻滞对虾养殖业健康发展的最大障碍，其中对奸桃拉病毒(Taura Syndrome Virus, TSV)是对奸养殖业危害最为严重的病原之一。TSV病毒是单链RNA病毒，主要感染靶器官为甲壳上皮(附肢、鳃、胃、食道、后肠)、结缔组织等，引起对虾病虾不摄食，消化道内无食物；游泳无力，反应迟钝，甲壳变软， 虾体发红，尤其是尾扇变红，幼虾(O. 05-5克)发病严重，死亡率高达80%，而幸存者甲壳有黑斑，即虾壳角质有黑化病灶。近年来，该病毒在我国沿海对虾养殖主产区大面积流行，造成的经济损失巨大。鉴于凡纳滨对虾在我国具有重要的经济地位，有必要对其病害防治方法和致病机理进行深入研究，但是TSV病毒属于RNA，不易保存和纯化，因此，建立一个相对于TSV病毒分离、鉴定和保存的完整的方法对于研究对虾RNA病毒的防治是必不可少的。
目前，只查到关于对虾白斑综合症病毒感染模型建立的公开文献，而关于对虾桃拉病毒(TSV)感染模型的建立，尚未见报道。发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种对虾病毒分离、鉴定和感染模型建立的方法，通过本发明的方法建立的对虾TSV病毒感染模型重现性好，RNA病毒致病力比较强，感染效果比较明显；鉴定方法比较简单，判断标准明晰，不仅适用于RNA病毒的抗病选育研究，还可以用于TSV致病机理的研究。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的一种对虾病毒分离、鉴定和感染模型建立的方法，包括以下步骤(1)TSV病毒组织的获得将保存的TSV纯化病毒粒子按质量体积比1:1000稀释， 用胰岛素注射器分别注射于凡纳滨对虾的第三腹节肌肉处，试验对虾30尾，每尾注射 1(Γ 2μ L，注射后对虾养殖水温控制在28-30°C，盐度28%。，持续充气，每天观察对虾状态， 将濒死对虾及时收取置于液氮中；(2)TSV病毒检测用PCR方法检测对虾TSV病毒感染情况，抽取濒死对虾的肝胰腺组织RNA，反转录为cDNA，利用此cDNA为模板进行扩增，扩增TSV病毒上下游引物序列为上游引物5' -TCAATGAGAGCTTGGTCC-3'，下游引物5' -AAGTAGACAGCCGCGCTT-3';扩增产物在250bp Marker附近出现一条亮带,说明该奸可能被桃拉病毒感染,再通过纯化、克隆和测序确定该序列为桃拉病毒序列，即该虾为桃拉病毒感染阳性对虾。
(3) TSV病毒液的制备取2_5g TSV阳性的对虾肝胰腺组织和肌肉组织液氮研磨3成粉末，将其置于50ml的无菌的离心管中，再加入12 30ml的O. OlM的灭菌PBS缓冲液，剧烈震荡混匀，以8000g离心15min，将上层清液用O. 45 μ m的滤器过滤，利用步骤(2)所述 PCR方法检测病毒液是否为阳性，以确定在制备病毒液过程中核酸完全裂解出来，即病毒粒子完全释放出来，若为阳性则分装成病毒保存液，_80°C冻存备用；(4)构建 TSV 感染模型将 TSV 病毒液按 10_(η_2)，ΙΟ+1)，10_n，10_(n+1)，10_(n+2)共 5 个浓度制备感染液，将随机挑选的90只对虾分成6组，进行肌肉注射感染，对照组注射等体积的PBS平衡盐溶液，每小时观察对虾情况，连续观察7d，既而确定感染量，确定病毒感染模型。所述PBS平衡盐溶液为每IL平衡盐溶液中含有O. 2g氯化钾，0.2g磷酸二氢钾， 8. OOg氯化钠，2. 16g 7个水分子的磷酸氢二钠；以上所述步骤(4)的η值为感染对虾后7d内致90%以上的对虾死亡的最大的稀释倍数。
以上所述步骤(2)扩增的体系为12yL 2 X Taq PCR康为试剂，11 μ L的无菌双蒸水，模板和上下游引物各I μ L，扩增程序为94°C 3min, 94°C 30s, 55°C 40s, 72°C 30s， 35个循环，72°C延伸IOmin0
以上所述步骤(I)试验对虾的体重为l(Tl2g。
与现有技术相比，本发明的有益效果是通过本发明的方法建立的对虾TSV病毒感染模型重现性好，RNA病毒致病力比较强，感染效果比较明显；鉴定方法比较简单，判断标准明晰，不仅适用于RNA病毒的抗病选育研究，还可以用于TSV致病机理的研究。
图I为凡纳滨对虾TSV感染模型的建立，横坐标为对虾感染TSV的天数，纵坐标为对虾的死亡率，系列1-5代表由低到高的不同浓度的病毒液攻毒组，系列6为对照组；图2为TSV感染对虾的肝胰腺组织的RNA提取图；图3为凡纳滨对虾体内TSV的PCR检测图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式并不局限于实施例表示的范围，实施例I:一种对虾病毒分离、鉴定和感染模型建立的方法，包括以下步骤(1)TSV病毒组织的获得将保存的TSV纯化病毒粒子按质量体积比1:1000稀释，用胰岛素注射器分别注射于凡纳滨对虾的第三腹节肌肉处，试验对虾30尾(体重l(Tl2g)， 每尾注射l(Tl2yL (以I μ L/g的剂量注射病毒给每只对虾)，注射后对虾养殖水温控制在 28-30°C，盐度28%。，持续充气，每天观察对虾状态，将濒死对虾及时收取置于液氮中；(2)TSV病毒检测用PCR方法检测对虾TSV病毒感染情况，抽取濒死对虾的肝胰腺组织RNA，反转录为cDNA，利用此cDNA为模板进行扩增，扩增TSV病毒上下游引物序列为上游引物5 ' -TCAATGAGAGCTTGGTCC-3 '，下游引物5 ' -AAGTAGACAGCCGCGCTT-3 '，扩增的体系为12 μ L 2 X Taq PCR康为试剂，11 μ L的无菌双蒸水，模板和上下游引物各I μ L，扩增程序为 94°C 3min, 94°C 30s, 55°C 40s, 72°C 30s, 35 个循环，72°C 延伸 IOmin ;(3)TSV病毒液的制备取2gTSV阳性的对虾肝胰腺组织和肌肉组织液氮研磨成粉末， 将其置于50ml的无菌的离心管中，再加入12ml的O. OlM的灭菌PBS缓冲液，剧烈震荡混匀，以8000g离心15min，将上层清液用O. 45 μ m的滤器过滤，利用步骤(2)所述PCR方法检测病毒液是否为阳性，若为阳性则分装成病毒保存液，_80°C冻存备用；(4)构建TSV 感染模型将 TSV 病毒液按 10_(η_2)，ΙΟ+1)，10_n，10_(n+1)，10_(n+2)共 5 个浓度制备感染液，将随机挑选的90只对虾分成6组，进行肌肉注射感染，对照组注射等体积的PBS平衡盐溶液，每小时观察对虾情况，连续观察7d,既而确定感染量，确定病毒感染模型；n值为感染对虾后7d内致90%以上的对虾死亡的最大的稀释倍数。
如图I所示，随着TSV病毒感染液浓度的降低，凡纳滨对虾死亡高峰的出现时间相对延后，且观察时间内对虾累计死亡率相对降低；当TSV病毒液的稀释度在10_卜10_2时，7d 内对虾几乎全部死亡(大于90%)，而稀释度为10_3倍时死亡率明显降低。根据本发明的判定标准7d内感染对虾的累积死亡率大于90%的组的最大病毒液稀释倍数作为RNA干扰用病毒感染浓度。因此，该批对虾进行RNA感染实验时，使用的感染液浓度为病毒液作10_2倍稀释(n=2)。建立病毒感染模型是通过以I μ L/g的剂量注射病毒给每只对虾，从而确定对虫下的病毒感染剂量。
(5)每年10月份左右取南美白对虾育种中心易感家系群体的对虾进行病毒的复制，将感染TSV病毒的对虾组织经过液氮充分冻存之后，取出置于-80°c冰箱冻存，待第二年4-5月份将该病虾组织制备病毒液感染新的对虾。
实施例2 一种对虾病毒分离、鉴定和感染模型建立的方法，包括以下步骤(1)TSV病毒组织的获得将保存的TSV纯化病毒粒子按质量体积比1:1000稀释，用胰岛素注射器分别注射于凡纳滨对虾的第三腹节肌肉处，试验对虾30尾(体重l(Tl2g)， 每尾注射1(Γ 2μ L (以I μ L/g的剂量注射病毒给每只对虾)，注射后对虾养殖水温控制在 28-30°C，盐度28%。，持续充气，每天观察对虾状态，将濒死对虾及时收取置于液氮中；(2)TSV病毒检测用PCR方法检测对虾TSV病毒感染情况，抽取濒死对虾的肝胰腺组织RNA，反转录为cDNA，利用此cDNA为模板进行扩增，扩增TSV病毒上下游引物序列为上游引物5 ' -TCAATGAGAGCTTGGTCC-3 '，下游引物5 ' -AAGTAGACAGCCGCGCTT-3 '，扩增的体系为12 μ L 2 X Taq PCR康为试剂，11 μ L的无菌双蒸水，模板和上下游引物各I μ L，扩增程序为 94°C 3min, 94°C 30s, 55°C 40s, 72°C 30s, 35 个循环，72°C 延伸 IOmin ;(3)TSV病毒液的制备取3gTSV阳性的对虾肝胰腺组织和肌肉组织液氮研磨成粉末， 将其置于50ml的无菌的离心管中，再加入18ml的O. OlM的灭菌PBS缓冲液，剧烈震荡混匀，以8000g离心15min，将上层清液用O. 45 μ m的滤器过滤，利用步骤(2)所述PCR方法检测病毒液是否为阳性，若为阳性则分装成病毒保存液，_80°C冻存备用；(4)构建TSV 感染模型将 TSV 病毒液按 10_(η_2)，ΙΟ+1)，10_n，10_(n+1)，10_(n+2)共 5 个浓度制备感染液，将随机挑选的90只对虾分成6组，进行肌肉注射感染，对照组注射等体积的PBS平衡盐溶液，每小时观察对虾情况，连续观察7d,既而确定感染量，确定病毒感染模型；n值为感染对虾后7d内致90%以上的对虾死亡的最大的稀释倍数。
如图I所示，随着TSV病毒感染液浓度的降低，凡纳滨对虾死亡高峰的出现时间相对延后，且观察时间内对虾累计死亡率相对降低；当TSV病毒液的稀释度在10_卜10_2时，7d内对虾几乎全部死亡(大于90%)，而稀释度为10_3倍时死亡率明显降低。根据本发明的判定标准7d内感染对虾的累积死亡率大于90%的组的最大病毒液稀释倍数作为RNA干扰用病毒感染浓度。因此，该批对虾进行RNA感染实验时，使用的感染液浓度为病毒液作10_2倍稀释(n=2)。建立病毒感染模型是通过以I μ L/g的剂量注射病毒给每只对虾，从而确定对虫下的病毒感染剂量。
(5)每年10月份左右取南美白对虾育种中心易感家系群体的对虾进行病毒的复制，将感染TSV病毒的对虾组织经过液氮充分冻存之后，取出置于-80°c冰箱冻存，待第二年4-5月份将该病虾组织制备病毒液感染新的对虾。
实施例3:一种对虾病毒分离、鉴定和感染模型建立的方法，包括以下步骤
(1)TSV病毒组织的获得将保存的TSV纯化病毒粒子按质量体积比1:1000稀释，用胰岛素注射器分别注射于凡纳滨对虾的第三腹节肌肉处，试验对虾30尾(体重l(Tl2g)， 每尾注射l(Tl2yL (以I y L/g的剂量注射病毒给每只对虾)，注射后对虾养殖水温控制在 28-30°C，盐度28%。，持续充气，每天观察对虾状态，将濒死对虾及时收取置于液氮中；(2)TSV病毒检测用PCR方法检测对虾TSV病毒感染情况，抽取濒死对虾的肝胰腺组织RNA，反转录为cDNA，利用此cDNA为模板进行扩增，扩增TSV病毒上下游引物序列为上游引物5 ' -TCAATGAGAGCTTGGTCC-3 '，下游引物5 ' -AAGTAGACAGCCGCGCTT-3 '，扩增的体系为12 μ L 2XTaq PCR康为试剂，11 μ L的无菌双蒸水，模板和上下游引物各I μ L，扩增程序为 94°C 3min, 94°C 30s, 55°C 40s, 72°C 30s, 35 个循环，72°C 延伸 IOmin ;(3)TSV病毒液的制备取4gTSV阳性的对虾肝胰腺组织和肌肉组织液氮研磨成粉末， 将其置于50ml的无菌的离心管中，再加入24ml的O. OlM的灭菌PBS缓冲液，剧烈震荡混匀，以8000g离心15min，将上层清液用O. 45 μ m的滤器过滤，利用步骤(2)所述PCR方法检测病毒液是否为阳性，若为阳性则分装成病毒保存液，_80°C冻存备用；(4)构建TSV 感染模型将 TSV 病毒液按 10_(η_2)，ΙΟ+1)，10_n，10_(n+1)，10_(n+2)共 5 个浓度制备感染液，将随机挑选的90只对虾分成6组，进行肌肉注射感染，对照组注射等体积的PBS平衡盐溶液，每小时观察对虾情况，连续观察7d,既而确定感染量，确定病毒感染模型；n值为感染对虾后7d内致90%以上的对虾死亡的最大的稀释倍数。
如图I所示，随着TSV病毒感染液浓度的降低，凡纳滨对虾死亡高峰的出现时间相对延后，且观察时间内对虾累计死亡率相对降低；当TSV病毒液的稀释度在10_卜10_2时，7d 内对虾几乎全部死亡(大于90%)，而稀释度为10_3倍时死亡率明显降低。根据本发明的判定标准7d内感染对虾的累积死亡率大于90%的组的最大病毒液稀释倍数作为RNA干扰用病毒感染浓度。因此，该批对虾进行RNA感染实验时，使用的感染液浓度为病毒液作10_2倍稀释(n=2)。建立病毒感染模型是通过以I μ L/g的剂量注射病毒给每只对虾，从而确定对虫下的病毒感染剂量。
(5)每年10月份左右取南美白对虾育种中心易感家系群体的对虾进行病毒的复制，将感染TSV病毒的对虾组织经过液氮充分冻存之后，取出置于-80°c冰箱冻存，待第二年4-5月份将该病虾组织制备病毒液感染新的对虾。
实施例4 一种对虾病毒分离、鉴定和感染模型建立的方法，包括以下步骤(1)TSV病毒组织的获得将保存的TSV纯化病毒粒子按质量体积比1:1000稀释，用胰岛素注射器分别注射于凡纳滨对虾的第三腹节肌肉处，试验对虾30尾(体重l(Tl2g)， 每尾注射1(Γ 2μ L (以I μ L/g的剂量注射病毒给每只对虾)，注射后对虾养殖水温控制在 28-30°C，盐度28%。，持续充气，每天观察对虾状态，将濒死对虾及时收取置于液氮中；(2)TSV病毒检测用PCR方法检测对虾TSV病毒感染情况，抽取濒死对虾的肝胰腺组织RNA，反转录为cDNA，利用此cDNA为模板进行扩增，扩增TSV病毒上下游引物序列为上游引物5 ' -TCAATGAGAGCTTGGTCC-3 '，下游引物5 ' -AAGTAGACAGCCGCGCTT-3 '，扩增的体系为12 μ L 2 X Taq PCR康为试剂，11 μ L的无菌双蒸水，模板和上下游引物各I μ L，扩增程序为 94°C 3min, 94°C 30s, 55°C 40s, 72°C 30s, 35 个循环，72°C 延伸 IOmin ;(3)TSV病毒液的制备取5gTSV阳性的对虾肝胰腺组织和肌肉组织液氮研磨成粉末， 将其置于50ml的无菌的离心管中，再加入30ml的O. OlM的灭菌PBS缓冲液，剧烈震荡混匀，以8000g离心15min，将上层清液用O. 45 μ m的滤器过滤，利用步骤(2)所述PCR方法检测病毒液是否为阳性，若为阳性则分装成病毒保存液，_80°C冻存备用；(4)构建TSV 感染模型将 TSV 病毒液按 10_(η_2)，ΙΟ+1)，10_n，10_(n+1)，10_(n+2)共 5 个浓度制备感染液，将随机挑选的90只对虾分成6组，进行肌肉注射感染，对照组注射等体积的PBS平衡盐溶液，每小时观察对虾情况，连续观察7d,既而确定感染量，确定病毒感染模型；n值为感染对虾后7d内致90%以上的对虾死亡的最大的稀释倍数。
如图I所示，随着TSV病毒感染液浓度的降低，凡纳滨对虾死亡高峰的出现时间相对延后，且观察时间内对虾累计死亡率相对降低；当TSV病毒液的稀释度在10_卜10_2时，7d 内对虾几乎全部死亡(大于90%)，而稀释度为10_3倍时死亡率明显降低。根据本发明的判定标准7d内感染对虾的累积死亡率大于90%的组的最大病毒液稀释倍数作为RNA干扰用病毒感染浓度。因此，该批对虾进行RNA感染实验时，使用的感染液浓度为病毒液作10_2倍稀释(n=2)。建立病毒感染模型是通过以I μ L/g的剂量注射病毒给每只对虾，从而确定对虫下的病毒感染剂量。
(5)每年10月份左右取南美白对虾育种中心易感家系群体的对虾进行病毒的复制，将感染TSV病毒的对虾组织经过液氮充分冻存之后，取出置于-80°c冰箱冻存，待第二年4-5月份将该病虾组织制备病毒液感染新的对虾。
核苷酸序列表〈110〉广西壮族自治区水产研究所〈120〉一种对虾病毒分离、鉴定和感染模型建立的方法〈160>2000<170>PatentIn version 3. 5 〈210〉 I <211>231bp 〈212〉 RNA〈213〉对奸桃拉病毒(Taura Syndrome Virus)<400>1aagtagacag ccgcgcttgc gtggtgggac ttaattaatg cctgctaacc caactgaaat 60 tgataattca aatacaacaa ctagtggagg actaattcca ggaggtagtg ttacaaacaa 120tgaaggttct acaaccttga tgaacgatat cccaatcacc agtcagaatg tagttctatc 180 caagaatgta acagataacc tgtttgaagt ccaggaccaa gctctcattg a231〔核苷酸序列表
〈110〉广西壮族自治区水产研究所
〈120〉一种对虾病毒分离、鉴定和感染模型建立的方法
〈160>2000
<170>PatentIn version 3. 5
〈210〉 1 <211>231bp 〈212〉 RNA
〈213〉对奸桃拉病毒(Taura Syndrome Virus)
<400>1
aagtagacag ccgcgcttgc gtggtgggac ttaattaatg cctgctaacc caactgaaat 60 tgataattca aatacaacaa ctagtggagg actaattcca ggaggtagtg ttacaaacaa 120 tgaaggttct acaaccttga tgaacgatat cccaatcacc agtcagaatg tagttctatc 180 caagaatgta acagataacc tgtttgaagt ccaggaccaa gctctcattg a23权利要求
1.一种对虾病毒分离、鉴定和感染模型建立的方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)TSV病毒组织的获得将保存的TSV纯化病毒粒子按质量体积比1:1000稀释，用胰岛素注射器分别注射于凡纳滨对虾的第三腹节肌肉处，试验对虾30尾，每尾注射l(Tl2ii L，注射后对虾养殖水温控制在28-30°C，盐度28%。，持续充气，每天观察对虾状态，将濒死对虾及时收取置于液氮中； (2)TSV病毒检测用PCR方法检测对虾TSV病毒感染情况，抽取濒死对虾的肝胰腺组织RNA，反转录为cDNA，利用此cDNA为模板进行扩增，扩增TSV病毒上下游引物序列为上游引物5' -TCAATGAGAGCTTGGTCC-3'，下游引物5' -AAGTAGACAGCCGCGCTT-3'； (3)TSV病毒液的制备取2 5g TSV阳性的对虾肝胰腺组织和肌肉组织液氮研磨成粉末，将其置于50ml的无菌的离心管中，再加入12 30ml的0. OlM的灭菌PBS缓冲液，剧烈震荡混匀，以8000g离心15min，将上层清液用0. 45 y m的滤器过滤，利用步骤(2)所述PCR方法检测病毒液是否为阳性，若为阳性则分装成病毒保存液，_80°C冻存备用；(4)构建TSV 感染模型将 TSV 病毒液按 l(T(n-2)，lO+-1)，10-n，10-(n+1)，10-(n+2)共 5 个浓度制备感染液，将随机挑选的90只对虾分成6组，进行肌肉注射感染，对照组注射等体积的PBS平衡盐溶液，每小时观察对虾情况，连续观察7d，既而确定感染量，确定病毒感染模型。
2.根据权利要求I所述的对虾病毒分离、鉴定和感染模型建立的方法，其特征在于所述步骤(4)的n值为感染对虾后7d内致90%以上的对虾死亡的最大的稀释倍数。
3.根据权利要求I或2所述的对虾病毒分离、鉴定和感染模型建立的方法，其特征在于所述步骤(2)扩增的体系为12ii L 2 X Taq PCR康为试剂，IluL的无菌双蒸水，模板和上下游引物各Iu L，扩增程序为94°C 3min, 94°C 30s, 55°C 40s, 72°C 30s, 35个循环，72°C 延伸 IOmin0
4.根据权利要求3所述的对虾病毒分离、鉴定和感染模型建立的方法，其特征在于所述步骤(I)试验对虾的体重为l(Tl2g。
全文摘要
本发明公开一种对虾病毒分离、鉴定和感染模型建立的方法，其特征在于，包括以下步骤(1)TSV病毒组织的获得；(2)TSV病毒检测；(3)TSV病毒液的制备；(4)构建TSV感染模型。通过本发明的方法建立的对虾TSV病毒感染模型重现性好，RNA病毒致病力比较强，感染效果比较明显；鉴定方法比较简单，判断标准明晰，不仅适用于RNA病毒的抗病选育研究，还可以用于TSV致病机理的研究。
文档编号C12Q1/70GK102978171SQ20121052476
公开日2013年3月20日 申请日期2012年12月7日 优先权日2012年12月7日
发明者陈秀荔, 赵永贞, 陈晓汉, 彭敏, 李咏梅, 杨春玲, 何苹萍 申请人:广西壮族自治区水产研究所