一种产β-胡萝卜素基因工程菌的构建方法
【专利摘要】本发明公开了一种产β-胡萝卜素基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：A）构建基因表达模块，所述基因表达模块包括β-胡萝卜素生产相关的基因、所述β-胡萝卜素生产相关的基因上游的启动子和所述β-胡萝卜素生产相关的基因下游的终止子；B）将所述基因表达模块共转化至酿酒酵母中。本发明的方法具有简单快速高效的优点，避免了多级的克隆，也不需要依赖酶切位点，多片段共同转化，同源重组效率高，可以明显缩短工程菌构建时间。
【专利说明】—种产β-胡萝卜素基因工程菌的构建方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物发酵领域，具体地说，是关于一种产β-胡萝卜素基因工程菌的构建方法。
【背景技术】
[0002]迄今为止，已报道了 600多种类胡萝卜素，来源细菌、藻类、酵母和植物兼有，β_胡萝卜素是其中之一。β_胡萝卜素作为维生素A的前体之一，是联合国粮农组织和世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会认定的A类全营养食品强化剂，同时已被世界上52个国家和地区批准使用，并被美国食品化学品添加剂典范(FCC)收载。此外，作为药物，胡萝卜素已被美国药典(USP) 1990版、1995版，欧洲药典1997版，英国药典(BP)1998版正式收载，中国卫生部部颁标准也已收载本品，中国国家药品监督管理局公布的第一批非处方药目录亦收载本品(S.J.Chem.β_胡萝卜素国内市场分析，精细与专用化学品，2003，8:8-9)
[0003]目前，全世界β_胡萝卜素的需求量每年以7%~9%的速度增长，美国的需求量近年以10%~15%的速度增长，全世界的β-胡萝卜素的年需求量1000t左右，在我国销售量约rst (朱秀灵等.β_胡萝卜素生理功能及提取技术的研究进展，西华大学学报:自然科学版，2005，1:71-76)。2000年我国β -胡萝卜素产量约为10t，其中40%用于出口，国内消费60%，其中70%的用于食品工业，20%用于保健品，10%用于药品生产，2001年约为22t，其中约75%是利用发酵法生产(S.J.Chem.β _胡萝卜素国内市场分析，精细与专用化学品，2003，8:8-9)。
[0004]β -胡萝卜素的 分子式为C4tlH56,分子量为536.88,其有全反式、9_顺式和15-顺式3种结构。目前生产β -胡萝卜素的方法主要有天然物提取法、化学合成法和微生物发酵法。罗氏公司1954年最先使用化学合成法生产β-胡萝卜素，1972年BASF公司也开始使用化学合成法生产，天然β_胡萝卜素是反式和顺式的混合构型，而化学合成的则为全反式构型，并且随着时间的推移和研究深入，人们发现采用化学法合成的β_胡萝卜素由于不能完全被人体吸收，并对人体产生一定程度的毒副作用，长期服用还会对人体产生不可逆转的病变，因此化学合成的β_胡萝卜素在西方国家已被禁止用作食品添加剂。此外，β-胡萝卜素可以从胡萝卜，沙棘，番茄，马铃薯，枸杞和玉米等天然植物中提取，但是天然物中β_胡萝卜素含量很低，提取工艺复杂，成本高，产品纯度低，而且大量种植需要耗费很多的土地资源，种植周期较长。相对来讲，生物发酵法生产β_胡萝卜素则克服了以上两种方法的缺点，具有生产工艺简单、周期短、成本低、产品质量好等优点。
[0005]研究发现，细菌中如光合细菌(Rhodobacter sphaeroides)等，酵母如红发夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous),胶红酵母(Rhodotorulamucilaginosa)、红酵母(Rhodotorula glutinis)、深红酵母(Rhodotorula rubra)等，霉菌如三抱布拉氏霉(Blakeslea trispro),布拉克须霉(Phycomycesblakesleeanus)和卷枝毛霉(Mucorcircinel1ides)等和藻类如杜氏藻(DunalielIa)等都可以合成并在胞内积累类胡萝卜素(张闯等.不同微生物生产类胡萝卜素的研究现状，2011，32(2):179-183)，总类胡萝卜素中均含有不同比例的β_胡萝卜素。
[0006]杜氏藻(Dunaliella)和三孢布拉氏霉(Blakeslea trispro)的发酵生产技术比较成熟，均已经进入工业化生产，其中三孢布拉氏霉(Blakeslea trispro)培养5天β -胡萝
卜素产量可高达80(T900mg/L，杜氏藻(Dunaliella)的发酵，β-胡萝卜素在干菌体中的含量可高达10%。但是三孢布拉氏霉由于霉菌的生殖方式等原因，其性状易发生衰退，藻类养殖条件要求苛刻，这些不足限制了其发展，所以寻求优良菌株变得尤为重要。
[0007]模式菌如大肠杆菌，酿酒酵母等已经被证明是良好的基因工程菌宿主。目前，已从细菌、真菌、藻类和植物等生物中鉴定了 150多个参与类胡萝卜素合成酶基因。类胡萝卜素均通过类异戊二烯化合物或萜类化合物途径合成，人们已经鉴定了红发夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)的类胡萝卜素合成途径(Gil-HwanAn et al., Monocyclic carotenoid biosynthetic pathway in the yeastPhaffiarhodozyma(Xanthophyllomyces dendrorhous), 1999, 88(2):189-193 ； Jan C.Verdoes etal.， Metabolic Engineering of the Carotenoid Biosynthetic Pathway inthe YeastXanthophyllomyces dendrorhous (Phaffiar hodozyma).APPLIED ANDENVIR0NMENTALMICROBIOLOGY，2003，69 (7):3728-3738)(图1)。
[0008]酵母的同源重组效率远远高于细菌或是其他的高等真核生物，酵母已作为一种工程菌操作平台，在途径工程和代谢工程领域被广泛用于生物化学途径的异源表达，同时染色体重组获得工程菌，具有遗传稳定，避免外源基因丢失的优点。Verwaal R等使用酿酒酵母作为宿主菌，整合型质粒YEplacl95包含crtYB、crtl和crtE基因转化，始产β -胡萝卜素 141ug/g DCW (Verwaal Rj Wang Jj MeijnenJP et al.High-level productionof Beta-carotene in Saccharomyces cerevisiae bysuccessive transformationwith carotenogenic genes from Xanthophyllomycesdendrorhous.Appl EnvironMicrobiol，2007，73:4342-4350)。Guo-1iang Yan等使用酿酒酵母作为宿主菌，整合型质粒YIplac211包含crtYB、crtl和`crtE基因转化，始产β -胡萝卜素2.57mg/g DCW (Guo-liang Yan et al., Important Role of Catalasein the Production ofb-carotene by Recombinant Saccharomyces cerevisiae underH202 Stress, CurrMicrobiol，2011，62:1056-1061)。然而，这种β _胡萝卜素基因工程菌构建的方法需要依次将β-胡萝卜素表达相关的基因整合于酵母菌染色体上，涉及多级克隆，且依赖于合适的酶切位点选择，操作繁琐，周期长。
【发明内容】
[0009]为了克服现有技术中的不足，本发明旨在提供一种产β-胡萝卜素基因工程菌的构建方法。
[0010]本发明的产β-胡萝卜素基因工程菌的构建方法，包括以下步骤:
[0011]Α)构建基因表达模块，所述基因表达模块包括β_胡萝卜素生产相关的基因、所述β_胡萝卜素生产相关的基因上游的启动子和所述β_胡萝卜素生产相关的基因下游的终止子；
[0012]B)将所述基因表达模块共转化至酿酒酵母中。[0013]根据本发明，所述步骤A)中所述基因表达模块还包括抗性基因、所述抗性基因上游的启动子和所述抗性基因下游的终止子。
[0014]根据本发明，所述步骤A)中所述构建基因表达模块包括以下步骤:
[0015]Al)通过PCR扩增获得所述β-胡萝卜素生产相关的基因、所述抗性基因片段、所述β-胡萝卜素生产相关的基因上游的启动子片段、所述抗性基因上游的启动子片段、所述β-胡萝卜素生产相关的基因下游的终止子片段和所述抗性基因下游的终止子片段；
[0016]Α2)以所述β-胡萝卜素生产相关的基因、所述抗性基因片段、所述β-胡萝卜素生产相关的基因上游的启动子片段、所述抗性基因上游的启动子片段、所述β_胡萝卜素生产相关的基因下游的终止子片段和所述抗性基因下游的终止子片段为模板，通过重叠PCR扩增获得基因表达模块。
[0017]根据本发明的优选实施例，所述步骤Α)中所述β-胡萝卜素生产相关的基因为crtE、crtYB 和 crtL.[0018]根据本发明的优选实施例,所述crtE、crtYB和crtl来源于红发夫酵母。
[0019]根据本发明的优选实施例，所述步骤A)中所述启动子选自ADHlp、TEFlp、TPIlp和PGKlp。
[0020]根据本发明的优选实施例，所述启动子来源于酿酒酵母。
[0021]根据本发明的优选实施例，所述步骤A)中所述终止子选自TKLlt、ADHlt、EN02t和TDH2t。
[0022]根据本发明的优选实施例，所述终止子来源于酿酒酵母。
[0023]根据本发明的优选实施例，所述抗性基因为ble基因。
[0024]根据本发明的优选实施例，所述抗性基因来源于pGAPZ α A。
[0025]本发明的有益效果:将外源基因片段同时转入酵母细胞内，利用酵母自身胞内生物质系统一步将各片段组装，并进一步同源整合到设计的染色体位置，具有简单快速高效的优点，避免了多级的克隆，也不需要依赖酶切位点，多片段共同转化，同源重组效率高，f 2周即可获得工程菌株，这种良好的酵母基因工程方法可以明显缩短工程菌构建时间。按照本发明的方法获得的基因工程菌的β_胡萝卜素的发酵产量可达到大约6mg/gDCW，具有良好的工业应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1为红发夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)的β-胡萝卜素合成途径不意图，其中，S.c代表酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae), X.d代表红发夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous), BTS1, crtE 代表四异戍二烯焦憐酸合成酶，crtl 代表八青番茄红素脱氢酶，crtYB代表八青番茄红素合酶/番茄红素环化酶。
[0027]图2为各基因模块在染色体上的整合组装顺序示意图。
[0028]图3为β-胡萝卜素生产菌的PCR鉴定结果图。
【具体实施方式】
[0029]以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。[0030]实施例1、实验方案及引物设计
[0031]本实施例的实验方案设计如下:
[0032]在酿酒酵母BY4742 (购自 EUR0SCARF，编号 Y10000，菌株信息:MAT a ；his3 Δ I ；Ieu2 Δ O ；lys2 Δ O ；ura3 Δ O)中表达来自于红发夫酵母ATCC24202的β-胡萝卜素合成途径的 3 个基因 crtE (GenBank:DQ016502.1)、crtYB (GenBank:AY177204.1)和 crtl(GenBank:AY177424.1)，并同时表达ble基因(Zeocin抗性基因)作为筛选标记，选择酵母染色体δ位点作为整合位点，各基因模块在染色体上的整合组装顺序如图2所示。将各启动子和基因分别编号，如表1所示。
[0033]表1、各启动子和基因编号
[0034]
【权利要求】
1.一种产β-胡萝卜素基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤: Α)构建基因表达模块，所述基因表达模块包括β-胡萝卜素生产相关的基因、所述β-胡萝卜素生产相关的基因上游的启动子和所述β-胡萝卜素生产相关的基因下游的终止子； B)将所述基因表达模块共转化至酿酒酵母中。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤Α)中所述基因表达模块还包括抗性基因、所述抗性基因上游的启动子和所述抗性基因下游的终止子。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤Α)中所述构建基因表达模块包括以下步骤: Al)通过PCR扩增获得所述β-胡萝卜素生产相关的基因、所述抗性基因片段、所述β-胡萝卜素生产相关的基因上游的启动子片段、所述抗性基因上游的启动子片段、所述β-胡萝卜素生产相关的基因下游的终止子片段和所述抗性基因下游的终止子片段； Α2)以所述β-胡萝卜素生产相关的基因、所述抗性基因片段、所述β-胡萝卜素生产相关的基因上游的启动子片段、所述抗性基因上游的启动子片段、所述β_胡萝卜素生产相关的基因下游的终止子片段和所述抗性基因下游的终止子片段为模板，通过重叠PCR扩增获得基因表达模块。
4.如权利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述步骤Α)中所述β-胡萝卜素生产相关的基因为crtE、crtYB和crtl。
5.如权利要求4所述的方法,其特征在于，所述crtE、crtYB和crtl来源于红发夫酵`母。
6.如权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述步骤A)中所述启动子选自ADHlp, TEFlp, TPIlp 和 PGKlp0
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述启动子来源于酿酒酵母。
8.如权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述步骤A)中所述终止子选自TKLlt、ADHlt、EN02t 和 TDH2t。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述终止子来源于酿酒酵母。
10.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述抗性基因为ble基因。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述抗性基因来源于PGAPZα A。
【文档编号】C12N1/19GK103865817SQ201210525553
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2012年12月7日 优先权日:2012年12月7日
【发明者】蒋宇, 朱丽, 高书良, 罗敏玉, 戈梅, 杨晟 申请人:上海来益生物药物研究开发中心有限责任公司, 上海工业生物技术研发中心