专利名称：一株产热稳定性β-葡聚糖酶的菌株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物技术领域，涉及一株产热稳定性β-葡聚糖酶的菌株及其应用。
背景技术：
葡聚糖主要存在于单子叶禾本科植物的种子中，如大麦、小麦、黑麦、燕麦以及稻谷等的胚乳细胞壁中均含有大量的葡聚糖。因物种不同，葡聚糖的含量也不同。β -葡聚糖是一种结构性非淀粉多糖，具有 黏性、高亲水性、高的吸水膨胀力和持水性及吸附离子性等独特的性质，这些理化特性会影响动物对饲料的利用率以及啤酒的感官指标等，给饲料行业及啤酒酿造等实际生产带来了负面影响。广义的β -葡聚糖酶是指能分解仅有以β -构型连接的多聚糖-D-葡萄糖的一类酶，包括纤维素酶(EC3. 2.1. 4)，昆布多糖酶(EC3. 2. 1.6), β -葡聚糖苷酶(EC3. 2.1. 21)，内切β-1，3-1，4-葡聚糖酶(EC3. 2.1. 73)，外切β _1，4-葡聚糖酶(EC3. 2. 1.74)和内切β-1，6-葡聚糖酶(EC3. 2. 1.75)等，其中，以内切β-1，3_1，4-葡聚糖酶(又称地衣多糖酶)的作用最为活跃。狭义的葡聚糖酶是指内切β-1，3-1，4-葡聚糖酶，此酶能够专一性地分解细菌地衣多糖和大麦中的β_葡聚糖。该酶具有严格的底物专一性，对纤维素和梭甲基纤维素(3_1，4键型)、可溶性淀粉(β-1，4-1，6键型)和蔗糖(β_1，2键型)、棉籽糖(α-1，6-β-1，2键型)都不发生作用。内切β-1，3_1，4-葡聚糖酶(简称葡聚糖酶)在自然界中广泛存在，植物、细菌、放线菌、藻类、软体动物以及昆虫等生物中都发现有葡聚糖酶的存在，但主要存在于微生物和植物中。植物来源的葡聚糖酶与细菌来源的葡聚糖酶在氨基酸排列和三维空间结构上基本没有相似性，因此在酶的性质上也有有所不同。细菌产葡聚糖酶的分子量一般为25-50kDa，最适作用pH值范围一般为5. 0-6. 8，最适作用温度范围为50° C-65° C，且来自芽孢杆菌属的β-葡聚糖酶具有良好的耐温性和作用底物专一性。至今，已有许多芽孢杆菌β -葡聚糖酶基因被克隆。除了环状芽孢杆菌β -葡聚糖酶外，所有芽孢杆菌葡聚糖酶的核苷酸和氨基酸序列都有很高的同源性。非芽孢杆菌来源的β_葡聚糖酶催化结构域与芽孢杆菌酶有很高的同源性，但它们常多出一个各具有不同功能的结构区域。大多数细菌性β_葡聚糖酶具保守的模体(DEIDIE)，位于酶的活性位点裂隙，参与酶的催化。细菌产生的内葡聚糖酶是典型的胞外酶，编码内β -葡聚糖酶的基因被克隆到大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、牛链球菌及路氏乳杆菌Laetobaeillus reuteri中，都能利用自身的启动子进行表达，宿主菌也都能识别信号肽进行胞外分泌。其外源表达基本上是Bacillus-E. coli与Trichoderma-Saccachromyces两个系统。目前，国内外对微生物来源的葡聚糖酶分子生物学上的研究已经相当深入，而主要集中在酶的规模化制备上。最近几年的报道也有很多是发掘嗜热性的产酶新菌种。国外通过蛋白质工程提高该酶的活性或热稳定性的报道比较少。反而在国内掀起了通过外源表达或蛋白质工程提高酶活或热稳定性的热潮，这是由我国的市场背景引发的现象。近几年我国的所报道的微生物产β-葡聚糖酶的酶活力已经达到甚至超过了国际水平。β -葡聚糖酶在工业化的应用要求其具有高的热稳定性。许多芽孢杆菌能产专一性降解β-葡聚糖的葡聚糖酶，且其耐高温性也比真菌及高等植物内源酶要好。并且很多芽孢杆菌属于食品级，可以直接添加至食品加工工艺中而对人体无危害。
发明内容
本发明的目的是提供一株产热稳定性β -葡聚糖酶的菌株。本发明的另一目的是提供该菌株的应用。本发明的目的可通过如下技术方案实现 —株高地芽孢杆菌(Bacillus altintudins)YC-9,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No. 6075，保藏日期为2012年5月3曰。本发明所述的保藏号为CGMCC No. 6075的高地芽孢杆菌(Bacillus altintudins)YC-9在生产热稳定性的β -1, 3-1，4-葡聚糖酶中的应用。有益效果本发明首次提供了一株来源于温泉的能够产生β -1, 3-1，4-葡聚糖酶的新菌株，并克隆得到了其酶基因。由于该酶具有较高的热稳定性，故能够为构建耐热及高产的基因工程菌株奠定基础。
图1 :反应温度对β -葡聚糖酶活性的影响图2 :Bacillus altintudins YC-9 基因组 DNA 电泳图M DNA KB Ladder ；1 :基因组 DNA。图 3 Baci I lusaltintudins YC-9 的 16S rDNA 的 PCR 扩增电泳图M DNA KB Ladder ；1 16S rDNA图4 :Bacillusaltintudins YC-9 β-glucanase 基因的扩增电泳图M DNA KB Ladder ；1 β -glucanase 基因。生物材料保藏信息本发明提供的该菌株为高地芽孢杆菌(BAcillus altintudins)YC-9,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(缩写CGMCC)，地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No. 6075，保藏日期为2012年5月3日。
具体实施例方式实施例1菌株筛选由于高分子量的大麦β_葡聚糖分子能与刚果红染料紧密结合，当菌株产生β-葡聚糖酶时周围的β-葡聚糖被降解而形成透明圈，由此可对产β -葡聚糖酶的菌株进行快速鉴定。采集的江苏省农业科学研究院及南京农业大学校园的土壤、汤山温泉及宜春某温泉的水样，经水浴(80°C )10min，稀释后涂布在分离培养基平板(分离培养基地衣多糖
0.3%，刚果红0.1%，氯化钠0.5%，琼脂2 %，pH7. O 7. 2)上，置于40°C培养箱中培养24h。挑取在分离培养基上形成透明圈的菌落在LB培养基平板上划线纯化后，点接在分离培养基平板上，37°C培养48h，挑取透明圈直径与菌落直径比值较大的菌落进行摇瓶发酵培养，在60°C下测定酶活性及热稳定性，以筛选具有较高酶活及热稳定性的β -葡聚糖酶产生菌。β -葡聚糖酶活性测定采用3，5- 二硝基水杨酸(DNS)法发酵物IOOOOr离心lOmin，取上清液用醋酸缓冲液(O. 1M，pH5. O)稀释100倍得稀释酶液，取ImL稀释酶液加入ImL预先在60°C水浴中准确保温IOmin的底物溶液(1%地衣多糖，pH5. O醋酸缓冲液配制)，60°C准确反应lOmin，加入2mLDNS沸水浴5min，用冷水快速冷却，在UV-2450紫外分光光度计测定OD值，波长540nm。空白对照管制作取稀释酶液lmL，加入DNS试剂2mL，再加 入预热的底物溶液lmL，以下步骤同上。酶单位定义为在60°C,pH5. O条件下每min从底物中释放I μ mol还原糖(以葡萄糖计)所需的酶量为一个酶活单位(U)。即X=nr/(10XM)，式中，X表示样品的酶活力(U/mL)，η表示稀释倍数，r表示由回归方程计算出的葡萄糖的含量，10为反应时间(min) ^表示葡萄糖的分子量。平行试验相对误差不得超过3%。相对酶活定义为以未经保温处理的酶液的酶活为100%，经保温处理后的酶液在常规条件下测得的酶活占未经保温处理的酶液酶活的比例为其相对酶活。反应温度对β -葡聚糖酶活性的影响及其热稳定性的初步测定以1%地衣多糖(购自爱尔兰Magezyme公司)为底物，研究不同反应温度(30° C，40° C，50° C，60° C，70° C，80° C，90° C)对 β -葡聚糖酶活性的影响。将发酵离心取得的上清液于60° C下保温IOmin (或不同时长)，然后按上述方法测定残余的酶活力，以初步检测酶的热稳定性。酶的底物专一性的检测分别以大麦β -葡聚糖、地衣多糖、昆布多糖、羧甲基纤维素为底物测定酶的底物专一性，反应条件与测定方法同前。从汤山温泉、宜春温泉水样及江苏省农科院麦田、校园土样中共挑出25株水解圈较明显的菌株，通过发酵粗酶液检测其热稳定性，最终从宜春温泉中筛到了一株热稳定性较高的菌株YC-9。以粗酶液检测其热稳定性结果见表I。结果表明菌株YC-9产β -葡聚糖酶的热稳定性较高，在60°C下稳定；在野生菌中酶活较高，酶活为±20U/mL。同时检测不同温度对酶反应活性的影响，结果见图1。结果表明菌株YC-9产β_葡聚糖酶的最适反应温度为60°C，在较宽的温度范围内酶活性较高；在反应温度超过70°C时酶活开始有较大损失。此夕卜，分别以大麦β -葡聚糖、地衣多糖、羧甲基纤维素、昆布多糖为底物检测酶的活性，结果见表2。可见，菌株YC-9产的β-葡聚糖酶具有严格的底物专一性，能水解大麦葡聚糖和地衣多糖，不能水解羧甲基纤维素和昆布多糖，由此可认定该酶为内β -1, 3-1，4-葡聚糖酶(E. C. 3. 2.1. 73.)。激将筛选到的YC-9，送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(缩写CGMCC)保藏，保藏号为CGMCC No. 6075，保藏日期为2012年5月3日。表I β -葡聚糖酶的热稳定性检测
权利要求
1.一株高地芽孢杆菌(Bacillus altintudins)YC_9,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No. 6075，保藏日期为2012年5月3日。
2.权利要求1所述的保藏号为CGMCCNo. 6075的高地芽孢杆菌(Bacillusaltintudins) YC-9在生产热稳定性的β -1, 3-1, 4-葡聚糖酶中的应用。
全文摘要
本发明属于微生物技术领域，涉及一株产热稳定性β-葡聚糖酶的菌株及其应用。一株产热稳定性β-葡聚糖酶的菌株高地芽孢杆菌(Bacillus altintudins)YC-9，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.6075，保藏日期为2012年5月3日。本发明首次提供了一株来源于温泉的能够产生β-1,3-1,4-葡聚糖酶的新菌株，并克隆得到了其酶基因。由于该酶具有较高的热稳定性，故能够为构建耐热及高产的基因工程菌株奠定基础。
文档编号C12R1/07GK103013873SQ20121052769
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月10日 优先权日2012年12月10日
发明者别小妹, 毛淑蕊, 陆兆新, 吕凤霞, 张充 申请人:南京农业大学