专利名称：一种最适温度提高的脂肪酶突变体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种脂肪酶突变体，特别是一种最适温度提高的脂肪酶突变体及其应用。
背景技术：
脂肪酶(EC 3.1.1. 3)不仅能催化油脂水解，也能在非水相中催化酯合成、转酯化、酸解等反应，被广泛地应用于化学，食品，制药和洗涤剂或生物能源工业中。微生物是工业脂肪酶的一个重要来源，而根霉又是微生物脂肪酶的重要生产菌。如今，已有超过30种根霉脂肪酶实现了商品化生产。根霉脂肪酶常用于油脂加工中。但是油脂加工通常需要在较高温度下进行，而根霉脂肪酶属于中温脂肪酶，最适温度为40° C，限制了其应用范围，降低了催化效率。·蛋白质理性设计是改变酶性质的有利工具，它建立在人们对酶结构一功能关系和催化机理的了解上，对选定的位点进行突变，从而优化酶分子的各种性质。进年来，随着结构生物学、分子动力学模拟、蛋白质折叠机制等领域的发展，酶的理性设计已经在酯酶和脂肪酶性质改造领域取得的成功，主要集中于提高酶的催化反应活性，改进底物特异性，提高热稳定性，对映立体选择性等方面(Bornscheuer U T et al. TrendsBiotechnol, 2002, 20(10):433-437。发明人在前期研究中成功从酿造浓香型大曲酒的酒曲中筛选到一株高产脂肪酶的华根霉(Rhizopus chinensis)CCTCC M 201021菌株，并从该菌株中首次克隆得到脂肪酶基因序列，并实现该脂肪酶在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中的高水平分泌表达(YuXiao-Wei et al. J Mol Catal B:Enzym, 2009，57:304-311)，应用研究表明该酶在烘焙食品工业、皮革脱脂以及造纸废水处理中都具有非常广阔的应用前景。本发明以华根霉脂肪酶基因为模板，利用蛋白质理性设计技术获得了最适温度提高的脂肪酶突变体，提高了该酶的应用范围与催化效率。酶的最适温度可以通过将酶在相同的标准条件下测定催化活力来测定，酶催化活力最高时的反应温度即为该酶的最适温度。定义氨基酸和DNA核酸序列的命名法使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，用三字母代码形式。DNA核酸序列采用公认IUPAC命名法。脂肪酶突变体的标识采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示脂肪酶突变体中突变的氨基酸。Asp310Val，表示位置310的氨基酸由亲本脂肪酶的Asp替换成Val。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供一种最适温度提高的脂肪酶突变体，在GenBankXXXXX公布的脂肪酶脂肪酶基因序列第310的氨基酸由亲本脂肪酶的Asp突变为Val。上述突变体的获得方法为以GenBank EF405962公布的脂肪酶脂肪酶基因序列为出发基因，将其第310位的氨基酸由Asp替换成Val。产所述脂肪酶突变体的基因工程菌或转基因细胞系也为本发明要求的保护范围。所述产脂肪酶突变体的基因工程菌的构建方法，其特征在于包括如下步骤I)采用化学全合成或PCR方法克隆编码权利要求1所述脂肪酶突变体基因；2)将步骤I)获得的脂肪酶基因连接到大肠杆菌表达载体，得到重组表达载体；3)将步骤2)获得的重组表达载体转化毕赤酵母GS115得到基因工程菌。 所述表达载体为pPIC9K，pPIC3. 5K, pPICZ α 或 pPICZ。本发明要解决的另一个技术问题是提供一种发酵生产上述脂肪酶突变体的方法，以产脂肪酶突变体基因工程菌为生产菌株，按10% (V/V)接种量接入25mL BMGY培养基中，30°C振荡培养16 20h至0D_为2 6，离心收集菌体，用BMMY培养基稀释至OD6tltl为1，每隔24h添加O. 5%的甲醇诱导表达，培养3-4d后，收集发酵上清液；将发酵上清液经过IOKD超滤膜浓缩,SP-Sepharose FF强阳离子交换层析和Phenyl-Sepharose 6FF疏水色谱柱层析后得到纯化的突变脂肪酶活性组分。氨基酸突变体的选择依据主要通过提高α螺旋的稳定性来提高最适温度，该突变位点Asp310Val位于α螺旋上，由于疏水作用对于α螺旋的稳定很关键，所以亲水氨基酸Asp替换成疏水氨基酸Val后，很可能增强了螺旋内部疏水侧链的相互作用。在此螺旋中，从Ala304位点到Val309位点的6个氨基酸均为疏水性氨基酸，因此Asp310替换成Val可能提高了螺旋内部的疏水相互作用。另外，该位点的替换使得相邻的原本不在此螺旋上的Serfll也加入了该螺旋结构中。结果α螺旋变得稳定，酶的稳定性得到了提高，表现为最适温度提高。 用于表达所述的脂肪酶突变体的表达载体为pPIC9K，pPIC3. 5K，pPICZ α，pPICZ ；用于所述的表达载体转化的微生物宿主细胞为毕赤酵母。与亲本华根霉脂肪酶相t匕，所述脂肪酶突变体的最适温度获得了提高，最适温度提高可提高达5度。亲本华根霉脂肪酶的最适温度为40° C。本发明的有益效果运用分子生物学方法对亲本华根霉脂肪酶进行定点突变，获得脂肪酶突变体，脂肪酶突变体的最适温度提高了 5度，具有重要的工业应用价值，可以用于油脂加工、合成生物柴油、面包烘焙等领域。
具体实施例方式实施例中涉及到的培养基及试剂配方如下LB液体培养基蛋白胨I %，酵母提取物O. 5%, NaCl I %，pH7. O。YPD(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium): Yeast Extract I % ,Trypton2%，DextroseZ1^,制作平板时加入Agar 2%。121° C高压灭菌20min。用于筛选G418抗性时加入G418至终浓度为O. 25mg/mL-l. Omg/mL,即YPD-G418平板。BMGY(Buffered Glycerol-complex Medium):Yeast Extract I % ,Trypton2% , YNB1. 34% , Biotin 4X 10_5% , Glycerol I % ,憐酸钾溶液 pH 6. 0、100mmol/L。BMMY(Buffered Methano1-compIex Medium): Yeast Extract I % ,Trypton2% , YNB1. 34% , Biotin 4X ICT5%，Methanol 0. 5% ,憐酸钾溶液 100mmol/L。培养基中的单位为％ (ff/V)
实施例1最适温度提高的脂肪酶突变体一种最适温度提高的脂肪酶突变体，在GenBank EF405962公布的脂肪酶脂肪酶基因序列第310的氨基酸由亲本脂肪酶的Asp突变为Val。实施例2、表达脂肪酶Asp310Val点突变体的酵母。本发明脂肪酶突变体基因可以通过化学全合成或PCR方法获得，下面以PCR方法为例进行介绍利用重叠延伸PCR技术在体外向华根霉脂肪酶基因proRCL引入核苷酸突变。反应条件如下反应条件1:
5 X Prime STAR*. Buffer (Mg2' plus )IOpL
dNTP Mixture (各 2.5 mmol/L)4μ1
SObpFNEW (20 mmol/L)I pL
proRCLD 190VR (20 mmol/L)I pL
pPIC9K-proRCL(携带有华根裕脂肪11 丙proRCL的质粒)1
PrimeSTAR· HS DNA Polymerase (2.5 U/pL)0.5μ
(JdH2Otip to 50 iiL其中，上游引物50bpFNEW和下游引物proRCLD 190VR序列为50bpFNEW:5’-AAAGAAGAAGGGGTATCTCTC-3’ ;proRCLD190VR:5’-TTCCGGTGCTAACAACGTAGTAAG-3’ 。PCR 扩增条件98。C IOs ;98。C 10s，56。C 15s，72。C lmin，30 个循环；72° C IOmin0扩增产物经DNA纯化试剂盒纯化得到片段A。反应条件2
SxPrimeSTAReBBfifer (Mg2'pies )IOpL
dNTP Mixture (各 2.5 mmol/L)4μ1
50bpRNEW (20 mmol/L)I pL
proRCLD 190VF (20 mmol/L)I pL
pPIC9K-proRCL(携带有华根毐脂肪proRCL的质粒)
PrimeSTAR* HS DNA Polymerase (2.5 /μ )OJpL
AiE1OUp to 50 |iL
其中，上游引物50bpRNEW和下游引物proRCLD 190VF序列为50bpRNEW:5’-CCCAACTTGAACTGAGGAAC-3’ ;proRCLDI90VF:5’-TTACTACGTTGTTAGCACCGGAA-3’ 。PCR 扩增条件98。C IOs ;98。C IOs, 56° C 15s, 72° C 30s，30 个循环；72。CIOmin0扩增产物经DNA纯化试剂盒纯化得到片段B。将片段A、B等摩尔加入PCR体系中，不加引物，交错延伸5个循环，扩增程序为98。ClOs ；98° C 10s，56。C 15s，72。C Imin 共 5 个循环。然后加入引物 50bpFNEW 和50bpRNEW，进行 30 个循环的扩增，扩增程序为98° C IOs ；98° C10s，55。C15s，72° C1. 5min,共30个循环；72° C延伸lOmin。PCR扩增产物利用DNA试剂盒进行产物纯化得到
脂肪酶点突变基因。 限制性内切酶Avr II和Not I分别对突变基因和质粒pPIC9K进行酶切，连接，获得包含突变体基因的表达质粒，转化至E. coli JM109感受态细胞。涂布于LB (含100 μ g/μ L的Amp)平板。生长12h后，将转化子转移至LB液体培养基中培养，获得表达质粒。测定脂肪酶核苷酸序列(由上海生工生物工程技术服务有限公司测序)，利用三联体密码子推测脂肪酶的氨基酸序列，脂肪酶突变体的氨基酸取代发生在310，由Asp突变为Val。将表达质粒经限制性内切酶SalI线性化后，电转化毕赤酵母GSl 15感受态细胞。将转化液涂布于YPD-G418平板上，30° C培养2d，挑取单克隆，提取基因组，PCR验证脂肪酶突变基因正确整合入基因组中，获得表达脂肪酶突变体的毕赤酵母。实施例3脂肪酶突变体的最适温度测定为测定脂肪酶的最适温度，需要对酶进行分离纯化。摇瓶发酵接种量10% (V/V)，25mL BMGY培养基中，30°C振荡培养16 20h至OD600为2 6，离心收集菌体，用BMMY培养基稀释至0D_为1，每隔24h添加O. 5%的甲醇诱导表达，培养3-4d后,收集发酵上清液。分离纯化将突变菌株的发酵上清液经过IOKD超滤膜浓缩，SP-Sepharose FF强阳离子交换层析和Phenyl-Sepharose 6FF疏水色谱柱层析后得到纯化的突变脂肪酶活性组分。具体操作参考文献 Yu Xiao-Wei et al. J Mol Catal B:Enzym, 2009，57:304-311。最适温度的测定方法脂肪酶活力的测定方法为pNPP 法(Pencreach G et al. Enzyme and MicrobialTechnol. 1996，18:417-422.)。酶活的定义为标准反应条件下每分钟产生I μ mo I对硝基苯酚的酶量为一个脂肪酶水解酶活国际单位。脂肪酶最适温度的测定方法为将0.25U酶液分别于20° C 50° C下测定酶活力，以测得的最高酶活为100%，其他酶活折算成相对酶活百分比。相对酶活100%对应的反应温度为酶的最适温度，脂肪酶突变体最适温度提高度数如表I所示。表I脂肪酶突变体及其最适温度
权利要求
1.一种最适温度提高的脂肪酶突变体，其特征在于在GenBank EF405962公布的脂肪酶基因序列第310的氨基酸由Asp替换成Val。
2.一种获得权利要求1所述脂肪酶突变体的方法，其特征在于以GenBank EF405962公布的脂肪酶脂肪酶基因序列为出发基因，将其第310位的氨基酸由Asp替换成Val。
3.产权利要求1所述脂肪酶突变体的基因工程菌或转基因细胞系。
4.权利要求3所述产脂肪酶突变体的基因工程菌的构建方法，其特征在于包括如下步骤1)采用化学全合成或PCR方法克隆编码权利要求1所述脂肪酶突变体基因；2)将步骤I)获得的脂肪酶基因连接到大肠杆菌表达载体，得到重组表达载体；3)将步骤2)获得的重组表达载体转化毕赤酵母GS115得到基因工程菌。
5.权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于所述表达载体为pPIC9K，pPIC3.5K， pPICZa 或 pPICZ。
6.应用权利要求4所述基因工程菌发酵生产脂肪酶突变体的方法，其特征在于以产脂肪酶突变体基因工程菌为生产菌株，按10% (V/V)接种量接入25mL BMGY培养基中，30°C 振荡培养16 20h至0D600为2 6，离心收集菌体，用BMMY培养基稀释至0D600为I，每隔24h添加O. 5%的甲醇诱导表达，培养3-4d后，收集发酵上清液；将发酵上清液经过IOKD 超滤膜浓缩，SP-Sepharose FF强阳离子交换层析和Phenyl-Sepharose 6FF疏水色谱柱层析后得到纯化的突变脂肪酶活性组分。
7.权利要求1所述脂肪酶突变体应用于油脂加工、合成生物柴油或面包烘焙领域。
全文摘要
本发明公开了一种最适温度提高的脂肪酶突变体，属于酶的基因工程技术领域。本发明公开了由华根霉(Rhizopus chinensis)CCTCC M201021脂肪酶作为亲本，经分子生物学技术而获得的最适温度提高的脂肪酶突变体，突变体的突变氨基酸为Asp310Val。该突变体的最适温度较亲本华根霉脂肪酶得到了提高，具有重要的工业应用价值。
文档编号C12N1/19GK102994471SQ20121052783
公开日2013年3月27日 申请日期2012年12月10日 优先权日2012年12月10日
发明者喻晓蔚, 徐岩, 吴厚军 申请人:江南大学