专利名称：萝卜霜霉病抗性基因紧密连锁的分子标记的制作方法
萝卜霜霉病抗性基因紧密连锁的分子标记技术领域
本发明属于作物遗传育种领域，涉及萝卜霜霉病抗性基因紧密连锁的分子标记。
技术背景
萝卜(Raphanus sativus L.)又名莱菔,是一种重要十字花科根菜类蔬菜作物,我国萝卜种质资源丰富，栽培历史悠久；萝卜主要以膨大的肉质直根供食用，具有较高的营养价值和食疗功效，深受人们喜爱(汪隆植与何启伟主编，中国萝卜，北京科学技术文献出版社，2005)。
霜霉病(downy mildew)是萝卜生产上一种危害性很大的病害，该病病原菌是鞭毛菌亚门卵菌纲霜霉属的一种专性活体寄生菌，该病在世界各地均有分布。近几年，萝卜霜霉病的病害发生严重，尤其是在温度适宜、潮湿的环境下更易发生，南方适温高湿的环境为霜霉菌的生活提供了适宜条件，春季保护地栽培更是萝卜霜霉病的高发季节。萝卜霜霉病发病部位多为植株叶片、茎部、根部、种株花器官及种荚，在萝卜整个生长时期(子叶期至采种期)都容易发生，对萝卜的品质、产量以及良种繁育等造成了严重影响。
分子标记技术已经被广泛应用于蔬菜作物遗传育种研究中。成功进行重要性状基因紧密连锁的分子标记鉴定，在品种选育过程中可以跟踪、检测特定性状基因，有效减少或免除传统育种中繁杂的性状鉴定工作，还可以通过标记辅助选择，把多个抗病等重要性状功能基因聚合到同一优良品系中。相关序列扩增多态性(sequence related amplified polymorphism, SRAP)是一种新型的基于PCR的遗传标记系统,具有简单、高效、重复性高等优点(Li G&Quiros CF. Sequence-related amplified polymorph ism (SRAP), a new marker system based on a simple PCR reaction:its application to mapping and gene tagging in Brassica. Theoretical and Applied Genetics，2001，103:455-461 )。目前， SRAP已成功应用于作物的品种鉴定、遗传连锁图谱构建以及性状遗传标记分析工作中。
混合分离分析(Bulked SegregantAnalysis, BSA)策略是快速获得与目标性状基因紧密连锁分子标记的有效方法，尤其是对于尚无遗传连锁图或连锁图饱和程度较低的植物(Michelmore RffjParan I, Kesseli RV. Identification of markers linked to disease resistance genes by bulked segregant analysis:A rapid method to detect markers in specific genomic regions by using segregating populations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991，88:9828-9832)。在分离群体中选择目标性状极端差异的植株构建两个DNA 池(bulk)，在两个基因池间表现出多态性的DNA标记，有可能与目标基因连锁。目前，利用 BSA策略已经标记和定位了许多重要的质量性状基因，如莴苣抗霜霉病基因、水稻抗瘿蠓基因以及抗稻瘟病基因等(方宣钧，吴为人，唐纪良.作物DNA标记辅助育种.北京科学出版社，2001)。
抗病育种是现代作物遗传育种领域重要的研究方向，选育抗病品种是当前控制作物病害最经济、最有效的途径。抗病品种培育过程中，抗性鉴定是关键环节之一。萝卜霜霉病菌为专性寄生真菌，萝卜霜霉病抗性鉴定评价涉及到病菌收集、活体保存、接种、植株管理、病情调查等多个步骤，传统接种鉴定不仅费时，而且受接种孢子液浓度、接种环境条件等因素影响，严重影响了植株抗性鉴定结果准确性与抗性选择效率。通过筛选与萝卜霜霉病抗性基因紧密连锁的分子标记，在苗期就可利用标记进行霜霉病抗性鉴定，一般广2 天即可获得结果，而且不受环境条件的影响，结果快速、准确。这种基于分子标记的基因型选择(标记辅助选择)克服了许多基于表型选择方法的缺点，可以明显提高目标性状选择效率，显著缩短育种年限，加快抗病新品种培育进程。发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的上述不足，提供一种萝卜霜霉病抗性基因紧密连锁的分子标记。
本发明的另一目的是提供该分子标记的引物。
本发明的又一目的是提供该分子标记的应用。
本发明的目的可通过如下技术方案实现
—种萝卜霜霉病抗性基因紧密连锁的分子标记Em9/ga2437(!,所述的分子标记Em9/ ga2437Q由序列如SEQ ID NO. I所示的正向引物Em9和序列如SEQ ID NO. 2所示的反向引物 ga24通过PCR扩增具有霜霉病抗性的萝卜基因组DNA得到，所述的具有霜霉病抗性的萝卜选自抗病亲本‘NAU-dhp08’。
与萝卜霜霉病抗病基因紧密连锁的分子标记,所述的SRAP分子标记Em9/ga2437(l, 其是用下述方法得到的
(I)选取高代自交系抗病亲本‘NAU_dhp08’(朱长志，等.利用种子蛋白SDS — PAGE技术进行抗热萝卜种质鉴定.中国蔬菜，2010(8):21-25)，和高代自交系感病亲本‘秋田半节青’(周志国，等.不同萝卜品种游离小孢子的诱导及培养体系优化研究.西北植物学报，2007，27(1):33-38)，田间授粉有性杂交产生F1, F1自交产生匕，同时F1回交产生BC 群体；
(2)采用人工接种方法对F2单株进行抗病、感病鉴定，统计抗、感分离情况；
(3)采用CTAB法提取萝卜抗病亲本自交系‘NAU_dhp08’和感病亲本‘秋田半节青'F1及F2单株基因组DNA;
(4)采用 BSA (Bulked SegregantAnalysis)法,在 F2 中选取 10 株高抗和 10 株高感单株，将其基因组DNA分别进行等量混合，构建抗池Bk和感池Bs ；
(5)米用SRAP分子标记方法进行萝卜霜霉病抗性分子标记的筛选。首先利用未本和抗、感池(Bulk)基因组DNA进行SRAP引物的筛选，接着将筛选出的多态性引物在组成抗感池的20个单株基因组DNA中进一步验证，最后在F2单株中利用验证的多态性引物进行 PCR扩增，对单株进行标记基因型分析，统计多态性引物产生标记条带的分离情况；
(6)根据F2单株标记基因型分析，结合人工接种鉴定结果，采用JoinMap3. O生物软件进行遗传连锁分析，设置LOD最小值为3. O,采用kosambi函数计算遗传距离，发现SRAP引物Em9/ga24组合产生大小为370bp的Em9/ga2437(l标记与萝卜霜霉病抗性基因紧密连锁，遗传距离为2. 3cM。产生标记Em9/ga2437Q的SRAP引物为Em9 (正向引物) 5’ GACTGCGTACGAATTCTA3’，ga24 (反向引物)5’ TTTTGGGACTGATAGCATTC3’。
SRAP-PCR 反应体系为(IOyL) 1XPCR buffer, 3. OmM Mg2+, O. 20mM dNTPs,O. 5U Taq DNA聚合酶，每个引物O. 30 μ M和模板DNAlOng。反应程序为94 °C 3min ; 94°C 60s, 35°C 60s, 72°C 90s, 5 个循环；94°C 60s, 50°C 60s, 72°C 90s, 33 个循环；72°C延伸 7min。PCR扩增产物检测在8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺(Acr):甲叉双丙烯酰胺 (Bis)(质量比)=29:1)上进行，电极缓冲液为I X TBE，恒定电压150V，凝胶染色采用硝酸银染色。
本发明所述的萝卜霜霉病抗性基因紧密连锁的分子标记Em9/ga2437Q的引物组合 Em9/ga24，正向引物Em9序列如SEQ ID NO. I所示，反向引物ga24序列如SEQ ID NO. 2 PJf/Jn ο
本发明所述的萝卜霜霉病抗性基因紧密连锁的分子标记Em9/ga2437(l的检测方法， 包含如下步骤
(I)以被检测的萝卜基因组DNA为模板，以权利要求2所述的引物组合Em9/ga24 进行PCR扩增；
(2)能够扩增出370bp特异条带的，说明存在萝卜霜霉病抗性基因紧密连锁的分子标记Em9/ga2437(l ;未扩增出370bp特异条带的，说明不存在萝卜霜霉病抗性基因紧密连锁的分子标记Em9/ga2 4370。
其中，所述的PCR 扩增，其反应体系lXPCRbuffer，3. OmM Mg2+,O. 20mM dNTPs, O. 5U Taq DNA聚合酶，每个引物O. 30 μ M和模板DNAlOng，总体系10 μ L ;反应程序为 940C 3min ；94°C 60s, 35°C 60s, 72°C 90s, 5 个循环；94°C 60s, 50°C 60s, 72°C 90s, 33 个循环； 72°C延伸7min ;扩增产物检测在8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺(Acr):甲叉双丙烯酰胺(Bis)(质量比)=29:1)上进行，电极缓冲液为150伏，凝胶采用硝酸银染色。
本发明所述的分子标记Em9/ga2437(l在萝卜霜霉病抗性鉴定或抗性基因检测中的应用。
一种萝卜霜霉病抗性基因鉴定的方法，包括使用本发明所述的分子标记Em9/ ga24370的步骤。
本发明所述的分子标记Em9/ga2437(!在萝卜辅助育种中的应用。
一种萝卜辅助育种方法，包括检测本发明所述的分子标记的步骤。
有益效果
霜霉病是萝卜生产上一种重要病害，严重影响了萝卜的产量与品质。本发明涉及萝卜霜霉病抗性基因紧密连锁的分子标记方法，目的是针对传统的萝卜霜霉病抗性育种过程中抗性鉴定程序繁琐、结果易受环境条件影响等缺点，通过遗传分析筛选出萝卜霜霉病抗性基因紧密连锁的分子标记，以用于快速、准确鉴定材料霜霉病抗性，大大提高萝卜抗霜霉病品种的选择效率，加快萝卜高抗霜霉病新品种选育进程。其主要优点是
(I)分子标记稳定准确。获得的萝卜抗霜霉病基因紧密连锁的SRAP标记是基于 PCR的DNA分子标记。该DNA标记稳定、简便，利用该DNA标记可快速、准确鉴定出萝卜霜霉病抗性基因存在与否，标记辅助选择不受植株生长阶段与环境条件的影响。
(2)显著提高萝卜霜霉病抗性选择效率。常规萝卜霜霉病抗性育种过程中，抗性鉴定步骤繁琐，工作量大，鉴定结果易受环境条件影响，费时费工。通过利用萝卜霜霉病抗性基因紧密连锁的分子标记，可以有效克服传统的霜霉病抗性接种鉴定结果易受环境影响的5局限；而且可以在苗期鉴定萝卜材料霜霉病抗性，一般1-2天即可获得结果，大大缩短了萝卜霜霉病抗性鉴定时间，明显提高萝卜霜霉病抗性选择效率，显著加快萝卜霜霉病抗性品种选育进程。
图I :在亲本及抗感池中筛选萝卜霜霉病抗病基因紧密连锁标记Em9/ga2437Q的电泳图
P1 :抗病亲本NAU_dhp08 ；P2 :感病亲本‘秋田半节青’ ；BE :抗病池；BS :感病池；箭头代表的是亲本间及抗感池间的特异标记。
图2 :在F2群体中检测萝卜霜霉病抗性标记Em9/ga2437(l的SRAP电泳图谱
M100bp DNAladder (分子量标准)；R :有特异带的F2抗病单株；S :没有特异带的 F2感病单株。箭头代表的是抗感单株间的特异标记。
具体实施方式
实施例I
I筛选萝卜抗感材料，构建萝卜霜霉病抗性遗传研究群体
选取经多年田间自然鉴定的高代自交系抗病亲本‘NAU_dhp08’和高代自交系感病亲本‘秋田半节青’，有性杂交产生F1, F1自交产生F2，同时F1回交产生BC。
2单株霜霉病抗性鉴定
将采回的萝卜霜霉病叶表面着生的霉层及其附着物用自来水冲洗干净，再用蒸馏水冲洗，放置于黑暗条件下20°C保湿(RH=95%，将病叶放在培养皿中，叶片上下铺上湿润的吸水纸或滤纸)24h，用湿棉球将新产生的孢子囊轻轻剥落于蒸馏水中制成悬浮液，通过显微镜观察其孢子的形态，并用血球计数板计算其孢子浓度，最后稀释至I X IO5个孢子/mL， 最后加入标定体积的O. 1%的吐温20，即制备成接种液。在幼苗4叶期采用喷雾法单叶接种，接种量为150-200 μ L/株，接种后黑暗保湿24h后(用黑色PE袋罩住)，转移至自然条件下管理，I周后调查各单株发病情况，利用卡方测验分析霜霉病抗性遗传规律，分析发现正反交F1群体全部显示抗性，其与抗性亲本回交产生的BC后代单株60株全部为抗病，与感病亲本回交产生的BC后代单株为抗病29株，感病31株，X 2检验其分离比例符合1:1 ;同时对F2群体中238个单株进行编号，鉴定结果显示抗病有179株，感病有59株，X 2检验其符合3:1分离比，符合单显性基因遗传模式。
3采用改良的CTAB法提取萝卜基因组DNA (Liu L，Guo W，Zhu X，Zhang T.Inheritance and fine mapping of fertility-restoration for cytoplasmic male sterility in Gossypium hirsutum L. Theor Appl Genet, 2003，106:461-469),分别提取萝卜抗病亲本‘NAU-dhp08’和感病亲本‘秋田半节青’及F2单株基因组DNA。
4抗感池(Bulk)的构建
米用BSA (Bulked SegregantAnalysis)法，在F2中各取10个高抗单株和10个高感单株的基因组DNA，进行等量混合，构建抗池(Bk)和感池(Bs)用于SRAP引物的多态性筛选。在亲本及抗感池中筛选萝卜霜霉病抗病基因紧密连锁标记Em9/ga2437(l的电泳图见图I。
5米用SRAP标记技术进行分析
(I) SRAP标记PCR反应
反应体系为萝卜基因组 DNA (lOng/μ L) l.OyL, 10XPCR Bufferl. O μ L, MgCl2(25mM)l. 2μ L,dNTP (10mM)0. 2 μ L，每个引物(10 μ Μ)各 O. 3 μ L，Taq DNA 聚合酶(5U/μ L)O. I μ L, ddH205. 9 μ L,总体系 10 μ L。
反应程序为94 0C 3min ；94 °C 60s, 35 °C 60s, 72 °C 90s，5 个循环；94 °C 60s,50°C 60s, 72°C 90s，33 个循环;72°C延伸 7min。
(2)扩增产物电泳检测
取扩增产物2.5 μ L，于8%的非变性聚丙烯胺凝胶(Acr:Bic (质量比)=29:1)电泳，电极缓冲液为I X 150V，具体步骤
I)洗净玻璃板，晾干后装板，保证玻璃板不漏胶；
2)8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶的制备(45mL)
30%Acr:Bis(JiliM 比 29:1) 11.97mL5χΤΒΕ 9mLddH20 23.45mLTEMED 36μ 10%AP 0.54mL
3)凝胶溶液配好后，均匀的倒入两块玻璃板中间，将梳子垂直插入胶中(注意防止灌胶过程中产生气泡)，让其充分凝固；
4)待胶凝固好后装电泳槽，倒入IXTBE电极缓冲液，于90V稳压下预电泳15 30min;
5)扩增产物加3 μ L溴酚蓝缓冲液，混匀，每加样孔上样量3. 5 μ L ;
6) 150V稳压下电泳2. 5h左右；
7)电泳完毕后将玻璃板从电泳槽中取出，剥下凝胶；
8)固定固定液(10%乙醇，O. 5%乙酸)固定15 20min，蒸馏水洗I 2次；
9)染色银染液(O. 2%AgN03)，银染15 20min，蒸馏水快速洗2次；
10)显色显色液(I. 5%Na0H, O. 4%甲醛溶液，O. 002%Na2S203)，显至条带清晰；
11)记录结果并照相。
(3)实验结果记录
利用SRAP引物Em9/ga24引物组合在抗病后代单株中能观察到一条分子量370bp的特异条带Em9/ga2437CI(图2),多次重复,均能稳定出现,而在感病单株中却没有此条带。 说明该特异条带与萝卜霜霉病抗性相关。
Em9/ga24 引物序列为Em9 5’GACTGCGTACGAATTCTA3’ (SEQ ID NO. I)
ga24 5’ TTTTGGGACTGATAGCATTC3’ (SEQ ID NO. 2)
6萝卜霜霉病抗性基因的SRAP标记鉴定
以引物Em9/ga24对杂交后代238个单株进行扩增，结果179个抗病单株存在特异条带；2个单株能够扩增出此特异条带，但表现为感病，这种表型与标记基因型差异推测是由于染色体交换引起的；其余57个感病单株没有扩增出此特异条带。进一步表明此SRAP
标记Em9/ga2437(l与萝卜霜霉病抗性基因紧密连锁，可以成功应用于萝卜种质材料霜霉病抗性鉴定。
权利要求
1.一种萝卜霜霉病抗性基因紧密连锁的分子标记Em9/ga2437(l，其特征在于所述的分子标记Em9/ga24370由序列如SEQ ID NO. I所示的正向引物Em9和序列如SEQ ID NO. 2所示的反向引物ga24通过PCR扩增具有霜霉病抗性的萝卜基因组DNA得到，所述的具有霜霉病抗性的萝卜选自抗病亲本‘NAU-dhp08’。
2.权利要求I所述的萝卜霜霉病抗性基因紧密连锁的分子标记Em9/ga2437(l的引物组合Em9/ga24,其特征在于正向引物Em9序列如SEQ ID NO. I所示，反向引物ga24序列如SEQID NO. 2 所示。
3.权利要求I所述的萝卜霜霉病抗性基因紧密连锁的分子标记Em9/ga2437(l的检测方法，其特征在于包含如下步骤 Cl)以被检测的萝卜基因组DNA为模板，以权利要求2所述的引物组合Em9/ga24进行PCR扩增； (2)能够扩增出370bp特异条带的，说明存在萝卜霜霉病抗性基因紧密连锁的分子标记Em9/ga2437(l ;未扩增出370bp特异条带的，说明不存在萝卜霜霉病抗性基因紧密连锁的分子标记 Em9/ga2437(l。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于所述的PCR扩增，其反应体系IXPCR buffer, 3. OmM Mg2+, O. 20mM dNTPs,0. 5U Taq DNA 聚合酶，每个引物 0· 30 μ M 和模板 DNAlOng，总体系 10 μ L ;反应程序为94°C 3min ；94°C 60s, 35°C 60s, 72°C 90s，5 个循环；94°C 60s, 50°C 60s, 72°C 90s，33个循环；72°C延伸7min ;扩增产物检测在8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行，电极缓冲液为I X150伏，凝胶采用硝酸银染色。
5.权利要求I所述的分子标记Em9/ga2437(l在萝卜霜霉病种质材料抗性鉴定或抗性基因检测中的应用。
6.一种萝卜霜霉病抗性鉴定的方法，其特征在于包括使用权利要求I所述的分子标记Em9/ga2437(l 的步骤。
7.权利要求I所述的分子标记Em9/ga2437(!在萝卜霜霉病抗性标记辅助育种中的应用。
8.一种萝卜霜霉病抗性标记辅助育种方法，包括检测权利要求I所述的分子标记的步骤。
全文摘要
本发明属于作物遗传育种领域，公开了萝卜霜霉病抗性基因紧密连锁的分子标记。本发明采用SRAP分子标记方法对高抗霜霉病萝卜亲本(NAU-dhp08)、高感霜霉病萝卜亲本(秋田半节青)，以及抗、感亲本杂交配制的F2群体单株进行标记基因型分析，通过对F2单株抗性表型与标记基因型连锁分析，鉴定出370bp紧密连锁的抗性标记Em9/ga24370，抗性位点与标记间遗传距离为2.3cM。通过本发明提供的分子标记方法可用于萝卜霜霉病抗性育种中标记辅助选择，快速准确鉴定萝卜植株霜霉病抗性，克服了常规抗性鉴定方法工作量大、周期长、结果易受环境影响等局限，可以明显提高抗性基因型选择效率，加快萝卜高抗霜霉病新品种选育进程。
文档编号C12Q1/68GK102978207SQ20121052807
公开日2013年3月20日 申请日期2012年12月11日 优先权日2012年12月11日
发明者柳李旺, 徐良, 蒋秋玮, 武剑, 龚义勤, 高相敏 申请人:南京农业大学