专利名称：一种蛋白质泛素化快速检测载体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种泛素化检测载体，特别是一种可用于泛素化快速检测的载体，属于分子生物学领域。
背景技术：
泛素(ubiquitin, ub)—种由76个氨基酸残基组成的低分子量的蛋白质,其因广泛存在于真核细胞及组织中而得名。泛素化(ubiquitination)是一种重要的翻译后修饰作用，是指一个或多个泛素分子在一系列酶的催化作用下与其他蛋白质共价结合的过程。转录调节、蛋白质磷酸化及泛素化调节是调控细胞内蛋白质表达水平及功能的重要途径。泛素化调控涉及到泛素-蛋白酶降解途径(ubiquitin-protease degradation),即被泛素修饰的蛋白质受到蛋白酶的降解。但是也有些泛素化与蛋白质的稳定性有关。因此，如何快捷、准确的获知蛋白质的泛素化及泛素化水平具有重要的意义。
发明内容
本发明要解决的问题是提供一种用于快捷简便地检测蛋白质泛素化及其亚细胞定位的载体。该载体具有两套启动子-终止子序列(TEF启动子-ADHl终止子和GPD启动子-CYCl终止子)及融合基因GN-UBI3和MCS-GC，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。使用者只需将待研究蛋白质的编码基因去掉终止密码子后克隆至MCS即可实现共表达载体的构建。关于pYL16使用范围，由于pYL16的选择性标记为URA3，理论上，任何URA3缺陷型酵母菌株均可作为PYL16的表达宿主。本发明使用CEN. PK2-lD(MAta ura3_52; trp 1-289;leu2-3, 112;his3A l；MAL2-8c；SUC2 ;购自 EUROSCARF, acc. no. 30000B)作为宿主细胞来验证pYL16的可靠性。融合基因GN-UBI3及MCS-GC分别被插入至基础质粒pY26的GPD启动子-CYCl终止子之间和TEF启动子-ADHl终止子之间。在GN-UBI3的上下游分别引入限制性酶切位点BamH I, Xho I，通过插入消除了ΡΥ26多克隆位点，其中包括限制性酶切位点Xma I、Ava I,Sma I、Pst I,EcoR I,Hind III、Cla I ;在MCS-GC的上下游分别引入限制性酶切位点Not I、Bgl II，且通过插入质粒引入了新的MCS，其中包括的限制性酶切位点为Not I、EcoR I、Sal I、Sma I、Ava I、Xma I、SacII。增强型绿色荧光蛋白EGFP的拆分位点为158-159位氨基酸之间，即GN为EGFP的1-158位氨基酸组成的片段；GC为EGFP的159-238位氨基酸组成的片段。GN-linker-UBI3 及 MCS-liner-GC (本研究一般简写为 GN-UBI3 及 MCS-GC)中的linker结构由17个氨基酸组成,序列如SEQ ID NO. 2所示。本发明还提供了一种共表达质粒的构建方法，以该质粒作为基础质粒可快速便捷地构建蛋白质泛素化研究中的共表达系统。包括(1)选择EGFP的拆分位点，以将其拆分为GN和GC两个片段，拆分位点为158-159位氨基酸之间；(2)选择linker结构，以为GN、GC重新组装成完整的EGFP提供足够的空间；(3)通过融合PCR的方法，构建融合基因GN-UB13及MCS-GC，同时在上下游引入相应的限制性酶切位点；(4)通过BamH I/Xho I将GN-UB13插入至基础质粒pY26的GPD启动子-CYCl终止子之间，同时消除此处的多克隆位点，包括限制性酶切位点Xma I、Ava I、Sma I、Pst I、EcoR I、Hind III、Cla I，得到重组质粒 pY26-GN-UBI3 ；(5)通过 Not I/Bgl II 将 MCS-GC 插入至重组质粒 pY26_GN_UBI3 的TEF启动子-ADHl终止子之间，引入的MCS包括限制性酶切位点Not I.EcoR I、Sal I, Sma
I、Ava I、Xma I、Sac II，最终得到目的质粒pYL16。本发明所用基础质粒pY26 (Construction and characterization ofbidirectional expression vectors in Saccharomyces cerevisiae. Federation ofEuropean Microbiological Societies, 2008，8，6-9)。GN 和 GC 的编码序列可通过以含有EGFP基因的质粒作为模版自行克隆得到，这种质粒可以在市场上购买得到，也可以通过人工合成得到。本发明所用含有EGFP基因的质粒pQE60-EGFP来源于本实验室(ZhouJ, Huang L, Liu L, &Chen J(2009)Enhancement of pyruvate productivity by inducibleexpression of a FO Fl-ATPase inhibitor INHl in Torulopsis glabrata CCTCCM202019. J. Biotechnol. 144(2) : 120—126.)。linker 结构通过人工合成得到。本发明通过分别构建融合基因GN-UBI3、MCS-GC,并将其分别插入基础质粒pY26的两组启动子-终止子之间构建得到检测质粒PYL16 (图I)。使用者只需将待研究蛋白质的表达基因插入至MCS即可实现共表达质粒的构建。将其在酿酒酵母中表达并在荧光显微镜下观察，根据荧光产生情况即可判断待研究蛋白质是否受到泛素化修饰。利用该检测系统，可将蛋白质泛素化的检测周期从现有方法的45天左右减少至10天。
图lpY26-GN_UBI3 的质粒图谱。图2为重组质粒pYL16的质粒图谱。图3pYL16-GAPl、pYL16-mGAPl转化子荧光产生情况。
具体实施例方式在本发明的具体实施方式
中，通过将融合基因GN-UBI3插入至基础质粒pY26的多克隆位点中，消除了该多克隆位点中的大部分限制性酶切位点(Xma I.Ava I、Sma I,Pst I、EcoR I、Hind III、Cla I)，同时得到重组质粒pY26_GN_UBI3 (图I)。将融合基因MCS-GC插入至重组质粒pY26-GN-UBI3的TEF启动子-ADHl终止子之间，得到目的质粒pYL16 (图
2)。当需要研究某蛋白质是否受到泛素化调控时，只需要将该蛋白质的编码基因扩增出来，同时其在上下游引入相应的限制性酶切位点，通过酶切将目的基因插入至质粒PYL16，即可完成泛素/待研究蛋白质共表达重组质粒的构建。将共表达重组质粒转化酿酒酵母，经过适当培养后在荧光显微镜下检查是否产生荧光，即可根据产生荧光的情况判断待研究目的蛋白质是否受到泛素化调控。为了简化步骤及提高工作效率，下面的所有序列均可以采用化学全合成的方法获得，其也为本专利要求保护的范围。实施例I质粒PYL16的构建
GN编码基因的PCR扩增体系为
权利要求
1.一种蛋白质泛素化快速检测载体，其特征在于具有两套启动子-终止子序列TEF启动子-ADHl终止子和GPD启动子-CYCl终止子，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。
2.根据权利要求I所述载体，其特征在于TEF启动子-ADHl终止子之间具有多克隆位点MCS-Iinker结构-增强型绿色荧光蛋白EGFP的C端编码序列GC，结构为TEF启动子-MCS-Iinker-GC-ADHl 终止子。
3.根据权利要求I所述载体，其特征在于GPD启动子-CYCl终止子之间具有增强型绿色荧光蛋白EGFP的N端编码序列GN-Iinker结构-泛素编码基因UBI3，结构为GTO启动子-GN-Iinker-UBI3-CYCl 终止子。
4.根据权利要求2或权利要求3所述载体，其特征在于linker结构的氨基酸序列分别如 SEQ ID NO. 2 所示。
5.根据权利要求2所述载体，其特征在于多克隆位点MCS包括限制性酶切位点NotI、EcoR I、Sal I、Sma I、Ava I、Xma I、Sac II，其 DNA 序列如 SEQ ID NO. 3 所示。
6.根据权利要求3所述载体，其特征在于，泛素编码基因UBI3的DNA序列如GENBANKID :850864 所示。
7.权利要求I所述载体的构建方法，其特征在于包括如下步骤(1)利用融合PCR的方法，构建融合基因MCS-Iinker-GC和GN-Iinker-UB13；(2)将质粒pY26-TEF-GPD与融合基因GN-Iinker-UB13共同使用BamHI、Xho I双酶切，胶回收后将酶切片段进行连接，即可将该融合基因插入到GPD启动子-CYCl终止子之间；(3)将步骤⑵所得质粒与融合基因MCS-Iinker-GC共同使用NotI、Bgl II双酶切，胶回收之后将酶切片段进行连接，即可将融合基因MCS-Iinker-GC插入至TEF启动子-ADHl终止子之间；(4)将泛素编码基因UBI3引入到步骤(3)中获得载体的多克隆位点即可用于待研究蛋白编码基因的插入。
8.权利要求I所述载体的应用，其特征在于使用其它基因替代其中的泛素编码基因UBI3，用于其它功能基因或调控基因的研究。
全文摘要
本发明公开了一种蛋白质泛素化快速检测载体及其应用，属于分子生物学领域。该质粒以大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒pY26为基础，可以方便地在大肠杆菌中扩增并在酿酒酵母中进行表达，过分别构建融合基因GN-UBI3、MCS-GC，并将其分别插入基础质粒pY26的两组启动子-终止子之间构建得到检测质粒pYL16。使用者只需将待研究蛋白质的表达基因插入至MCS即可实现共表达质粒的构建。将其在酿酒酵母中表达并在荧光显微镜下观察，根据荧光产生情况即可判断待研究蛋白质是否受到泛素化修饰。利用该检测系统，可将蛋白质泛素化的检测周期从现有方法的45天左右减少至10天。
文档编号C12Q1/68GK102943089SQ20121052832
公开日2013年2月27日 申请日期2012年12月10日 优先权日2012年12月10日
发明者陈坚, 周景文, 吕永坤, 堵国成, 傅建伟, 邹慧君 申请人:江南大学