专利名称：高效分泌表达瘦素的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基因工程细胞株。
背景技术：
肥胖是长期以来困扰人类健康的主要问题之一，特别是随着社会经济的发展，人们生活水平的不断提高，肥胖患者越来越多，而且肥胖会引发高血糖、高血压、高血脂、高血粘、高尿酸、高胰岛素血症、冠心病、脑卒中、下肢静脉曲张、脂肪肝、胆石症、睡眠呼吸暂停症、糖尿病、痛风症及关节炎，是很多疾病的诱因之一。因此合理控制体重是很多肥胖者的
播相
减肥属于以减少人体过度的脂肪、体重为目的的行为方式。指运用药物、饮食、运动、中医经络，心理疗法来达到减少身体脂肪堆积的一种现象，设法纠正肥胖者异常反应造成的不当行为，即用行为科学分析肥胖者摄食行为的特征和运动类型，以此为基础，合理修正导致肥胖的行动。通过饮食和运动减肥都需要漫长的时间，而且需要毅力坚持，很多人都半途而废，导致体重反弹。中医经络减肥给人以恐惧感，很多人望而却步。药物减肥是目前减肥主要形式，被很多人采用。但是化学药剂都存在一定的毒副作用，损伤身体，因此人们比较推崇天然减肥制剂。但由于天然减肥物质种类少，而且含量低，生产周期长，很难满足市场的需求。
发明内容
本发明要解决现有天然减肥物质种类少，含量低，生产周期长，很难满足市场的需求的问题，而提供的一株高效分泌表达瘦素的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株。本发明高效分泌表达瘦素的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株按以下步骤制备—、设计瘦素转基因序列，基因序列如SEQ ID N0:1所不；二、合成瘦素转基因DNA片段Obese’，再导入T载体中；三、目的片段双酶切，用BamHI及EcoR I双酶切消化T载体，反应体系为
0.2pg/pLT 载体20μ
10χ M buffer6p,L
Bamm^L
KcoR I3‘uL
ddH2028μ 酶切反应条件为37°C放置10h，然后将酶切产物用I. 5%琼脂糖凝胶电泳，目的片段用DNA GEL EXTRACTION KIT纯化回收，得到插入片段Obese’ ；四、质粒载体双酶切用BamHI和EcoR I双酶切消化质粒载体pcDNA3. I/V5-His-C，反应体系为
0.2μ&,μ pcDNA3.1/V5-His-C20‘uL
IOx M buffer6μ
BamH\3μ
EcoR I ψL
ddH2028,uL酶切反应条件为37°C放置10h，然后将酶切产物用O. 6%琼脂糖凝胶电泳，再用DNAGEL EXTRACTION KIT纯化回收，得到酶切后的载体pcDNA3. l/V5-His_C ； 五、插入片段Obese’与经过双酶切的载体pcDNA3. l/V5-His_C连接，连接反应体
系为
0.2pg/pL 酶切后载体 pcDNA3.1/V5-His-C3,uL
I Ong/μ L 捕入 J1丨.段 Obese ’13 μ L
ΙΟχ Τ4 DNA 迮接1 : buffer2μ
Τ4 DNA连接酶2μ 连接反应条件为16 °C放置过夜，获得连接产物重组质粒pcDNA3. I/V5-His-C-0bese’ ；六、重组质粒转染CHO :将构建好的重组质粒pcDNA3. 1/V5-His-C_0bese’与质粒pDCHlPll 混合，使用 Lipofeetmine 2000 Reagent 共转染 CHO-dhfr 细胞，在 24 孔板中进行转染，细胞达到95%融合时，将培养基更换为无抗生素、无血清的CHO-S-SFM II，500μ /孔，转染6h后更换含100mL/L FBS、不含HT和NAA的CHO-S-SFM II，继续培养48h，用ELISA试剂盒鉴定阳性转染的细胞按1:10传代，24h细胞贴壁后更换为不含HT和NAA、含G4180. 75mg/L和FBS 100mL/L的选择性培养基，培养14 16d后有阳性克隆形成，然后用定向消化的方法将阳性克隆转入24孔板，又传代至12孔板，经ELISA试剂盒测定对阳性高表达的细胞克隆进行扩大培养；七、MTX的加压培养以MTX加压筛选，浓度依次为2 X l(T8mmol/L、1Χ1(Γ7 mmol/L和5X 1(T7 mmol/L，最终得到能够在5Χ 1(T7 mmol/L的MTX中正常生长的CHO细胞株，即为高效分泌表达瘦素的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株。L印tin是obese基因编码的表达产物，由白色脂肪细胞和胎盘产生的由167个氨基酸组成的分泌蛋白，此蛋白可作为影响能量平衡的传入信号，其功能主要是通过影响能量摄取和支出实现减低体重的作用。本实施方式对obese基因进行了重新的设计获得Obese’基因。Obese’基因由114个喊基组成,编码38个氛基酸的rhLeptin (RecombinantHuman Leptin,人重组瘦素)。本发明中设计的瘦素多肽(rhL印tin)由38个氨基酸组成(SEQ ID N0:2)，在编码瘦素多肽的序列5’端加上Kozak序列和信号肽，然后在序列两端分别加上限制性内切酶BamHI和EcoR I的位点；并根据表达系统选择CH0_dhft_偏爱密码子设计出本发明瘦素转基因序列。本实施方式中瘦素转基因DNA片段的合成由生物工程公司合成，T载体由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。本发明高效分泌表达瘦素的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株可以分泌rhL印tin，rhL印tin具有明显的减肥效果；而且在初始细胞浓度为5X 10_7 mmol/L、产业化细胞培养液(DMEM/F12 (I: I) +14mmol/L柠檬酸铁+0. 8mg/L硫酸锌+0. 3g/L酵母水解物)中培养72h可得到瘦素13mg/L。本发明基因工程细胞株具有高效分泌表达瘦素的优点，可以满足市场的需求。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式高效分泌表达瘦素的中国仓鼠卵巢基因工程 细胞株按以下步骤制备—、设计瘦素转基因序列，基因序列如SEQ ID N0:1所不；二、合成瘦素转基因DNA片段Obese’，再导入T载体中；三、目的片段双酶切，用BamHI及EcoR I双酶切消化T载体，反应体系为
0.2pg/.uL T 载体20μ
10χ M buffer6μ
ΒαηιΗλ3,uL
KcoR I
ddH2028 μ 酶切反应条件为37°C放置10h，然后将酶切产物用I. 5%琼脂糖凝胶电泳，目的片段用DNA GEL EXTRACTION KIT纯化回收，得到插入片段Obese’ ； 四、质粒载体双酶切用BamHI和EcoR I双酶切消化质粒载体pcDNA3. I/V5-His-C，反应体系为
0.2pg./>L pcDNA3. l/V5-His-C20μ
ΙΟχ M buffer6pL
BamHl3μΙ.^
KcoR I3μ
ddH2028μ 酶切反应条件为37°C放置10h，然后将酶切产物用O. 6%琼脂糖凝胶电泳，再用DNAGEL EXTRACTION KIT纯化回收，得到酶切后的载体pcDNA3. l/V5-His_C ；五、插入片段Obese’与经过双酶切的载体pcDNA3. l/V5-His_C连接，连接反应体
系为0.2pg^L 酶切后载体 pcDNA3.1/V5-His-C3pL
I Ong/7μ L -J'由入 J 段 Obese ’1.3 μ L
ΙΟχ Τ4 DNA 迕接1 : buffer2,uL
T4 DNA连接酶2μ 连接反应条件为16 °C放置过夜，获得连接产物重组质粒pcDNA3. I/V5-His-C-0bese’ ；六、重组质粒转染CHO :将构建好的重组质粒pcDNA3. 1/V5-His-C_0bese’与质粒pDCHlPll 混合，使用 Lipofeetmine 2000 Reagent 共转染 CHO-dhfr-细胞，在 24 孔板中进行转染，细胞达到95%融合时，将培养基更换为无抗生素、无血清的CHO-S-SFM II，5 00μ /孔，转染6h后更换含100mL/L FBS、不含HT和NAA的CHO-S-SFM II，继续培养48h，用ELISA试剂盒鉴定阳性转染的细胞按1:10传代，24h细胞贴壁后更换为不含HT和NAA、含G418O. 75mg/L和FBS 100mL/L的选择性培养基，培养14 16d后有阳性克隆形成，然后用定向消化的方法将阳性克隆转入24孔板，又传代至12孔板，经ELISA试剂盒测定对阳性高表达的细胞克隆进行扩大培养；七、MTX的加压培养以MTX加压筛选，浓度依次为2 X 1(T8 mmol/L、I X 1(T7 mmol/L和5X 10_7mmol/L，最终得到能够在5X 10_7 mmol/L的MTX中正常生长的CHO细胞株，即为高效分泌表达瘦素的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株。本实施方式步骤五挑取阳性菌落测序，阳性菌落包含SEQ ID NO :1所示序列，证明本实施方式设计的瘦素转基因DNA片段连接到载体上。本实施方式步骤六中二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞CHO-dhff用含100mL/L胎牛血清、NAA、I XHT的DMEM培养基培养。本实施方式将人工设计的Obese’基因与真核表达质粒pcDNA3. l/V5-His_C重组构建的表达载体pcDNA3. l/V5-His-C-0bese’与含有dhfr基因的质粒pDCHlPll共转染入CH0-dhfr_，ELISA检测到培养上清中重组蛋白的表达，对阳性表达的细胞进行G418筛选，对阳性克隆进行氨甲喋呤(MTX)加压扩增，获得高效分泌表达瘦素的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株。本实施方式步骤六中的选择性培养基为不含HT和NAA、含G418 0. 75mg/L和FBS100mL/L的无血清的CHO-S-SFM II培养基。本实施方式基因工程细胞株rhL印tin蛋白表达水平的ELISA检测将本实施方式高效分泌表达瘦素的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株在初始细胞浓度为5 X Kr7 mmol/L、产业化细胞培养液(01^1作12(1:1)+14臟01/1柠檬酸铁+0· 6mg/L硫酸锌+0. 2g/L酵母水解物)中培养72 h的上清液用ELISA法测定蛋白含量，按说明书进行操作。本实施方式基因工程细胞株rhL印tin表达量为13mg/L。利用本实施方式基因工程细胞株纯化分离rhL印tin的方法将产业化细胞培养液(DMEM/F12 (I: I) +14mmol/L柠檬酸铁+0. 6mg/L硫酸锌+0. 2g/L酵母水解物)中培养的高效分泌表达瘦素的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株的培养液经离心超滤后上柱 Sepharose F. F[18mmol/L, pH7. O PBS], 0. 15mol/L NaCI 洗脱，收集峰值，用 18mmol/L、pH7. I 的 Tris-Cl 缓冲液透析过夜,上柱 Q Sepharose F. F[18mmol/L, ρΗ7· I 的 Tris-Cl]，0. 15mol/L NaCI 洗脱，收集峰值产物上柱 Superdex75 [ρΗ7· I 的Tris-Cl, 100mmol/L NaCI],收集峰值产物即得到 rhLeptin。rhLeptin 纯度达 99. 8% 以上。本实施方式基因工程细胞株RT-PCR鉴定收集本实施方式高效分泌表达瘦素的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株细胞，以Trizol进行总RNA提取，逆转后以引物Pl和引物P2为引物进行PCR扩增。PCR反应条件为95°C预变性 5 min ；94°C 30 s,50°C 30 s，72°C 30 s，共 30 个循环；再 72°C最终延伸5min。引物Pl序列如SEQ ID NO 3所示，引物P2序列如SEQ ID NO 4所示·未转染pcDNA3. 1/V5-His-C_0bese’的CHO细胞进行扩增后无条带。由于CHO细 胞自身并无瘦素mRNA形式存在，所以未转染细胞无相应片段被扩增。而本实施方式基因工程细胞株稳定的扩增出168bp的设计DNA片段，表明目的片段已完整的整合到CHO细胞中，有目的基因的转录。本实施方式基因工程细胞株培养基上清液中分离得到的瘦素的体重调节实验将雌性ob/ob小鼠40只，以10只为一组，共分为4组。分别注射媒介物(0. 7%生理盐水)、rhLeptin、Leptin (天然瘦素，obese基因编码表达产物)和L-肉碱,每天lmg、持续28天，每天记录小鼠的体重，实验结果如表I所示。本实施方式融合蛋白体重调节效果最为明显。表I
权利要求
1.高效分泌表达瘦素的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株，其特征在于高效分泌表达瘦素的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株按以下步骤制备 一、设计瘦素转基因序列，基因序列如SEQID NO I所不； 二、合成瘦素转基因DNA片段Obese’，再导入T载体中； 三、目的片段双酶切，用BamHI及EcoRI双酶切消化T载体，反应体系为 .0.2pg^L T 载体20μL IOx M buffer6pL Bamm3,uLEcoR I3μddH2028 ,uL 酶切反应条件为37°C放置10h，然后将酶切产物用I. 5%琼脂糖凝胶电泳，目的片段用DNA GEL EXTRACTION KIT纯化回收，得到插入片段Obese’ ； 四、质粒载体双酶切用BamHI和EcoRI双酶切消化质粒载体pcDNA3. l/V5-His_C，反应体系为 . 0.2pg/.UL pcDNA3.1/V5-His-C20μ.10χ M buffer6μ BamHl3μ KcoR I3μ ddH202SμL 酶切反应条件为37°C放置10h，然后将酶切产物用O. 6%琼脂糖凝胶电泳，再用DNA GELEXTRACTION KIT纯化回收，得到酶切后的载体pcDNA3. l/V5-His_C ； 五、插入片段Obese’与经过双酶切的载体pcDNA3.l/V5-His_C连接，连接反应体系为 .0.2μ§/μ 酶切后载体 pcDNA3.1/V5-His-C3μ I Ong/μ 捕入 JI 段 Obese ’13 μ LΙΟχ Τ4 DNA 选接喻 buffer2μΙ Τ4 DNA连接酶2.uL 连接反应条件为16°C放置过夜，获得连接产物重组质粒pcDNA3. l/V5-His-C-0bese’ ； 六、重组质粒转染CHO:将构建好的重组质粒pcDNA3.1/V5-His-C_0bese’与质粒pDCHlPll 混合，使用 Lipofeetmine 2000 Reagent 共转染 CHO-dhff 细胞，在 24 孔板中进行转染，细胞达到95%融合时，将培养基更换为无抗生素、无血清的CHO-S-SFM II，500μ /孔，转染6h后更换含100mL/L FBS、不含HT和NAA的CHO-S-SFM II，继续培养48h，用ELISA试剂盒鉴定阳性转染的细胞按1:10传代，24h细胞贴壁后更换为不含HT和NAA、含G418.O.75mg/L和FBS 100mL/L的选择性培养基，培养14 16d后有阳性克隆形成，然后用定向消化的方法将阳性克隆转入24孔板，又传代至12孔板，经ELISA试剂盒测定对阳性高表达的细胞克隆进行扩大培养； 七、MTX的加压培养以MTX加压筛选，浓度依次为2X 1(T8 mmol/L、I X 1(T7 mmol/L和.5 X ΙΟ—7 mmol/L，最终得到能够在5Χ 10_7 mmol/L的MTX中正常生长的CHO细胞株，即为高效分泌表达瘦素的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株。
全文摘要
高效分泌表达瘦素的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株，它涉及一种基因工程细胞株。解决现有转基因工程菌株瘦素分泌表达量低，且需要在发酵上清液中加入β-巯基乙醇再透析过夜，导致成本高，生产周期长，风险增加，不适合工业化大规模生产的问题。将人工设计的Obese’基因与真核表达质粒pcDNA3.1/V5-His-C重组构建的表达载体pcDNA3.1/V5-His-C-Obese’与含有dhfr基因的质粒pDCH1P11共转染入CHO-dhfr-，获得高效分泌表达瘦素的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株。本发明可用于医药领域。
文档编号C12N5/10GK102965342SQ20121053487
公开日2013年3月13日 申请日期2012年12月12日 优先权日2012年12月12日
发明者余琼 申请人:黑龙江大学